Esbls耐药菌株分子流行病学调查
刘岚，刘昌林，刘官信，卢仲毅，龚曼子 重庆医科大学儿童医院，重庆市400014
中图分类号:R97 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2001)02-0099-02
摘要：目的：为了研究超广谱β-内酰胺酶(extendspectrumβ-lactamase，ESBLs)耐药菌株在儿科病房的分子流行情况，及时切断医院感染的传播途径，预防医院感染可能引起的暴发流行。方法：对新生儿科、呼吸科、心脏内科、肾脏科、血液科以及儿童外科、ICU住院患儿进行痰、脐分泌物、脓、咽拭子培养，菌体药物敏感实验。分离筛选出ESBLs大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌54株，进行质粒提取琼脂糖电泳分析。结果：ESBLs在各科所占的百分率分别为46.3%、12.9%、5.6%、12.9%、5.6%、11.1%、5.6%。在质粒谱的分析中发现有3种质粒谱带，新生儿科ESBLs菌所占比例较大，均有2株为相同质粒谱。结论：新生儿科在一定程度上可能存在着医院感染。
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关键词：儿科病房；第三代头孢菌素；ESBLs；医院感染
ABSTRACT：OBJECTIVE： Analyzing the epidemic of drug risistance bacteria with extend spectrum β - lactamase( ESBLs) in children`s wards to cut off the transmitting pathway and prevent the outbreak of nosocomial infections in time METHODS： Samples， including sputum， umbilical secretion， pus， pharyngeal swab， were collected from in- hospital child patients in Departments of Newborn， Respiratory Tract Diseases， Cardiology， Nephrology， Hematology， Pediatric Surgery and ICU， then bacterial cultures and drug susceptibility test were carried out 54 strains of ESBLs E coli and Klebsiella pneumoniae were isolated and their plasmid profiles were analysed by agarose electrophoresis RESULTS： The percentages of ESBLs in the above- mentioned departments were 46 3， 12 9， 5 6， 12 9， 5 6， 11 1， 5 6 respectively In analysis， three types of profiles were found and strains with four types of the same profile concentrated in the Newborn Department The others were dispersed CONCLUSION： Nosocomial infections possibly occured in the Newborn Department to some extent
, 百拇医药
KEY WORDS： children`s ward； third generation cephalosporins； ESBLs； nosocomial infection
第三代头孢菌素由于抗菌作用强，抗菌谱广，毒性低，因而是临床众多抗菌药中应用较多的一类抗生素。自1983年欧洲首次发现耐药菌以来，耐药菌株日益增多。近年研究显示，细菌对第三代头孢菌素的耐药主要是因为产生了能水解抗生素的新的酶类--超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)[1]。在此，笔者对本院内、外科1998年10月～1999年1月，158株大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌用微生物全自动分析仪筛选出ESBLs菌54株，选取株在同一时段细菌的耐药谱及质粒谱进行分析，结果发现有同源性ESBLs菌在新生儿科存在，并且有集中发生的趋势。
1 材料与方法
1.1 菌株来源：自1998年10月～1999年1月期间，从新生儿科、呼吸科、心脏内科、肾脏科、血液科以及儿童外科住院患儿的痰、脐分泌物、血液、脓分泌物、咽拭子中分离出的大肠埃希 氏和肺炎克雷伯氏菌共158株，详见表1。
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表154例ESBLs菌的分布比例
科别 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌
例数(43) (%) 例数(11) (%)
新生儿科 19 44.10 6 54.54
呼吸科 5 11.63 2 18.10
心脏内科 3 6.98 0 0.00
肾脏科 6 13.95 1 9.10
血液科 3 6.98 0 0.00
儿童外科 4 9.30 2 18.10
ICU 3 6.98 0 0.00
