大肠癌的基因诊断
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中国肛肠病杂志 2001年第21卷第4期
大肠癌的基因诊断
江苏省肿瘤医院(江苏 南京 210009) 王金华
审校 毛忠琦 徐乃元
关键词：大肠癌；癌基因；抑癌基因；基因诊断；肛肠病
随着肿瘤分子生物学的研究进展，已发现多种基因及染色体异常(突变、扩增、过度表现及缺失等)与大肠癌的发生、发展密切相关，通过对这些异常因或染色体的检测，可以帮助早期诊断大肠癌并尽早进行治疗。
1 大肠癌的相关基因及改变
大肠癌的发生过程中涉及多个基因和染色体的异常改变，其中既存在细胞原癌基因的激活如ras、myc等，又有抑癌基因APC、DCC、MCC、P53等失活；既涉及遗传性(胚系)突变，也存在体细胞突变，同时大肠癌的发生又是多基因突变共同作用的结果。从某种意义讲，大肠癌是一种基因突变所致的基因病。
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1.1 ras基因 ras基因是最早被确定的癌基因，其家族包括H-ras，K-ras和N-ras，属于细胞内信号传导蛋白类原癌基因，其基因编码产物P21结构上类似于控制腺苷酸环化酶活性的GN蛋白，可与GDP，GTP结合并有GTP酶活性。当ras基因发生点突变而活化时，P21蛋白可为细胞生长传递持续性促有丝分裂信号，导致细胞不断增殖，从而诱发肿瘤的发生。
ras基因常常是特定部位(12、13、61位密码子)突变而活化，其中以12号密码子最常见，13位次之，有报道约85%以上突变为Ki-ras第12或13位密码子点突变。约50%的大肠癌及大于1cm的腺瘤中存在突变，而小于1cm的腺瘤中突变率低于10%。Vogestein等报道在早期腺瘤为7%，中期腺瘤为57%，并认为ras基因突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤转变阶段，可能是大肠腺恶变的始动基因。
1.2 myc基因 该基因定位于染色体8号长臂(8q24)上，约4kb，属核转录因子类原癌基因，其编码的蛋白质在核内结合于DNA链上，对转录过程实施调控。myc诱导化的形式为基因的大量扩增。myc的扩增不但能与其它基因如ras于大肠癌的发生早期起协调作用，而且多见于恶性程度高、预后差的肿瘤。约2/3大肠癌myc mRNA表达较正常粘膜高3～24倍，约2/3的腺瘤表达增加。
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1.3 APC基因 APC(adenomatous ployposis coli)基因是一个肿瘤抑制基因，定位于5号染色体长臂(5q21～22)上，其结构包括15个外显子和14个内含子，编码含2843个氨基酸残基的蛋白，该蛋白具有GTP酶样活性。正常的APC基因为野生型，变异者称为突变体。APC基因突变是空族性结肠腺瘤样息肉病(FAP)的根本原因[1]，亦常见于散发性大肠癌。其突变率为25%～60%，且发生在早期腺瘤阶段，约65%以上突变集中于其第15号外显子5’末端的一个较小区域，该区域被命名为突变集区(mutant cluster region，MCR)。恶性肿瘤中常见的APC基因突变是碱基置换和移码。
1.4 DCC基因 DCC(deleted in colorectal carcinoma)基因是一种抑癌基因，定位于18号染色体长臂(18q21.3)上。其编码产物为190kD的跨膜蛋白，参与细胞和细胞间或细胞和基质间的相互作用。在70%以上的大肠癌中可检测出DCC基因发生一个等位基因缺失，晚期腺瘤中约为50%，而早期腺瘤少见。Fearon等[2]研究表明在73%的大肠癌中检测出DCC基因变异，进展期腺瘤中为47%，而中、小腺瘤中低于10%。
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1.5 MCC基因 MCC基因于1991年由Vogestein等在染色体5q21上克隆出，属于抑癌基因，编码的蛋白是一种含829个氨基酸残基的G蛋白。经对MCC基因序列分析，该基因在大肠癌中除了重组突变外，还存在单个核苷酸替代(点突变)造成的错义突变和拼接位点突变等。实验发现MCC失活出现于大肠癌的早期。
