胃扩张刺激对大鼠大脑皮层及海马CCK mRNA表达的影响
青岛大学医学院生理教研室；青岛；266021 唐明；倪宏；徐珞
关键词：胆囊收缩素；胃扩张；CCK mRNA；大脑皮层；海马
摘要：胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是脑肠肽中的一种, 被认为是饱因子。本实验采用以地高辛标记的CCK cDNA为探针的原位杂交和半定量RT-PCR技术, 用水囊扩张胃作为对胃壁的机械刺激模拟食物对胃的充盈作用, 观察大鼠大脑皮层和海马内含CCK神经元CCK mRNA表达的变化情况。结果表明: (1)对照组大鼠大脑皮层和海马CA3等区有散在CCK mRNA表达阳性细胞; (2)胃扩张刺激后, 皮层和海马等区内CCK mRNA表达信号明显增强, 表现为CCK mRNA阳性神经元体积增大, 数量增加, 细胞内酶反应产物密集, 积分光密度显著增加(P<0.01); (3)半定量RT-PCR检测结果显示: 实验组大鼠大脑皮层、 海马标本电泳图有明显的158 bp扩增条带, 信号比对照组明显增强。实验组大鼠大脑皮层、 海马CCK mRNA相对含量显著增加(P<0.01)。可见, 在胃扩张机械性刺激作用下, 皮层、 海马CCK神经元内CCK mRNA表达增强, 来自胃扩张刺激引起的神经信号可传入到中枢神经系统高级部位的皮层、 海马等区, 使脑细胞核内CCK基因转录水平发生变化。 结果提示, 中枢神经系统高级部位CCK的生物合成过程参与中枢对胃内压和胃运动的调控。
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胆囊收缩素既存在于胃肠道、 也广泛分布于中枢神经系统, 尤其在大脑皮层及边缘系统中含量为多, 参与机体多种生理机能的调控, 如摄食、 镇痛、 学习记忆等。 在调控摄食的过程中, CCK通过外周和中枢两种机制, 抑制摄食[1]。在生理情况下, 当进食时或食物进入胃内及十二指肠后, 对消化道的机械刺激与化学刺激可引起外周CCK释放, 胃扩张刺激与循环血中的CCK与胃迷走神经上的CCK-A受体结合, 转化为神经冲动, 上传至延髓的孤束核(NTS), 进而抑制下丘脑的摄食中枢[2]。资料表明, 以水囊扩张胃及动脉注入CCK-8可分别通过迷走神经I类纤维和Ⅱ类纤维将神经冲动传入中枢; 外源性CCK具有模拟迷走神经兴奋及放大迷走传入活动的作用[3]。关于中枢神经系统高级部位中内源性CCK在摄食调控中参与的作用与机制, 尚未完全明了。本文旨在观察胃扩张的传入冲动对大鼠皮层和边缘系统结构中CCK基因表达的影响, 以期从分子水平上了解中枢高级部位内CCK神经元对与进食有关的消化道传入信息的反应与机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及组织的制备 本工作选用体重200～250g Wistar大鼠10只, 随机分为两组(各5只), 雌雄不拘, 自由饮水, 禁食15 h后, 在20% urethane(1 g/kg, ip)麻醉下, 将气囊经胃大弯切口置入胃体部, 气囊导管连接注射器, 温水注入囊内作扩张刺激。实验组注水5 ml, 扩张10min后断头取脑; 对照组同样手术将气囊置入胃体, 不扩张,10 min后断头取脑。断头前, 经升主动脉先灌注生理盐水, 再灌注含4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸的磷酸缓冲液(PB, pH 7.4, 0.1 mol/L)。取脑固定2 h后, 浸入20%蔗糖磷酸缓冲液中至组织块下沉, -70℃低温冰箱保存待原位杂交。
半定量RT-PCR检测, 设大鼠对照组, 实验组各4只, 雌雄不拘。胃扩张刺激参数同前, 断头取脑, 冰冻分离脑区: 大脑皮层、 海马, 提取总RNA。以总RNA为模板,采用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA。用内参照半定量RT-PCR检测。
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1.2 原位杂交的步骤 本实验所用质粒PUC13来自Michigan大学生化系Dixon,J.E.教授实验室, 含有577个碱基对的CCK cDNA。其中第34～381核苷酸序列编码为前CCK原 (CCK precursor), 319～378核苷酸序列编码为CCK-8。内切酶分别为EcoRI和HindIII。采用氯化钙法进行质粒的转化, 转化所用工程菌为HB101。碱裂解法大量制备质粒, 分别用EcoRI和HindIII内切酶对插入片段进行酶切, 回收采用“V型槽”DNA回收法。用Dig-随机引物标记法, 按照宝灵曼操作手册对cDNA探针进行标记。脑组织以OCT包埋, 冰冻作冠状切片。 切片置含4%多聚甲醛的PBS缓冲液中, 固定10 min后进行原位杂交,具体操作参照Young的方法[4]。