, 百拇医药
1.2 菌株鉴定及药敏实验：用常规方法做细菌培养，采用MicroScan(美国)微生物全自动分析仪，以美国临床试验室国家标准委员会(NCCLS)制定的标准，对大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌进行鉴定和药敏实验，并筛选出产ESBLs菌株116株，其耐药谱见表2。
表2116株ESBLS对20种抗生素的耐药谱
抗生素种类 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌
R(%) S(%) R(%) S(%)
丁胺卡那霉素 45.9 54.1 46.2 53.4
氨苄青霉素/青霉烷砜 98.4 1.6 97.7 2.3
氨苄青霉素 100.0 0.0 97.7 2.3
, 百拇医药
菌克单 96.6 3.4 97.7 2.3
头孢唑啉 96.7 3.3 100.0 0.0
氨曲南 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢噻肟钠 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢西丁 96.7 3.3 93.0 7.0
头孢泊肟 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢他啶 86.9 13.1 86.0 14.0
头孢曲松 80.3 19.7 86.0 14.0
头孢呋肟 96.7 3.3 97.7 2.3
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头孢噻吩 85.2 14.8 86.0 14.0
环丙氟哌酸 63.9 36.1 34.9 65.1
庆大霉素 86.9 13.1 55.8 44.2
亚胺培南 11.7 88.3 14.0 86.0
氧哌嗪青霉素/Tazobac 16.7 83.3 17.9 82.1
氧哌嗪青霉素 93.4 6.6 97.7 2.3
妥布霉素 91.8 8.2 81.4 18.6
复方新诺明 82.0 18.0 55.8 44.2
注：R：耐药；S：敏感
, 百拇医药
1.3 确认试验：Etest法，用ESBL试条的一端为0.532μg/ml的头孢他啶，另一端为0.125～8μg/ml头孢他啶加4μg/ml棒酸。当在有酶抑制剂-棒酸存在时头孢他啶的MIC值降低>2倍log2倍稀释度，即加头孢他啶MIC值/头孢他啶+棒酸MIC值之比大于4，则表明测试菌为ESBL株，若试条两端抑菌圈比值小于或等于4，则为阴性[2]。
1.4 质粒提取：将有同样耐药谱的54株ESBLs菌离心后的菌苔上清液，用0.1ml细菌裂解液裂解后，再分别加入0.2mol/LNaOH和0.347mol/LSDS0.2ml、0.3mol/LNaAc0.15ml溶液，冰浴一定时间后，用饱和碱性酚/氯仿纯化质粒，再用1%的琼脂糖、溴化乙锭染色，电泳后紫外线检测[3]。
2 结果
2.1 产ESBLs与抗生素的耐药情况：116株产酶的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌对头孢类抗生素的耐药率基本相同，均在80%以上。对亚胺培南耐药率较低，分别为11.7%和14.0%；对丁胺卡那霉素的耐药率也基本相同，即45.9%和46.2%；对氨苄青霉素及氨苄青霉素/青霉烷砜的耐药率均在97.0%以上；对氧哌嗪青霉素的耐药率均在93.0%以上；对氧哌嗪青霉素/Tazobac的耐药率较低，分别为16.7%和17.9%。产酶的大肠埃希氏菌对庆大霉素及环丙氟哌酸的耐药率较肺炎克雷伯氏菌高。 2.3琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
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3 讨论
3.1 在同样耐药谱的54株ESBLs菌的调查中发现，ESBLs菌存在着不同的质粒带。主要分3种带型，主质粒带分子量为23kb，与赵秀丽报道的ESBLs菌质粒2.3kb基本一致[1]。第一种A、B号小质粒带均相同共24株，第二种F、I号共19株，其余为第三种共11株；A、B号为新生儿病痰标本中分离出来的大肠杆菌，均对菌克单、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松等第三代头孢耐药。以上结果说明，在新生儿病房的感染菌株中大肠埃希氏菌产ESBLs耐药菌株的两组不同质粒谱带中，它们分别可能具有同源性，极有可能引起暴发流行，但其他病房质粒谱的菌株较为分散，因此分子生物学调查可以在及早控制医院感染和合理使用抗生素方面起到重要的作用。
3.2 儿科病房是医院感染高危特殊区域之一，新生儿和婴幼儿是医院性感染易感性最强的特殊人群。感染部位以呼吸道为主，其次是胃肠道和皮肤，严重者致败血症及多重复合感染。医院感染的绝大多数病原对常用抗生素耐药，所以治疗比较困难，疫情不易控制。有文献报道，ESBLs所致的耐药主要是由质粒介导进行耐药性的传播与扩散，因此遇到耐药阴性菌一旦明确耐药菌已产生ESBLs，必须慎重合理选用抗菌药物针对治疗。以往从微生物实验室获得的常规细菌培养和药敏结果已难以满足临床更加合理选用抗菌药物的需要。因为很多产ESBLs耐药菌同时对同类抗生素存在明显的交叉耐药，甚至对不同类抗菌药物亦是如此[4]。
肺炎克雷伯氏菌是人体肠道、呼吸道的条件致病菌，也是医院感染菌的优势菌。当机体免疫力降低或应用免疫抑制剂，特别是抗生素的不合理使用，可导致人体菌群失调，引起肺炎克雷伯氏菌感染造成耐药性增加，也可导致二重感染使感染不易控制。婴幼儿自身免疫力相对较弱，易引起感染。