1.6 P53基因 P53基因和多种恶性肿瘤的发生存在密切关系。该基因位于17号染色体短壁(17p31.1)上，由11个外显子组成，在DNA水平上约由16～20kb组成，其编码是一种核磷蛋白P53，该蛋白可能通过调节DNA转录而发挥作用，高水平的野生型P53蛋白可以发现细胞分化过程中的DNA损伤，通过启动修复系统，并予以足够时间进行DNA修复；若失败，则P53通过诱导细胞凋亡来触发细胞死亡，阻止具有癌变倾向的基因突变细胞的产生。P53蛋白缺失或突变可导致异常的基因表达，进而使细胞无限制生长。Votelstein等[3]报道75%大肠癌中存在P53基因的异常，其变异位点发生于相对保守的第5～8个外显子上，而这种改变多发生于大肠癌的较晚阶段，少见于任何阶段的腺瘤。
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1.7 其它一些相关基因 CD44基因是一种指导编码合成一族可被CD44单克隆抗体所识别的CD44糖蛋白，该蛋白具有导向性受体、参与信号传递等多种功能，CD44基因位于第11号染色体短臂上，至少由19个外显子组合而成。DNA错配修复基因hMLH1和hMSH2是一组和遗传性非息肉性大肠癌(hereditany nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)密切相关的基因，对维持DNA准确复制有关。c-erbB-2基因是与细胞生长调节密切相关的基因，大肠癌中该基因表达增强。其它还有RB、nm-23、P16等基因。
2 大肠癌的基因诊断
大肠癌的发生过程中每一种基因突变的发生具有相对定时性，染色体5q(APC、MCC基因)上等位基因的丢失最早发生，随之出现DNA低甲基化及ras基因突变，而染色体17p(P53)和18q上等位基因丢失主要(75%～85%)发生在大肠肿瘤的后期阶段，这种相对定时性反映了大肠癌发生过程的步骤性，这是临床大肠癌基因诊断及治疗的机理。另一方面，各种敏感性高、特异性强、操作方便以及经济的检测方法的出现使基因诊断的临床应用变为现实。随着分子生物学的研究进展，基因诊断将成为早期诊断大肠癌的一种有效手段。
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大肠癌的发生、发展过程中涉及多肿基因的改变，且具有相对定时性，通过对这些分子改变及时间顺序建立有效的检测方法，确诊大肠粘膜上皮变异或大肠原位癌PCR技术可以从极少组织甚至单个细胞中去扩增特异性DNA。PCR扩增的序列可用以下方法进行分析：(1)放射性核素标记的寡核苷酸探针杂交法；(2)用突变产生的新的限制性酶位点识别法；(3)单链构像的多态性分析；(4)直接核苷酸序列的测定。这些方法结合PCR技术可以从粪便、血液、肠液标本或大肠组织中检测出基因的异常，为高危人群提供一种可能的早期诊断和筛查手段。
myc基因是原癌基因，较其它突变基因发生早且与之起协同作用，多数肿瘤中有高表达。吴正祥等应用原位分子杂交(ISH)对不同大肠组织细胞内myc基因表达进行检测发现：83%(20/24)的大肠癌中myc基因过度表达，在重度不典型增生病例中明显增高，而伴有恶变的病变中表达最高，这些提示myc可作为肿瘤诊断基因，对确定早期诊断有帮助。
Sidranshy等1992年报告从9例患者粪便中提取DNA进行PCR扩增，经Southem Blot检测出ras基因变异。Zhu等[4]对远离肿瘤的组织学上正常的粘膜组织进行ras基因检测，发现远离肿瘤组织的肠粘膜及正常人肠粘膜组织中无ras基因第12密码子突变，而10例腺瘤中发生12密码子突变9例，邻近肿瘤的肠粘膜组织中ras基因第12密码子突变率为53.8%，作者认为可以将ras基因突变作为早期检出大肠癌的生物学标记。Villa等[5]对103例结肠镜检查有异常发现者行粪便ras基因检测，结果发现K-ras基因突变为29.1%，并认为可以将粪便K-ras基因检测作为早期大肠癌普查的方法。Ratto等[6]应用PCR和限制性内切酶技术检测了25例大肠腺癌的ras基因突变发现有15例肿瘤组织有12、13个密码子突变，而15例中14例粪便中检测到ras基因突变，并应用11例正常人粪便，3例肠道良性病变作了对照后认为该方法可早期诊断大肠癌。这些研究表明，ras基因突变是大肠癌的一种有临床意义的生化指标，从大肠癌患者标本中检测出ras突变这一事实，可认为该方法在大肠癌的诊断中可作为细胞学的一种重要辅助手段。这些方法的临床应用对某些大肠癌病人无疑具有早期诊断价值，并能避免应用某些创伤性诊断技术，这些方法的限制在于非特异性扩增、假阳性突变和仅50%的患者有活化的ras基因。
