大肠癌中c-erbB-2基因扩增的研究
大肠癌中c-erbB-2基因扩增的研究
北京军区总医院普外科(100700)骆成玉 李世拥
北京医科大学人民医院 祝学光 王申五
提 要：应用差异PCR技术研究了大肠癌c-erbB-2基因的坟增情况。结果发现，大肠癌组织中c-erbB-2基因存在明显扩增，该基因的扩增与大肠癌组织学分级、远处转移之间均有非常显著的关联。随着大肠癌组织学分级程度加重，c-erbB-2基因扩增逐渐向高、低拷贝转移，说明：c-erbB-2基因扩增在一定程度上反映着大肠癌分化状态和生物学行为，可作为大肠癌患者预后的重要参数，并可指导临床治疗。
关键词：大肠肿瘤；基因扩增；c-erbB-2基因；肛肠病
, 百拇医药
恶性肿瘤细胞可能通过正常细胞基因的扩增或过度表达而获得选择性生长优势，c-erbB-2则是这类基因中的一个典型例子[1]。因此，了解肿瘤中c-erbB-2基因扩增情况有可能作为肿瘤预后的另一分子指标而用地临床。本文应用差异聚合酶链反应(差异PCR)技术研究了该基因在人大肠癌中的扩增，并利用自身正常大肠粘膜作为对照。
1 资料与方法
1.1 临床资料 36例大肠癌组织标本取自本院外科1994年5月到住院手术治疗的大肠癌患者，均经病理证实。男女各18例；年龄31～81岁，平均57.4岁。取其中20例自身正常大肠粘膜(距肿瘤边缘大于10cm处)作对照。标本置液氮保存备用。
1.2 方法
1.2.1 组织基因组DNA提取[2]：按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA，TE溶解，测OD260和OD280值定量，4℃存放备用。
, 百拇医药
1.2.2 引物合成
1.2.2.1 c-erbB-2引物：参照文献报道的引物序列[2]，由军事医学科学院生物工程研究所合成，扩增片段长度98bp。引物序列为：
上游引物：5’-CCTCTGACGTCCATCATCTA-3’
下游引物：5’-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3’
1.2.2.2 内参对照β-actin引物：参照文献报道的序列[3]，由北京医科大学人民医院分子生物室合成，扩增片段长度318bp。引物序列为：
上游引物：
5’-ATCATGTTTGGGACCTTCAACA-3’
, 百拇医药
下游引物：
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’
1.2.3 差异PCR：按改良Gramlich方法[1]在美国Idaho1605型气浴PCR仪进行，其中以β-actin为内参照物。反应体系10μl，变性：94℃，7s，退炎：55℃，8s，延伸：70℃，20s。扩增30个循环。取4μlPCR产物行2%琼脂糖凝胶电脉鉴定。继取5μl产品PCR产物行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳100V1～2h，卸胶，EB染色5～15min，紫外灯下观察照相记录。光密度仪扫描得每条色带的积分光密度值(IOD值)，求c-erbB-2带与β-actin带的比值，以此比值代表各个样品c-erbB-2DNA扩增水平。按Gramlich,Slamon[1,4]等的方法，将c-erbB-2，β-actin比值小于1.5、大于或等于1.5而小于3和大于或等3情况，分别定为c-erbB-2的单拷贝、低拷贝和高拷贝扩增。
, 百拇医药
1.2.4 统计学分析：t检验或Fisher检验。
2 结果
2.1 大肠癌及正常大肠粘膜中c-erbB-2基因的差异PCR结果 见图1。
图1 c-erbB-2基因的差异PCR结果
2.2 大肠癌与正常大肠粘膜中c-erbB-2基因扩增的比较 见表1。
表1 大肠癌与正常大肠粘膜中c-erbB-2扩增比较
标本