摘自：中国药房, 百拇医药
中图分类号:R97 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2001)02-0099-02
摘要：目的：为了研究超广谱β-内酰胺酶(extendspectrumβ-lactamase，ESBLs)耐药菌株在儿科病房的分子流行情况，及时切断医院感染的传播途径，预防医院感染可能引起的暴发流行。方法：对新生儿科、呼吸科、心脏内科、肾脏科、血液科以及儿童外科、ICU住院患儿进行痰、脐分泌物、脓、咽拭子培养，菌体药物敏感实验。分离筛选出ESBLs大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌54株，进行质粒提取琼脂糖电泳分析。结果：ESBLs在各科所占的百分率分别为46.3%、12.9%、5.6%、12.9%、5.6%、11.1%、5.6%。在质粒谱的分析中发现有3种质粒谱带，新生儿科ESBLs菌所占比例较大，均有2株为相同质粒谱。结论：新生儿科在一定程度上可能存在着医院感染。
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关键词：儿科病房；第三代头孢菌素；ESBLs；医院感染
ABSTRACT：OBJECTIVE： Analyzing the epidemic of drug risistance bacteria with extend spectrum β - lactamase( ESBLs) in children`s wards to cut off the transmitting pathway and prevent the outbreak of nosocomial infections in time METHODS： Samples， including sputum， umbilical secretion， pus， pharyngeal swab， were collected from in- hospital child patients in Departments of Newborn， Respiratory Tract Diseases， Cardiology， Nephrology， Hematology， Pediatric Surgery and ICU， then bacterial cultures and drug susceptibility test were carried out 54 strains of ESBLs E coli and Klebsiella pneumoniae were isolated and their plasmid profiles were analysed by agarose electrophoresis RESULTS： The percentages of ESBLs in the above- mentioned departments were 46 3， 12 9， 5 6， 12 9， 5 6， 11 1， 5 6 respectively In analysis， three types of profiles were found and strains with four types of the same profile concentrated in the Newborn Department The others were dispersed CONCLUSION： Nosocomial infections possibly occured in the Newborn Department to some extent
, 百拇医药
KEY WORDS： children`s ward； third generation cephalosporins； ESBLs； nosocomial infection
第三代头孢菌素由于抗菌作用强，抗菌谱广，毒性低，因而是临床众多抗菌药中应用较多的一类抗生素。自1983年欧洲首次发现耐药菌以来，耐药菌株日益增多。近年研究显示，细菌对第三代头孢菌素的耐药主要是因为产生了能水解抗生素的新的酶类--超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)[1]。在此，笔者对本院内、外科1998年10月～1999年1月，158株大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌用微生物全自动分析仪筛选出ESBLs菌54株，选取株在同一时段细菌的耐药谱及质粒谱进行分析，结果发现有同源性ESBLs菌在新生儿科存在，并且有集中发生的趋势。
1 材料与方法
1.1 菌株来源：自1998年10月～1999年1月期间，从新生儿科、呼吸科、心脏内科、肾脏科、血液科以及儿童外科住院患儿的痰、脐分泌物、血液、脓分泌物、咽拭子中分离出的大肠埃希 氏和肺炎克雷伯氏菌共158株，详见表1。
, http://www.100md.com
表154例ESBLs菌的分布比例
科别 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌
例数(43) (%) 例数(11) (%)
新生儿科 19 44.10 6 54.54
呼吸科 5 11.63 2 18.10
心脏内科 3 6.98 0 0.00
肾脏科 6 13.95 1 9.10
血液科 3 6.98 0 0.00
儿童外科 4 9.30 2 18.10
ICU 3 6.98 0 0.00
