国产甲泼尼龙片剂的生物等效性研究
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朱珠，傅强，王鹏，徐小薇，李大魁，黄丹和(中国医学科学院—中国协和医科大学北京协和医院，北京 100730)
摘要：目的 用进口片剂(A)为对照品，评价国产片剂(B)的相对生物利用度和生物等效性。方法 采用随机交叉分组试验设计，18名健康成年男性受试者分别以150ml牛奶空腹送服单剂量40mg测试品和对照品，按设计采集14h内动态血标本；用一改进的HPLC测定血浆药物浓度，以非房室模型计算AUC和t1/2，tmax和cmax为实测值。按新药审评标准对AUC和cmax进行方差分析和双单侧t检验，以判定两制剂是否生物等效。结果 对照品和测试品的tmax分别为(2.1±0.5)h和(1.9±0.5)h, cmax分别为(572.6±121.7)ng·ml-1,和(597.6±119.8)ng·ml,AUC0-∞分别为(2571.2±647.4) h·ng·ml-1和(2528.4±558.8) h·ng·ml-1,t1/2分别为(2.3±0.4)h和(2.2±0.4) h;片剂B相对A的平均生物利用度为99.62%.结论 统计分析显示,测试片剂B与进口对照片剂A具生物等效性.
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关键词:甲泼尼龙；生物等效性；高效液相色谱法
中图分类号：R969。4 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2001)04-0261-04
甲泼尼龙(methylprednisolone，以下简称MP)，又名甲基强的松龙，是美国于50年代末期研制成功的一种糖皮质激素类药物，美国、英国、日本等发达国家药典持续收载该品种。天津药业有限公司于1999年仿制成功该药，处方工艺和体外溶出度实验结果与比利时普强制药公司生产的美卓乐(MedrolTM)相似。本实验根据我国IV类新药申报要求，考察了国产MP片剂的生物等效性。
1 材料与方法
1. 1 受试对象
18名男性健康受试者，年龄(23.6±4.08)岁(18～37岁)、体重分数(22.4±1.27)(20.2～24.6)。受试者于试验前6个月内未患严惩疾病、前4周及试验期间未用任何药物且无吸烟酗酒等不良嗜好；通过体检并自愿签署知情同意书后入选。
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1.2 药品与试验设计
对照品美卓乐片剂(片剂A)(法玛西亚-普强公司比利时分厂生产；批号GB0240；规格：4mg·片-1)。测试品MP片剂(片剂B，天津药业有限公司生产；批号970801；规格：4mg·片-1)。
采用随机交叉分组自身对照试验，受试者分别以150ml牛奶空腹送服单剂量40mg片剂A和B，服药后2h给100ml水和60g普通饼干一次，4h后进标准午餐。两次试验间隔一周。
1.3 血样采集
分别于服药前和服药后0.5,1.1.5,2,2.5,3,4,5,6,8,10,12和14h采集前臂静脉血2ml，离心分离出血浆后保存于-70℃冰箱待测。
1. 4 样品测定
, http://www.100md.com 在文献[1～2]的基础上改进了反相HPLC，用于血浆MP浓度的测定。
1.4.1 试剂与规格 甲泼尼龙对照品为美国药典对照标准品(Cat.No.43500)，内标地塞米松(美国Sigma公司)；叔丁基甲醚、乙腈和四氢呋喃(美国fisher试剂公司)均为色谱纯；其它试剂为分析纯，水为超纯试验用水。
1.4.2 仪器与色谱条件 日本岛津LC-10A系统，泵流速0.8ml·min-1,紫外检测波长245nm.流动相为乙腈-水-四氢呋喃(32:68:3)；Supelcosil LC-18色谱柱(150 mm×4.6mm,5μm;Supelco Chromatography Products)。
1.4.3 样品处理 取0.2ml待测血浆于2mL塑料离心试管中,加20μl内标(1.3mg·L-1)和1.5ml叔丁基甲醚，卧式振荡5min并离心；完全转移有机相于另一试管并用氮气吹干;以50μl流动相复溶,取20～40μl进样分析。