例数
x±s
正常大肠粘膜
, http://www.100md.com
20
0.94±0.25
大肠癌
36
2.49±0.95*
*P<0.001
从上表知，大肠癌组织中c-erbB-2基因存在明显扩增。
2.3 大肠癌中c-erbB-2基因扩增与临床病理的关系 见表2。
表2 大肠癌中c-erbB-2扩增与临床病理的关系
临床资料
单拷贝
, http://www.100md.com
低拷贝
高拷贝
合计
P值
患者性别
女
2
9
7
18
男
1
13
4
, 百拇医药
18
患者年龄(岁)
<50
1
6
3
10
≥50
2
16
8
26
肿瘤位置
近端
, 百拇医药
-
7
4
11
远端
3
15
7
25
肿瘤大小(cm)
<5
2
10
2
, 百拇医药
14
≥5
1
12
9
22
Dukes
A
1
2
3
B
2
12
, http://www.100md.com
4
18
C
-
7
3
10
D
-
1
4
5
组织学分级
0.01
高分化
3
7
10
中分化
-
13
8
21
低分化
-
2
3
5
, 百拇医药
淋巴结转移
无
3
14
4
21
有
-
8
7
15
远处转移
0.01
, 百拇医药 无
3
21
7
31
有
-
1
4
5
血清CEA水平
<15ng/ml※
2
19
, 百拇医药
7
28
≥ng/ml
1
3
4
8
※本院正常值
从表2知，c-erbB-2基因扩增与大肠癌组织学分级、远处转移之间均有非常显著的关联(0.01
3 讨论
原癌基因c-erbB-2(又称neu、HER-2基因)定位于第17号染色体q21上，编码分子量为185kD的酪氨酸激酶蛋白，其结构与表皮生长因子受体蛋白的氨基酸排列顺序具有50%左右的同源性，鉴于二者均具有相同的蛋白激酶活性，因此，它们在控制细胞分裂及分化中起着重要的作用[5]。动物实验表明，小鼠肿瘤形成时，c-erbB-2基因主要通过该蛋白跨膜部分的点突变而被激活。但在人类细胞中c-erbB-2的活化主要表现为该基因的扩增或其扩增产物的过度表达[6]。
, 百拇医药
乳腺癌、胃癌、膀胱癌及卵巢癌等实体性肿瘤中可见该基因扩增，并与复发、生存期及预后因素相关[7]。尤其对乳腺癌报道最多，但结果很不一致，究其研究方法多采用Southern印迹杂交或免疫组化。杂交法需较多量新鲜组织提取足够量、较纯化的高分子量基因组DNA(一次杂交至少10～20μg)，因此不适用于对常规病理标本的研究；免疫组化法检测组织切片上的基因表达产物取决抗体的类型、特异性及亲和力[8，9]。本文采取差异PCR技术：①无需新鲜组织；②对DNA质量要求不高，不需十分完整的基因组大片段DNA，也不需太高的纯度；③对模板DNA量需要极少，一次仅50～100ng；④针对检测基因cDNA序列设计引物，扩增特异、准确；⑤结果直观清晰，无杂交及免疫组化背景干扰，不必接触同位素，步骤简便、快捷，重复性好。因而差异PCR不失为一种观察基因扩增的良好方法。
本组36例大肠癌中c-erbB-2基因扩增程度明显高于正常大肠粘膜。大肠癌中随着癌组织学分级程度的加重，c-erbB-2基因扩增逐渐向低、高拷贝转移。组织学分级越低，该基因扩增越强。说明，c-erbB-2基因扩增在一定程度上反映着大肠癌分化状态和生物学行为；大肠癌的恶性转化有赖于c-erbB-2基因活化或有c-erbB-2基因活化的参与。
另外，本研究还发现，有远处转移者c-erbB-2基因扩增明显强于无远处转移者，且远处转移者5例中1例表现为该基因低拷贝扩增，余4例者呈现高拷贝扩增。因而提示，c-erbB-2基因扩增与大肠癌远处转移相关联，c-erbB-2基因明显扩增的大肠癌有更强的侵袭和转移能力，反映了大肠癌患者不良预后，说明大肠癌中c-erbB-2基因扩增可作为大肠癌患者预后的重要参数，并可指导临床治疗，具有重要的临床意义。