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1.2 菌株鉴定及药敏实验：用常规方法做细菌培养，采用MicroScan(美国)微生物全自动分析仪，以美国临床试验室国家标准委员会(NCCLS)制定的标准，对大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌进行鉴定和药敏实验，并筛选出产ESBLs菌株116株，其耐药谱见表2。
表2116株ESBLS对20种抗生素的耐药谱
抗生素种类 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌
R(%) S(%) R(%) S(%)
丁胺卡那霉素 45.9 54.1 46.2 53.4
氨苄青霉素/青霉烷砜 98.4 1.6 97.7 2.3
氨苄青霉素 100.0 0.0 97.7 2.3
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菌克单 96.6 3.4 97.7 2.3
头孢唑啉 96.7 3.3 100.0 0.0
氨曲南 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢噻肟钠 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢西丁 96.7 3.3 93.0 7.0
头孢泊肟 98.4 1.6 97.7 2.3
头孢他啶 86.9 13.1 86.0 14.0
头孢曲松 80.3 19.7 86.0 14.0
头孢呋肟 96.7 3.3 97.7 2.3
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头孢噻吩 85.2 14.8 86.0 14.0
环丙氟哌酸 63.9 36.1 34.9 65.1
庆大霉素 86.9 13.1 55.8 44.2
亚胺培南 11.7 88.3 14.0 86.0
氧哌嗪青霉素/Tazobac 16.7 83.3 17.9 82.1
氧哌嗪青霉素 93.4 6.6 97.7 2.3
妥布霉素 91.8 8.2 81.4 18.6
复方新诺明 82.0 18.0 55.8 44.2
注：R：耐药；S：敏感
, 百拇医药
1.3 确认试验：Etest法，用ESBL试条的一端为0.532μg/ml的头孢他啶，另一端为0.125～8μg/ml头孢他啶加4μg/ml棒酸。当在有酶抑制剂-棒酸存在时头孢他啶的MIC值降低>2倍log2倍稀释度，即加头孢他啶MIC值/头孢他啶+棒酸MIC值之比大于4，则表明测试菌为ESBL株，若试条两端抑菌圈比值小于或等于4，则为阴性[2]。
1.4 质粒提取：将有同样耐药谱的54株ESBLs菌离心后的菌苔上清液，用0.1ml细菌裂解液裂解后，再分别加入0.2mol/LNaOH和0.347mol/LSDS0.2ml、0.3mol/LNaAc0.15ml溶液，冰浴一定时间后，用饱和碱性酚/氯仿纯化质粒，再用1%的琼脂糖、溴化乙锭染色，电泳后紫外线检测[3]。
2 结果
2.1 产ESBLs与抗生素的耐药情况：116株产酶的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌对头孢类抗生素的耐药率基本相同，均在80%以上。对亚胺培南耐药率较低，分别为11.7%和14.0%；对丁胺卡那霉素的耐药率也基本相同，即45.9%和46.2%；对氨苄青霉素及氨苄青霉素/青霉烷砜的耐药率均在97.0%以上；对氧哌嗪青霉素的耐药率均在93.0%以上；对氧哌嗪青霉素/Tazobac的耐药率较低，分别为16.7%和17.9%。产酶的大肠埃希氏菌对庆大霉素及环丙氟哌酸的耐药率较肺炎克雷伯氏菌高。 2.3琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
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3 讨论
3.1 在同样耐药谱的54株ESBLs菌的调查中发现，ESBLs菌存在着不同的质粒带。主要分3种带型，主质粒带分子量为23kb，与赵秀丽报道的ESBLs菌质粒2.3kb基本一致[1]。第一种A、B号小质粒带均相同共24株，第二种F、I号共19株，其余为第三种共11株；A、B号为新生儿病痰标本中分离出来的大肠杆菌，均对菌克单、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松等第三代头孢耐药。以上结果说明，在新生儿病房的感染菌株中大肠埃希氏菌产ESBLs耐药菌株的两组不同质粒谱带中，它们分别可能具有同源性，极有可能引起暴发流行，但其他病房质粒谱的菌株较为分散，因此分子生物学调查可以在及早控制医院感染和合理使用抗生素方面起到重要的作用。
3.2 儿科病房是医院感染高危特殊区域之一，新生儿和婴幼儿是医院性感染易感性最强的特殊人群。感染部位以呼吸道为主，其次是胃肠道和皮肤，严重者致败血症及多重复合感染。医院感染的绝大多数病原对常用抗生素耐药，所以治疗比较困难，疫情不易控制。有文献报道，ESBLs所致的耐药主要是由质粒介导进行耐药性的传播与扩散，因此遇到耐药阴性菌一旦明确耐药菌已产生ESBLs，必须慎重合理选用抗菌药物针对治疗。以往从微生物实验室获得的常规细菌培养和药敏结果已难以满足临床更加合理选用抗菌药物的需要。因为很多产ESBLs耐药菌同时对同类抗生素存在明显的交叉耐药，甚至对不同类抗菌药物亦是如此[4]。
肺炎克雷伯氏菌是人体肠道、呼吸道的条件致病菌，也是医院感染菌的优势菌。当机体免疫力降低或应用免疫抑制剂，特别是抗生素的不合理使用，可导致人体菌群失调，引起肺炎克雷伯氏菌感染造成耐药性增加，也可导致二重感染使感染不易控制。婴幼儿自身免疫力相对较弱，易引起感染。
摘自：中国药房, 百拇医药