1.3 实验专一性和可靠性检验 为排除实验的假阳性和假阴性, 提高本实验的可信度, 特采取以下步骤: (1)以不含探针的杂交缓冲液取代含Dig-CCK-cDNA探针的杂交液。 (2)以正常羊血清代替羊抗Dig抗体-碱性磷酸酶(AP)复合物。 (3)将酶切质粒的剩余片段标记后取代Dig-CCK-cDNA探针
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1.4 图像分析和数据处理 脑组织经脚间窝进行冠状切片, 实验组与对照组各5张组织片, 对各区内表达CCK mRNA胞体进行记数, 为避免记数时主观因素的影响, 对每张脑片同一脑区记数5次, 取其平均值。 然后每张组织片随机选择10个胞体, 输入到VIDAS-21 (德国)图像分析仪(青岛大学医学院中心实验室提供), 对各区内表达CCK mRNA胞体的截面积(section area, SA)和积分光密度(integral optic density, IOD)进行测量。所得数据经统计学处理后, 求出各组各区每张组织片内表达CCK mRNA神经元的平均数量, 每个表达CCK mRNA神经胞体的积分光密度和平均截面积, 然后作显著性检验, 结果均以(x±s±s)表示。
1.5 半定量RT-PCR检测步骤
1.5.1 CCK基因扩增引物的设计与合成 参照文献[8], 根据大鼠CCK前体基因的全DNA序列, 设计并合成大鼠CCK基因的上下游引物P1及P2(由北京赛百盛生物工程公司合成)。上游引物P1: 5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTC-3(大鼠CCK前体基因第241-260 bp); 下游引物P2: 5-GCGCCGAGGGCTGGCC～CAC-3(大鼠CCK前体基因第379-398 bp), 该PCR扩增产物为一长度为158 bp的DNA片段。
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1.5.2 半定量RT-PCR反应中内参照模板的制备及其引物的合成 参考本院分子病毒重点实验室的HIV1全病毒基因质粒p9b6的DNA序列及大鼠CCK前体基因序列, 设计并合成内参照模板的制备引物P3及P4。 上游引物P3: 5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTCGAGCAGATGATACAGTATTA-3(大鼠CCK前体基因第241-260 bp及HIV1SF2株第3336-3355 bp); 下游引物P4: 5-GCGCCGAGAGGCTGGCCCACGGGAATTTAAG～TACACC-3(大鼠CCK前体基因第379-398 bp及HIV1SF2株第3600-3619 bp)。 上游引物P3的5′末端有一段非HIV DNA序列, 即5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTC-3与P1引物序列一致, 下游引物P4的5′末端有一段5-GCGCCGAGGGCTGGCCCAC-3序列与P2引物序列一致。以3μlp9b6质粒为模板, 用P3和P4为引物作PCR扩增, 产物为264 bp的DNA片段。PCR反应条件见后。获得产物200μl, 经PCR纯化试剂纯化后, 溶于1000μl TE中。 此产物可作为半定量PCR反应的内参照模板。
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1.5.3 半定量RT-PCR反应条件 在30μl反应体积中, P1P2分别为100 pmol, 10 buffer 3μl, dNTP各0.2 mmol/L, TaqDNA聚合酶1 U, MgCl2 1.5 mmol/L, cDNA模板4μl, 内参照模板2μl, 扩增条件为94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃ 60 s共35个循环, 最后72℃延伸5 min。取PCR产物10μl于2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 μg/ml)中电泳, 观察158及264 bp条带并在紫外灯下拍照。
1.5.4 大鼠CCK mRNA表达水平的检测 将待测标本的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳后, 经染色并在紫外灯下拍照, 再经VIDAS-21(图像分析系统)进行电泳条带的扫描分析, 得出两条电泳条带的光密度值(见表1)。根据内参照PCR扩增条带(264 bp)扫描密度与CCK待测PCR扩增条带(158 bp)的扫描密度可以推断CCK mRNA相对含量。