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1.4.4 标准曲线及质控 精密称定一定MP标准品配成母液，以正常人混合空白血浆配制成含MP分别为5，10，25，50，100，250和500ng.ml-1的血浆标准系列。另分别配制低、中、高(25，100和400ng.ml-1)3种MP血浆质控样品，两者均分装后保存于冰箱中备用。按 “1.4.3”项下操作获得标准曲线及方法学质控数据。
1.5 数据处理
利用Winnonlin程序(SCI，v.1.5)非房室模型计算两组个体生物利用度参数AUC，t1/2和MRT，tmax和cmax为实测值。AUC14～∞小于20%AVC0～∞时采用AUC0～∞计算生物利用度。对AVC0～和cmax进行方差分析和双单侧t检验[3]，按AVC：80%～125%和 cmax：：70%～143%判定标准，考察两制剂是否具生物等效性。
2 结果·
, 百拇医药
2.1 测定方法
2.1.1 色谱行为 MP和内标与血浆杂峰分离良好，二者出峰处基钱平稳无任何干扰，保留时间分别为6.3和7.2min。同时氢化可的松、氢化泼尼松、醋酸地塞米松等皮质激素对本法无干扰。
2.1.2 线性及质控 血浆MP在5～500ng·ml-1浓度范围内具良好线性：r2=O.9999，n=7；斜率RSD为2.18%。40μl时样时，血浆标推样品检出浓度可达2ng·ml-1。超出标准曲线上限的样品，以空白血浆等量稀释后测定并换算出真值。低中高血浆质控样品的批间(n=7)和批内(n=0)误差、及方法学回收率见表1。
表1 人血浆中甲泼尼龙HPLC方法学质控数据
浓度/
ng.ml-1
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批间(n=6)
批内(n=10)
回收率(n=16)
±s/ng.ml-1
RSD/%
±s/ng.ml-1
RSD/%
±s/%
25
25.86±0.85
3.29
24.89±0.66
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2.67
99.55±2.66
100
98.11±3.18
3.24
97.57±2.51
2.57
97.57±2.51
400
396.40±11.24
2.84
402.42±6.14
, 百拇医药
1.53
100.61±1.53
2.2 血浆药-时曲红
由18名健康受试者po单剂量40mg片剂A和B后，14h内二者平均血浆药物浓度的半对数曲线(图1)可以看出，两制剂的血浆药物浓度均于服药后1-3h达到峰值(330-800ng·ml-1)，个体间吸收和代谢差异较大，而个体内差异较小。
图1单剂量服用40mg片A(○)和B(●)后组间平均血浆药-时曲线
2. 3 生物利用度参数
两制剂组间主要生物利用度参数见表2。
表2 健康受试者po单剂量40mg测试品和对照品后的各药动学n=18，±s
, 百拇医药
参数
测试品
对照品
tmax/h
1.9±0.5
2.1±0.5
cmax/ng·ml-1
597.6±119.8
572.6±121.7
AUC0-14/h·ng·ml-1
2478.6±527.2
2509.7±611.1
, 百拇医药
AUC0-∞/h·ng·ml-1
2528.4±558.8
2571.2±647.4
AUC残余比/%
1.81±1.04
2.22±1.53
t1/2/h
2.2±0.4
2.3±0.4
MRT/h
4.2±0.6
4.5±0.7
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Fr/%
99.61±1026(85.16-126.27)
片剂A与B的平均相对生物利用度为(99.61±10.26)%.此外,二者药-时曲线下残留面积(AUC14～∞)分别为(1.81±1.04)%(范围0.45%～1.00%)和(2.22±1.53)%(范围0.37%～5.71%),均达到有关规定的AUC14～∞小于20%AUC0～∞的要求，即本试验采点频度和采血时间范围设计合理。