参考文献(略), http://www.100md.com
北京军区总医院普外科(100700)骆成玉 李世拥
北京医科大学人民医院 祝学光 王申五
提 要：应用差异PCR技术研究了大肠癌c-erbB-2基因的坟增情况。结果发现，大肠癌组织中c-erbB-2基因存在明显扩增，该基因的扩增与大肠癌组织学分级、远处转移之间均有非常显著的关联。随着大肠癌组织学分级程度加重，c-erbB-2基因扩增逐渐向高、低拷贝转移，说明：c-erbB-2基因扩增在一定程度上反映着大肠癌分化状态和生物学行为，可作为大肠癌患者预后的重要参数，并可指导临床治疗。
关键词：大肠肿瘤；基因扩增；c-erbB-2基因；肛肠病
, 百拇医药
恶性肿瘤细胞可能通过正常细胞基因的扩增或过度表达而获得选择性生长优势，c-erbB-2则是这类基因中的一个典型例子[1]。因此，了解肿瘤中c-erbB-2基因扩增情况有可能作为肿瘤预后的另一分子指标而用地临床。本文应用差异聚合酶链反应(差异PCR)技术研究了该基因在人大肠癌中的扩增，并利用自身正常大肠粘膜作为对照。
1 资料与方法
1.1 临床资料 36例大肠癌组织标本取自本院外科1994年5月到住院手术治疗的大肠癌患者，均经病理证实。男女各18例；年龄31～81岁，平均57.4岁。取其中20例自身正常大肠粘膜(距肿瘤边缘大于10cm处)作对照。标本置液氮保存备用。
1.2 方法
1.2.1 组织基因组DNA提取[2]：按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA，TE溶解，测OD260和OD280值定量，4℃存放备用。
, 百拇医药
1.2.2 引物合成
1.2.2.1 c-erbB-2引物：参照文献报道的引物序列[2]，由军事医学科学院生物工程研究所合成，扩增片段长度98bp。引物序列为：
上游引物：5’-CCTCTGACGTCCATCATCTA-3’
下游引物：5’-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3’
1.2.2.2 内参对照β-actin引物：参照文献报道的序列[3]，由北京医科大学人民医院分子生物室合成，扩增片段长度318bp。引物序列为：
上游引物：
5’-ATCATGTTTGGGACCTTCAACA-3’
, 百拇医药
下游引物：
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’
1.2.3 差异PCR：按改良Gramlich方法[1]在美国Idaho1605型气浴PCR仪进行，其中以β-actin为内参照物。反应体系10μl，变性：94℃，7s，退炎：55℃，8s，延伸：70℃，20s。扩增30个循环。取4μlPCR产物行2%琼脂糖凝胶电脉鉴定。继取5μl产品PCR产物行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳100V1～2h，卸胶，EB染色5～15min，紫外灯下观察照相记录。光密度仪扫描得每条色带的积分光密度值(IOD值)，求c-erbB-2带与β-actin带的比值，以此比值代表各个样品c-erbB-2DNA扩增水平。按Gramlich,Slamon[1,4]等的方法，将c-erbB-2，β-actin比值小于1.5、大于或等于1.5而小于3和大于或等3情况，分别定为c-erbB-2的单拷贝、低拷贝和高拷贝扩增。
, 百拇医药
1.2.4 统计学分析：t检验或Fisher检验。
2 结果
2.1 大肠癌及正常大肠粘膜中c-erbB-2基因的差异PCR结果 见图1。
图1 c-erbB-2基因的差异PCR结果
2.2 大肠癌与正常大肠粘膜中c-erbB-2基因扩增的比较 见表1。
表1 大肠癌与正常大肠粘膜中c-erbB-2扩增比较
标本
例数
x±s
正常大肠粘膜