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1.5.5 统计学分析 将各组的各条PCR产物电泳条带密度扫描结果参数经平方根反正弦转换后, 做方差分析, 比较实验组和对照组264及158 bp的显示密度差异。
2 结果
2.1 原位杂交法检测对照组大鼠大脑皮层及边缘系统CCK mRNA的表达
2.1.1 分布特点 大鼠嗅内皮质、 梨状皮质、 颞皮质、 海马本部及下丘脑散在分布有CCK mRNA阳性表达细胞,平均每个视野有6～10个阳性表达细胞。在海马内, CCK mRNA阳性胞体仅见于背海马, 以CA1和CA3为主, 且截面积较小, 平均每个视野有1～4个阳性细胞。杏仁核内偶见CCK mRNA阳性胞体。
2.1.2 形态特点 阳性细胞胞质内可见蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物,着色浅淡,与背景反差小,直径10～30 μm,胞核呈空泡状; 细胞形态表现不一,主要为椭圆形和圆形(图1, 见图版Ⅰ)。 图像分析结裹可见, 大鼠阳性胞体截面积和积分光密度较小。
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图1 胃扩张对大鼠大脑皮层和海马神经元CCK mRNA表达的影响
Fig.1 CCK nRNA expression neuron in cerebral cortex and hippcompus of CCK nRNA expressing neurons in normal rat cerebral cortex and hippocampus..Bthe expression of CCK mRNAelevated markedly in rat cerebral cortex and hippocampus afrer gastric distension.CThe expression of CCK nRNA esevated markedly in rat cerebral cortex after hastric distension.DThe expression of CCK nRNA elevated markedly in rat hippocampus after hastric distension.Scale bars:A,B 120μm;C,D 30μm.
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2.2 胃扩张组大鼠大脑皮层及边缘系统中CCK mRNA的表达
2.2.1 分布特点 实验显示, 胃扩张组大鼠CCK mRNA阳性细胞广泛分布于嗅内皮质、 梨状皮质及下丘脑, 平均每个视野有45～55个阳性表达细胞。 海马的CA1和CA3区细胞内CCK mRNA表达显著, 平均每个视野有36～44个阳性表达细胞(P<0.01)。
2.2.2 形态特点 胃扩张时上述脑区内, 90%以上CCK mRNA阳性神经细胞着色深, 轮廓清楚, 与背景对比清晰, 反差明显。胞质内充满呈蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物, 胞核常被密集的酶反应产物所掩盖。胞体大小不等, 直径约10～30 μm。80%以上CCK mRNA阳性神经细胞胞体呈中等大小圆形或卵圆形, 部分呈锥体形。在海马内CCK mRNA阳性胞体主要分布于CA1和CA3区, 并且以多形层分布为主(图2～5)。
2.2.3 图像分析结果 胃扩张时上述脑区CCK mRNA阳性神经细胞截面积和光密度明显增加, 较对照组有显著性差异(P<0.01)。
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图2 胃扩张引起大鼠大脑皮层CCK mRNA阳性神经元积分光密度增加
Fig.2 Increased integral optic density of CCK mRNA positive neurons in cerebral cortex due to gastric distension
**P<0.01.
图3 胃扩张引起海马CCK mRNA阳性神经元积分光密度增加
Fig.3 Increased integral optic density of CCK mRNA positive neurons in hippocampus due to gastric distension