2.4 生物等效性判定
2.4.1 方差分析(ANOVA)由于AUC0～∞和Cmax不为正态分布，故应对AUC及Cmax进行对数转换后，再进行方差分析。表3结果证实该药口服后存在一定个体差异。
2.4.2 双单侧t检验 两制剂AUC0～∞和Cmax的平均值90%可信限均落在规定范围内，片剂A和B等效性检验合格。
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表3 受试品和对照品组间AUC0-∞和Cmax的方差分析结果
方差来源
df
SS
MS
F
α=0.05
AUC0-∞
个体间
17
1.785
0.1046
, 百拇医药 24.2721
F0.05(17,16)=2.29
周期间
1
0.0137
0.0137
3.1892
F0.05(1,16)=4.491)
处方间
1
0.0007
0.0007
, 百拇医药
0.1567
F0.05(1,16)=4.491)
误差
16
0.0690
0.0043
总变异
35
1.8618
cmax
个体间
17
1.3681
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0.0805
6.1985
F0.05(17,16)=2.29
周期间
1
0.0123
0.0123
0.9507
F0.05(1,16)=4.491)
处方间
1
0.0186
, 百拇医药
0.0186
1.4347
F0.05(1,16)=4.491)
误差
16
0.2077
0.0130
总变异
35
1.6068
注：1)p>0.05 无显著差异
Note：1)p>0.05
, 百拇医药
表4 双单侧 t 检验结果
参数
t1
t2
t0.05
AUC0-∞
10.59258
9.80091
1.746
cmax
10.9760
8.18764
, 百拇医药 1.746
2.4.3 tmax等效性分析 用非参数统计方法对tmax进行评价，结果显示片剂A与B的tmax无显著性差异。
3 讨论
3.1 测定方法学
本实验改进的血浆甲泼尼龙浓度HPLC测定法，简化了样品处理步骤和流动相配比，同时也提高了检测灵敏度。为本试验结果的准确性提供了数据保障。在全部受试样品测定过程中，所带低、中高3种血浆质控样本(n=11)RSD均小于4%。其它皮质激素类药物对本测定无干扰。
3.2 给药方案
3.2.1 服药 通常是在空腹时口服药物，以尽可能地养活各种因素对药物吸收过程的影响。但为了避免空腹口服甲泼尼龙可能引起的消化道溃疡等不良反应并影响药物吸收，本试验参考国外文献[4]的建议，用150ml牛奶空腹送服后4h进标准午餐，并定时定量饮水。
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3.2.2 剂量 甲泼尼龙口服时的初始剂量为16-48ng·ml-1，维持量为4-8 ng·ml-1。用于危重疾病时，甲泼尼龙多采用大剂量(>250 mg·d-1)静脉滴注或肌注，最大剂量为30 mg·kg-1每4-6h一次，有研究表明[4-5]，60mg口服和静脉注射时，其血药峰浓度分别为489和735 ng·ml-1。考试到本测定方法的灵敏度和受试者可耐受程度，选剂量为临床可接受的安全剂量40mg。
3.2.3 周期间隔 考虑到甲泼尼龙血浆半衰期为2-4h，两次交叉试验的间隔定为1周时间，足以保证首次试验所服药品在体内完全清除。
3.2.4 个体差异 甲泼尼龙和其它糖皮质激素一样，主要是在肝脏中通过4，5碳原子之间的双键被还原而代谢，并与葡萄糖醛酸或硫酸在3位结合后，从尿中排出。以肝代谢为主的口服药物由于通过代谢作用，通常会有一定个体间差异。
4 结论
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口服相同单剂量下，片剂B相对A的生物利用度为(99.6±10.26)%(85.16%- 126.27%);两组间AUC,CmaxTtmax参数的等效性分析表明片剂A和B具生物等效性.
参考文献
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