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绝大多数大肠癌中可检出P53突变。1993年，Mas等[7]报告从7例患者粪便中提取DNA经PCR扩增后进行测序分析检测出P53基因第4外显子变异，此发现曾被誉为21世纪大肠肿瘤筛检的方向。Hirota等[8]对565例早期大肠癌作了P53突变检测发现，隆起型粘膜下突变率分别为67.9%和64.1%，凹陷型粘膜内和粘膜下癌分别为23.8%和73.3%。Kenji等[9]通过对肿瘤组织及血清中突变的P53、K-ras基因的检测，认为通过对这两个突变基因的检测有助于对大肠癌临床筛查及诊断后随访工作。这些研究表明检测粪便、血清及肿瘤组织中P53基因突变有助于早期诊断大肠癌。
此外，Mastsamura等[10]研究表明，应用RT-PCR/分子杂交技术可检测出微小标本中CD44基因的异常，即使外周血中每毫升含有10个恶变的细胞也能通过该方法检测出异常表达的CD44基因条带。Wong等[11]应用RT-PCRSouthern Blotting法在24例结直肠癌患者外周血中4例检测出CD44基因表达，作者认为外周血中该基因的检测有助于早期诊断及预后的估计。对于家族性大肠癌的诊断中，APC的检测国内外有较多报道，而近期对应用hMLH1和hMLH2来诊断HNPPC的报道也较多[12，13]。
1991年Vogelstien和Fearon总结了本人及其他学者的研究成果，从分子病理学研究角度出发提出大肠癌演变具有一整套变异模式，为大肠癌的基因诊断和基因治疗提供了理论依据。该模式提示应用分子生物学方法早期诊断大肠肿瘤将成为可能，然而大肠癌基因变异的研究还存在诸多不足，大肠癌的基因诊断的临床研究还处于起步阶段，大肠癌的相关分子生物学有待进一步深入研究，以期能在大肠癌的早期诊断上有所突破。
基因诊断作为一种新型的诊断手术，随着分子生物学的不断进展，尤其是肿瘤分子生物学的进展和各种检测方法的不断更新，正逐步应用于临床，但这需要开展大量的研究，制定出一套简便、经济、适用的常规检测基因诊断方法。, 百拇医药
江苏省肿瘤医院(江苏 南京 210009) 王金华
审校 毛忠琦 徐乃元
关键词：大肠癌；癌基因；抑癌基因；基因诊断；肛肠病
随着肿瘤分子生物学的研究进展，已发现多种基因及染色体异常(突变、扩增、过度表现及缺失等)与大肠癌的发生、发展密切相关，通过对这些异常因或染色体的检测，可以帮助早期诊断大肠癌并尽早进行治疗。
1 大肠癌的相关基因及改变
大肠癌的发生过程中涉及多个基因和染色体的异常改变，其中既存在细胞原癌基因的激活如ras、myc等，又有抑癌基因APC、DCC、MCC、P53等失活；既涉及遗传性(胚系)突变，也存在体细胞突变，同时大肠癌的发生又是多基因突变共同作用的结果。从某种意义讲，大肠癌是一种基因突变所致的基因病。
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1.1 ras基因 ras基因是最早被确定的癌基因，其家族包括H-ras，K-ras和N-ras，属于细胞内信号传导蛋白类原癌基因，其基因编码产物P21结构上类似于控制腺苷酸环化酶活性的GN蛋白，可与GDP，GTP结合并有GTP酶活性。当ras基因发生点突变而活化时，P21蛋白可为细胞生长传递持续性促有丝分裂信号，导致细胞不断增殖，从而诱发肿瘤的发生。
ras基因常常是特定部位(12、13、61位密码子)突变而活化，其中以12号密码子最常见，13位次之，有报道约85%以上突变为Ki-ras第12或13位密码子点突变。约50%的大肠癌及大于1cm的腺瘤中存在突变，而小于1cm的腺瘤中突变率低于10%。Vogestein等报道在早期腺瘤为7%，中期腺瘤为57%，并认为ras基因突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤转变阶段，可能是大肠腺恶变的始动基因。