**P<0.01.
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图4 胃扩张引起大鼠大脑皮层CCK mRNA阳性神经元截面积增加
Fig.4 Increased section area of CCK mRNA positive neurons in cerebral cortex due to gastric distension
**P<0.01.
图5 胃扩张引起大鼠海马CCK mRNA阳性神经元截面积增加
Fig.5 Increase of the section area of CCK mRNA positive neurons in hippocampus due to gastric distension
**P<0.01.
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2.3 原位杂交方法的特异性
(1)用不含Dig-CCKcDNA探针的杂交液孵育的标本及用正常羊血清孵育的标本, 未见阳性杂交信号。 (2)用酶切质粒的剩余片段标记后用作杂交探针, 也未检测到阳性杂交信号, 说明实验杂交信号代表CCK mRNA的特异性分布。
本实验结果揭示, 在对照组大鼠的大脑皮层和边缘系统内存在含CCK mRNA神经元, 用ISH法可检测出CCK mRNA在细胞内的基因表达及其对胃扩张刺激产生的变化。
2.4 半定量RT-PCR检测结果
(1)大鼠脑中CCK mRNA半定量RT-PCR检测结果见图6、图7。 每份标本电泳图均可观察到内参基因264 bp扩增条带作为内参照。(2)对照组的大脑皮层、 海马区标本电泳图中可见有158 bp DNA条带, 表明有CCK mRNA表达, 但条带光密度较弱, 说明CCK mRNA表达水平较低(图6)。(3)实验组大脑皮层、 海马标本电泳图中有明显的158 pb DNA扩增条带。 条带光密度较对照组显著增强, CCK mRNA表达水平提高 (见表1)。 可见, A组∶B组, C组∶D组, (A+C)组∶(B+D)组, 参数经平方根反正弦转换后, 经方差分析, 均呈显著差异(P<0.01), 胃扩张实验组大鼠脑区CCK mRNA表达水平明显高于对照组。 提示胃扩张刺激可使大鼠大脑皮层、 海马内CCK mRNA水平明显提高, 与原位杂交法结果一致。
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图6 对照组大鼠大脑皮层、海马的半定量RT-PCR法测定CCK mRNA的表达
Fig.6 Amplification of CCK mRNA from rat cerebral cortex and hippcompus by means of semi-quentitive RT-PCR in control group lanes 1～4: hippcompus; lanes 5～8: cerebral cortex.
图7 胃扩张刺激对大鼠大脑皮层、 海马内半定量RT-PCR法测定CCK mRNA表达的影响
Fig.7 Amplification of CCK mRNA from rat cerebral cortex and hippcompus by means of semi-quentitive RT-PCR in gastric distention group Lane 1:marker;lanes 2～4: hippcompus; lanes 5～8: cerebral cortex.
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表 1 胃扩张对大鼠大脑皮层、海马CCK mRNA表达的影响
Table 1 Effects of gastric distention on CCK mRNA expression by means of RT-PCR
Ratio of optic d0ensity (CCK mRNA / Intercontrol template)
Control group
Gastric distention
Cerebral cortex
(A)
0.46
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(B)
0.81
0.29
0.79
0.21
0.98
0.17
0.96
Hippocampus
(C)
0.19
(D)
0.62
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0.17
0.68
0.20
0.49
0.37
0.65
3 讨论
Crawley 1984年[5]用损伤迷走神经、孤束核、中脑和室旁核的方法, 证明迷走神经可将胃肠道传入信息传到孤束核(NTS), 继而影响下丘脑的摄食中枢和饱中枢。我们的工作发现, 杏仁核和海马参与CCK调节摄食和胃运动的作用[6,7], 核内CCK含量的增加可降低、抑制胃运动, 此作用是通过CCK-A受体而非CCK-B受体实现的, 下丘脑腹内侧核则是此通路中必要的中介环节。可见, 胃扩张刺激可通过中枢内多级传递直至边缘系统高级部位及有关大脑皮层神经元, 参与胃内压、胃运动及摄食抑制的调控。