, http://www.100md.com
20
0.94±0.25
大肠癌
36
2.49±0.95*
*P<0.001
从上表知，大肠癌组织中c-erbB-2基因存在明显扩增。
2.3 大肠癌中c-erbB-2基因扩增与临床病理的关系 见表2。
表2 大肠癌中c-erbB-2扩增与临床病理的关系
临床资料
单拷贝
, http://www.100md.com
低拷贝
高拷贝
合计
P值
患者性别
女
2
9
7
18
男
1
13
4
, 百拇医药
18
患者年龄(岁)
<50
1
6
3
10
≥50
2
16
8
26
肿瘤位置
近端
, 百拇医药
-
7
4
11
远端
3
15
7
25
肿瘤大小(cm)
<5
2
10
2
, 百拇医药
14
≥5
1
12
9
22
Dukes
A
1
2
3
B
2
12
, http://www.100md.com
4
18
C
-
7
3
10
D
-
1
4
5
组织学分级
0.01
高分化
3
7
10
中分化
-
13
8
21
低分化
-
2
3
5
, 百拇医药
淋巴结转移
无
3
14
4
21
有
-
8
7
15
远处转移
0.01
, 百拇医药 无
3
21
7
31
有
-
1
4
5
血清CEA水平
<15ng/ml※
2
19
, 百拇医药
7
28
≥ng/ml
1
3
4
8
※本院正常值
从表2知，c-erbB-2基因扩增与大肠癌组织学分级、远处转移之间均有非常显著的关联(0.01
3 讨论
原癌基因c-erbB-2(又称neu、HER-2基因)定位于第17号染色体q21上，编码分子量为185kD的酪氨酸激酶蛋白，其结构与表皮生长因子受体蛋白的氨基酸排列顺序具有50%左右的同源性，鉴于二者均具有相同的蛋白激酶活性，因此，它们在控制细胞分裂及分化中起着重要的作用[5]。动物实验表明，小鼠肿瘤形成时，c-erbB-2基因主要通过该蛋白跨膜部分的点突变而被激活。但在人类细胞中c-erbB-2的活化主要表现为该基因的扩增或其扩增产物的过度表达[6]。
, 百拇医药
乳腺癌、胃癌、膀胱癌及卵巢癌等实体性肿瘤中可见该基因扩增，并与复发、生存期及预后因素相关[7]。尤其对乳腺癌报道最多，但结果很不一致，究其研究方法多采用Southern印迹杂交或免疫组化。杂交法需较多量新鲜组织提取足够量、较纯化的高分子量基因组DNA(一次杂交至少10～20μg)，因此不适用于对常规病理标本的研究；免疫组化法检测组织切片上的基因表达产物取决抗体的类型、特异性及亲和力[8，9]。本文采取差异PCR技术：①无需新鲜组织；②对DNA质量要求不高，不需十分完整的基因组大片段DNA，也不需太高的纯度；③对模板DNA量需要极少，一次仅50～100ng；④针对检测基因cDNA序列设计引物，扩增特异、准确；⑤结果直观清晰，无杂交及免疫组化背景干扰，不必接触同位素，步骤简便、快捷，重复性好。因而差异PCR不失为一种观察基因扩增的良好方法。
本组36例大肠癌中c-erbB-2基因扩增程度明显高于正常大肠粘膜。大肠癌中随着癌组织学分级程度的加重，c-erbB-2基因扩增逐渐向低、高拷贝转移。组织学分级越低，该基因扩增越强。说明，c-erbB-2基因扩增在一定程度上反映着大肠癌分化状态和生物学行为；大肠癌的恶性转化有赖于c-erbB-2基因活化或有c-erbB-2基因活化的参与。
另外，本研究还发现，有远处转移者c-erbB-2基因扩增明显强于无远处转移者，且远处转移者5例中1例表现为该基因低拷贝扩增，余4例者呈现高拷贝扩增。因而提示，c-erbB-2基因扩增与大肠癌远处转移相关联，c-erbB-2基因明显扩增的大肠癌有更强的侵袭和转移能力，反映了大肠癌患者不良预后，说明大肠癌中c-erbB-2基因扩增可作为大肠癌患者预后的重要参数，并可指导临床治疗，具有重要的临床意义。
参考文献(略), http://www.100md.com