1.2 myc基因 该基因定位于染色体8号长臂(8q24)上，约4kb，属核转录因子类原癌基因，其编码的蛋白质在核内结合于DNA链上，对转录过程实施调控。myc诱导化的形式为基因的大量扩增。myc的扩增不但能与其它基因如ras于大肠癌的发生早期起协调作用，而且多见于恶性程度高、预后差的肿瘤。约2/3大肠癌myc mRNA表达较正常粘膜高3～24倍，约2/3的腺瘤表达增加。
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1.3 APC基因 APC(adenomatous ployposis coli)基因是一个肿瘤抑制基因，定位于5号染色体长臂(5q21～22)上，其结构包括15个外显子和14个内含子，编码含2843个氨基酸残基的蛋白，该蛋白具有GTP酶样活性。正常的APC基因为野生型，变异者称为突变体。APC基因突变是空族性结肠腺瘤样息肉病(FAP)的根本原因[1]，亦常见于散发性大肠癌。其突变率为25%～60%，且发生在早期腺瘤阶段，约65%以上突变集中于其第15号外显子5’末端的一个较小区域，该区域被命名为突变集区(mutant cluster region，MCR)。恶性肿瘤中常见的APC基因突变是碱基置换和移码。
1.4 DCC基因 DCC(deleted in colorectal carcinoma)基因是一种抑癌基因，定位于18号染色体长臂(18q21.3)上。其编码产物为190kD的跨膜蛋白，参与细胞和细胞间或细胞和基质间的相互作用。在70%以上的大肠癌中可检测出DCC基因发生一个等位基因缺失，晚期腺瘤中约为50%，而早期腺瘤少见。Fearon等[2]研究表明在73%的大肠癌中检测出DCC基因变异，进展期腺瘤中为47%，而中、小腺瘤中低于10%。
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1.5 MCC基因 MCC基因于1991年由Vogestein等在染色体5q21上克隆出，属于抑癌基因，编码的蛋白是一种含829个氨基酸残基的G蛋白。经对MCC基因序列分析，该基因在大肠癌中除了重组突变外，还存在单个核苷酸替代(点突变)造成的错义突变和拼接位点突变等。实验发现MCC失活出现于大肠癌的早期。
1.6 P53基因 P53基因和多种恶性肿瘤的发生存在密切关系。该基因位于17号染色体短壁(17p31.1)上，由11个外显子组成，在DNA水平上约由16～20kb组成，其编码是一种核磷蛋白P53，该蛋白可能通过调节DNA转录而发挥作用，高水平的野生型P53蛋白可以发现细胞分化过程中的DNA损伤，通过启动修复系统，并予以足够时间进行DNA修复；若失败，则P53通过诱导细胞凋亡来触发细胞死亡，阻止具有癌变倾向的基因突变细胞的产生。P53蛋白缺失或突变可导致异常的基因表达，进而使细胞无限制生长。Votelstein等[3]报道75%大肠癌中存在P53基因的异常，其变异位点发生于相对保守的第5～8个外显子上，而这种改变多发生于大肠癌的较晚阶段，少见于任何阶段的腺瘤。
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1.7 其它一些相关基因 CD44基因是一种指导编码合成一族可被CD44单克隆抗体所识别的CD44糖蛋白，该蛋白具有导向性受体、参与信号传递等多种功能，CD44基因位于第11号染色体短臂上，至少由19个外显子组合而成。DNA错配修复基因hMLH1和hMSH2是一组和遗传性非息肉性大肠癌(hereditany nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)密切相关的基因，对维持DNA准确复制有关。c-erbB-2基因是与细胞生长调节密切相关的基因，大肠癌中该基因表达增强。其它还有RB、nm-23、P16等基因。
2 大肠癌的基因诊断
大肠癌的发生过程中每一种基因突变的发生具有相对定时性，染色体5q(APC、MCC基因)上等位基因的丢失最早发生，随之出现DNA低甲基化及ras基因突变，而染色体17p(P53)和18q上等位基因丢失主要(75%～85%)发生在大肠肿瘤的后期阶段，这种相对定时性反映了大肠癌发生过程的步骤性，这是临床大肠癌基因诊断及治疗的机理。另一方面，各种敏感性高、特异性强、操作方便以及经济的检测方法的出现使基因诊断的临床应用变为现实。随着分子生物学的研究进展，基因诊断将成为早期诊断大肠癌的一种有效手段。
, http://www.100md.com