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80年代以来, 神经分子生物学研究揭示, CCK mRNA广泛存在于哺乳类动物脑内, 大脑皮层、海马等区含量尤高。 Mocchetti[9]认为, 脑区内CCK mRNA的含量可作为可信赖指标, 以监测电性或化学性传入信号对细胞内CCK合成过程的影响, 从而了解CCK参与生理机能调控或神经精神疾病机制的本质。近年[10]Berthoud等工作表明, 胃扩张刺激可引起延髓NTS和迷走神经复合体(DMX)神经元电活动和c-fos表达增强, 胃扩张程度与核内神经原c-fos表达强度呈线性关系,认为NTS、 DMX是接受胃壁机械性感受冲动的二级神经原。
实验进一步表明, 胃扩张刺激可引起大鼠海马和大脑皮层的CCK mRNA阳性神经元数量显著增加, 胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物明显增多。图像分析的结果显示, 细胞的积分光密度和截面积较对照组显著增加, 说明细胞内CCK mRNA表达信号增强, CCK mRNA表达的提高以及相应的CCK合成速度的增加,是胃扩张组阳性神经元体积显著增大的根本原因。PCR法也证明实验组CCK mRNA相对含量显著增加。
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综上所述,中枢神经系统高级部位CCK神经元在胃扩张刺激胃内压增加的情况下, CCK基因转录水平提高,合成速度加快,从而在细胞分子生物学水平证明, 中枢神经高级部位的海马和大脑皮层内源性CCK的生物合成过程参与对胃内压和胃运动的中枢调控机制。
*Corresponding anthor. Tel: 3838480-3757
作者单位:唐明；倪宏；徐珞 青岛大学医学院生理教研室, 青岛 266021
参考文献
[1]Crawley JN, Corwin RL. Biological actions of cholecystokinin. Peptide, 1994, 15: 731～755.
[2]Andrew JS, John EM. Role of CCK in regulation of food intake. Prog Neurobio. 1991, 36: 23～34.
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[3]Schwartz GJ, McHugh PR, Moran TH. Integration of vagal afferent response to gastric loads and cholecystokinin in rats. Am J Physiol, 1991, 261: 1 pt 2.
[4]Young III WS. In situ hybridization histochemical detection of neuropeptide mRNA using DNA and RNA probe. Methods Enzymol, 1989, 168: 702～709.
[5]Crawley JN, Schwaber JS. Abolish of the behavioral effects of cholecystokinin following bilateral radiofrequency lesions of the paraventricular subdivision of the nucleus tractus solitarius. Brain Res. 1984, 295: 289～299.
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[6]Tang M (唐 明), Su HL (苏海灵). Inhibition of gastric motility by microinjection of CCK-8 into rat amygdala. Acta Physiol Sin (生理学报), 1997, 49 (5): 569～574 (in Chinese with English abstract).
[7]Su HL (苏海灵), Tang M (唐 明). The inhibition of CCK-8 on gastric motility mediated by CCK-A receptor in rat hippocampus. Acta Acad Med Qingdao (青岛医学院学报), 1995, 31: 13～15 (in Chinese with English abstract).
[8]Robert JD, Lori JL, et al. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat pre～pro～cholecys～tokinin. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 726～730.
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[9]Ding XZ， Mocchetti I. Dopaminergic regulation of cholecystokinin mRNA content in rat striatum. Mol Brain Res, 1992, 12: 77～83.
[10]Willing AE， Berthoud HR. Gastric distension-induced c-fos expression in catecholaminergic neurons of rat dorsal vagal complex. Am J Physiol，1997, 272: R59～R67.
收稿:1998-11-15
修回:1999-03-02, http://www.100md.com
关键词：胆囊收缩素；胃扩张；CCK mRNA；大脑皮层；海马
摘要：胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是脑肠肽中的一种, 被认为是饱因子。本实验采用以地高辛标记的CCK cDNA为探针的原位杂交和半定量RT-PCR技术, 用水囊扩张胃作为对胃壁的机械刺激模拟食物对胃的充盈作用, 观察大鼠大脑皮层和海马内含CCK神经元CCK mRNA表达的变化情况。结果表明: (1)对照组大鼠大脑皮层和海马CA3等区有散在CCK mRNA表达阳性细胞; (2)胃扩张刺激后, 皮层和海马等区内CCK mRNA表达信号明显增强, 表现为CCK mRNA阳性神经元体积增大, 数量增加, 细胞内酶反应产物密集, 积分光密度显著增加(P<0.01); (3)半定量RT-PCR检测结果显示: 实验组大鼠大脑皮层、 海马标本电泳图有明显的158 bp扩增条带, 信号比对照组明显增强。实验组大鼠大脑皮层、 海马CCK mRNA相对含量显著增加(P<0.01)。可见, 在胃扩张机械性刺激作用下, 皮层、 海马CCK神经元内CCK mRNA表达增强, 来自胃扩张刺激引起的神经信号可传入到中枢神经系统高级部位的皮层、 海马等区, 使脑细胞核内CCK基因转录水平发生变化。 结果提示, 中枢神经系统高级部位CCK的生物合成过程参与中枢对胃内压和胃运动的调控。
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胆囊收缩素既存在于胃肠道、 也广泛分布于中枢神经系统, 尤其在大脑皮层及边缘系统中含量为多, 参与机体多种生理机能的调控, 如摄食、 镇痛、 学习记忆等。 在调控摄食的过程中, CCK通过外周和中枢两种机制, 抑制摄食[1]。在生理情况下, 当进食时或食物进入胃内及十二指肠后, 对消化道的机械刺激与化学刺激可引起外周CCK释放, 胃扩张刺激与循环血中的CCK与胃迷走神经上的CCK-A受体结合, 转化为神经冲动, 上传至延髓的孤束核(NTS), 进而抑制下丘脑的摄食中枢[2]。资料表明, 以水囊扩张胃及动脉注入CCK-8可分别通过迷走神经I类纤维和Ⅱ类纤维将神经冲动传入中枢; 外源性CCK具有模拟迷走神经兴奋及放大迷走传入活动的作用[3]。关于中枢神经系统高级部位中内源性CCK在摄食调控中参与的作用与机制, 尚未完全明了。本文旨在观察胃扩张的传入冲动对大鼠皮层和边缘系统结构中CCK基因表达的影响, 以期从分子水平上了解中枢高级部位内CCK神经元对与进食有关的消化道传入信息的反应与机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及组织的制备 本工作选用体重200～250g Wistar大鼠10只, 随机分为两组(各5只), 雌雄不拘, 自由饮水, 禁食15 h后, 在20% urethane(1 g/kg, ip)麻醉下, 将气囊经胃大弯切口置入胃体部, 气囊导管连接注射器, 温水注入囊内作扩张刺激。实验组注水5 ml, 扩张10min后断头取脑; 对照组同样手术将气囊置入胃体, 不扩张,10 min后断头取脑。断头前, 经升主动脉先灌注生理盐水, 再灌注含4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸的磷酸缓冲液(PB, pH 7.4, 0.1 mol/L)。取脑固定2 h后, 浸入20%蔗糖磷酸缓冲液中至组织块下沉, -70℃低温冰箱保存待原位杂交。
半定量RT-PCR检测, 设大鼠对照组, 实验组各4只, 雌雄不拘。胃扩张刺激参数同前, 断头取脑, 冰冻分离脑区: 大脑皮层、 海马, 提取总RNA。以总RNA为模板,采用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA。用内参照半定量RT-PCR检测。
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1.2 原位杂交的步骤 本实验所用质粒PUC13来自Michigan大学生化系Dixon,J.E.教授实验室, 含有577个碱基对的CCK cDNA。其中第34～381核苷酸序列编码为前CCK原 (CCK precursor), 319～378核苷酸序列编码为CCK-8。内切酶分别为EcoRI和HindIII。采用氯化钙法进行质粒的转化, 转化所用工程菌为HB101。碱裂解法大量制备质粒, 分别用EcoRI和HindIII内切酶对插入片段进行酶切, 回收采用“V型槽”DNA回收法。用Dig-随机引物标记法, 按照宝灵曼操作手册对cDNA探针进行标记。脑组织以OCT包埋, 冰冻作冠状切片。 切片置含4%多聚甲醛的PBS缓冲液中, 固定10 min后进行原位杂交,具体操作参照Young的方法[4]。
1.3 实验专一性和可靠性检验 为排除实验的假阳性和假阴性, 提高本实验的可信度, 特采取以下步骤: (1)以不含探针的杂交缓冲液取代含Dig-CCK-cDNA探针的杂交液。 (2)以正常羊血清代替羊抗Dig抗体-碱性磷酸酶(AP)复合物。 (3)将酶切质粒的剩余片段标记后取代Dig-CCK-cDNA探针