大肠癌的发生、发展过程中涉及多肿基因的改变，且具有相对定时性，通过对这些分子改变及时间顺序建立有效的检测方法，确诊大肠粘膜上皮变异或大肠原位癌PCR技术可以从极少组织甚至单个细胞中去扩增特异性DNA。PCR扩增的序列可用以下方法进行分析：(1)放射性核素标记的寡核苷酸探针杂交法；(2)用突变产生的新的限制性酶位点识别法；(3)单链构像的多态性分析；(4)直接核苷酸序列的测定。这些方法结合PCR技术可以从粪便、血液、肠液标本或大肠组织中检测出基因的异常，为高危人群提供一种可能的早期诊断和筛查手段。
myc基因是原癌基因，较其它突变基因发生早且与之起协同作用，多数肿瘤中有高表达。吴正祥等应用原位分子杂交(ISH)对不同大肠组织细胞内myc基因表达进行检测发现：83%(20/24)的大肠癌中myc基因过度表达，在重度不典型增生病例中明显增高，而伴有恶变的病变中表达最高，这些提示myc可作为肿瘤诊断基因，对确定早期诊断有帮助。
Sidranshy等1992年报告从9例患者粪便中提取DNA进行PCR扩增，经Southem Blot检测出ras基因变异。Zhu等[4]对远离肿瘤的组织学上正常的粘膜组织进行ras基因检测，发现远离肿瘤组织的肠粘膜及正常人肠粘膜组织中无ras基因第12密码子突变，而10例腺瘤中发生12密码子突变9例，邻近肿瘤的肠粘膜组织中ras基因第12密码子突变率为53.8%，作者认为可以将ras基因突变作为早期检出大肠癌的生物学标记。Villa等[5]对103例结肠镜检查有异常发现者行粪便ras基因检测，结果发现K-ras基因突变为29.1%，并认为可以将粪便K-ras基因检测作为早期大肠癌普查的方法。Ratto等[6]应用PCR和限制性内切酶技术检测了25例大肠腺癌的ras基因突变发现有15例肿瘤组织有12、13个密码子突变，而15例中14例粪便中检测到ras基因突变，并应用11例正常人粪便，3例肠道良性病变作了对照后认为该方法可早期诊断大肠癌。这些研究表明，ras基因突变是大肠癌的一种有临床意义的生化指标，从大肠癌患者标本中检测出ras突变这一事实，可认为该方法在大肠癌的诊断中可作为细胞学的一种重要辅助手段。这些方法的临床应用对某些大肠癌病人无疑具有早期诊断价值，并能避免应用某些创伤性诊断技术，这些方法的限制在于非特异性扩增、假阳性突变和仅50%的患者有活化的ras基因。
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绝大多数大肠癌中可检出P53突变。1993年，Mas等[7]报告从7例患者粪便中提取DNA经PCR扩增后进行测序分析检测出P53基因第4外显子变异，此发现曾被誉为21世纪大肠肿瘤筛检的方向。Hirota等[8]对565例早期大肠癌作了P53突变检测发现，隆起型粘膜下突变率分别为67.9%和64.1%，凹陷型粘膜内和粘膜下癌分别为23.8%和73.3%。Kenji等[9]通过对肿瘤组织及血清中突变的P53、K-ras基因的检测，认为通过对这两个突变基因的检测有助于对大肠癌临床筛查及诊断后随访工作。这些研究表明检测粪便、血清及肿瘤组织中P53基因突变有助于早期诊断大肠癌。
此外，Mastsamura等[10]研究表明，应用RT-PCR/分子杂交技术可检测出微小标本中CD44基因的异常，即使外周血中每毫升含有10个恶变的细胞也能通过该方法检测出异常表达的CD44基因条带。Wong等[11]应用RT-PCRSouthern Blotting法在24例结直肠癌患者外周血中4例检测出CD44基因表达，作者认为外周血中该基因的检测有助于早期诊断及预后的估计。对于家族性大肠癌的诊断中，APC的检测国内外有较多报道，而近期对应用hMLH1和hMLH2来诊断HNPPC的报道也较多[12，13]。
1991年Vogelstien和Fearon总结了本人及其他学者的研究成果，从分子病理学研究角度出发提出大肠癌演变具有一整套变异模式，为大肠癌的基因诊断和基因治疗提供了理论依据。该模式提示应用分子生物学方法早期诊断大肠肿瘤将成为可能，然而大肠癌基因变异的研究还存在诸多不足，大肠癌的基因诊断的临床研究还处于起步阶段，大肠癌的相关分子生物学有待进一步深入研究，以期能在大肠癌的早期诊断上有所突破。
基因诊断作为一种新型的诊断手术，随着分子生物学的不断进展，尤其是肿瘤分子生物学的进展和各种检测方法的不断更新，正逐步应用于临床，但这需要开展大量的研究，制定出一套简便、经济、适用的常规检测基因诊断方法。, 百拇医药