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1.4 图像分析和数据处理 脑组织经脚间窝进行冠状切片, 实验组与对照组各5张组织片, 对各区内表达CCK mRNA胞体进行记数, 为避免记数时主观因素的影响, 对每张脑片同一脑区记数5次, 取其平均值。 然后每张组织片随机选择10个胞体, 输入到VIDAS-21 (德国)图像分析仪(青岛大学医学院中心实验室提供), 对各区内表达CCK mRNA胞体的截面积(section area, SA)和积分光密度(integral optic density, IOD)进行测量。所得数据经统计学处理后, 求出各组各区每张组织片内表达CCK mRNA神经元的平均数量, 每个表达CCK mRNA神经胞体的积分光密度和平均截面积, 然后作显著性检验, 结果均以(x±s±s)表示。
1.5 半定量RT-PCR检测步骤
1.5.1 CCK基因扩增引物的设计与合成 参照文献[8], 根据大鼠CCK前体基因的全DNA序列, 设计并合成大鼠CCK基因的上下游引物P1及P2(由北京赛百盛生物工程公司合成)。上游引物P1: 5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTC-3(大鼠CCK前体基因第241-260 bp); 下游引物P2: 5-GCGCCGAGGGCTGGCC～CAC-3(大鼠CCK前体基因第379-398 bp), 该PCR扩增产物为一长度为158 bp的DNA片段。
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1.5.2 半定量RT-PCR反应中内参照模板的制备及其引物的合成 参考本院分子病毒重点实验室的HIV1全病毒基因质粒p9b6的DNA序列及大鼠CCK前体基因序列, 设计并合成内参照模板的制备引物P3及P4。 上游引物P3: 5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTCGAGCAGATGATACAGTATTA-3(大鼠CCK前体基因第241-260 bp及HIV1SF2株第3336-3355 bp); 下游引物P4: 5-GCGCCGAGAGGCTGGCCCACGGGAATTTAAG～TACACC-3(大鼠CCK前体基因第379-398 bp及HIV1SF2株第3600-3619 bp)。 上游引物P3的5′末端有一段非HIV DNA序列, 即5-GCTCCCTCTGGCCGGATGTC-3与P1引物序列一致, 下游引物P4的5′末端有一段5-GCGCCGAGGGCTGGCCCAC-3序列与P2引物序列一致。以3μlp9b6质粒为模板, 用P3和P4为引物作PCR扩增, 产物为264 bp的DNA片段。PCR反应条件见后。获得产物200μl, 经PCR纯化试剂纯化后, 溶于1000μl TE中。 此产物可作为半定量PCR反应的内参照模板。
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1.5.3 半定量RT-PCR反应条件 在30μl反应体积中, P1P2分别为100 pmol, 10 buffer 3μl, dNTP各0.2 mmol/L, TaqDNA聚合酶1 U, MgCl2 1.5 mmol/L, cDNA模板4μl, 内参照模板2μl, 扩增条件为94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃ 60 s共35个循环, 最后72℃延伸5 min。取PCR产物10μl于2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 μg/ml)中电泳, 观察158及264 bp条带并在紫外灯下拍照。
1.5.4 大鼠CCK mRNA表达水平的检测 将待测标本的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳后, 经染色并在紫外灯下拍照, 再经VIDAS-21(图像分析系统)进行电泳条带的扫描分析, 得出两条电泳条带的光密度值(见表1)。根据内参照PCR扩增条带(264 bp)扫描密度与CCK待测PCR扩增条带(158 bp)的扫描密度可以推断CCK mRNA相对含量。
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1.5.5 统计学分析 将各组的各条PCR产物电泳条带密度扫描结果参数经平方根反正弦转换后, 做方差分析, 比较实验组和对照组264及158 bp的显示密度差异。
2 结果
2.1 原位杂交法检测对照组大鼠大脑皮层及边缘系统CCK mRNA的表达
2.1.1 分布特点 大鼠嗅内皮质、 梨状皮质、 颞皮质、 海马本部及下丘脑散在分布有CCK mRNA阳性表达细胞,平均每个视野有6～10个阳性表达细胞。在海马内, CCK mRNA阳性胞体仅见于背海马, 以CA1和CA3为主, 且截面积较小, 平均每个视野有1～4个阳性细胞。杏仁核内偶见CCK mRNA阳性胞体。
2.1.2 形态特点 阳性细胞胞质内可见蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物,着色浅淡,与背景反差小,直径10～30 μm,胞核呈空泡状; 细胞形态表现不一,主要为椭圆形和圆形(图1, 见图版Ⅰ)。 图像分析结裹可见, 大鼠阳性胞体截面积和积分光密度较小。
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图1 胃扩张对大鼠大脑皮层和海马神经元CCK mRNA表达的影响
Fig.1 CCK nRNA expression neuron in cerebral cortex and hippcompus of CCK nRNA expressing neurons in normal rat cerebral cortex and hippocampus..Bthe expression of CCK mRNAelevated markedly in rat cerebral cortex and hippocampus afrer gastric distension.CThe expression of CCK nRNA esevated markedly in rat cerebral cortex after hastric distension.DThe expression of CCK nRNA elevated markedly in rat hippocampus after hastric distension.Scale bars:A,B 120μm;C,D 30μm.
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2.2 胃扩张组大鼠大脑皮层及边缘系统中CCK mRNA的表达
2.2.1 分布特点 实验显示, 胃扩张组大鼠CCK mRNA阳性细胞广泛分布于嗅内皮质、 梨状皮质及下丘脑, 平均每个视野有45～55个阳性表达细胞。 海马的CA1和CA3区细胞内CCK mRNA表达显著, 平均每个视野有36～44个阳性表达细胞(P<0.01)。
2.2.2 形态特点 胃扩张时上述脑区内, 90%以上CCK mRNA阳性神经细胞着色深, 轮廓清楚, 与背景对比清晰, 反差明显。胞质内充满呈蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物, 胞核常被密集的酶反应产物所掩盖。胞体大小不等, 直径约10～30 μm。80%以上CCK mRNA阳性神经细胞胞体呈中等大小圆形或卵圆形, 部分呈锥体形。在海马内CCK mRNA阳性胞体主要分布于CA1和CA3区, 并且以多形层分布为主(图2～5)。
2.2.3 图像分析结果 胃扩张时上述脑区CCK mRNA阳性神经细胞截面积和光密度明显增加, 较对照组有显著性差异(P<0.01)。
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图2 胃扩张引起大鼠大脑皮层CCK mRNA阳性神经元积分光密度增加
Fig.2 Increased integral optic density of CCK mRNA positive neurons in cerebral cortex due to gastric distension
**P<0.01.
图3 胃扩张引起海马CCK mRNA阳性神经元积分光密度增加
Fig.3 Increased integral optic density of CCK mRNA positive neurons in hippocampus due to gastric distension
**P<0.01.
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图4 胃扩张引起大鼠大脑皮层CCK mRNA阳性神经元截面积增加
Fig.4 Increased section area of CCK mRNA positive neurons in cerebral cortex due to gastric distension
**P<0.01.
图5 胃扩张引起大鼠海马CCK mRNA阳性神经元截面积增加
Fig.5 Increase of the section area of CCK mRNA positive neurons in hippocampus due to gastric distension
**P<0.01.
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2.3 原位杂交方法的特异性
(1)用不含Dig-CCKcDNA探针的杂交液孵育的标本及用正常羊血清孵育的标本, 未见阳性杂交信号。 (2)用酶切质粒的剩余片段标记后用作杂交探针, 也未检测到阳性杂交信号, 说明实验杂交信号代表CCK mRNA的特异性分布。
本实验结果揭示, 在对照组大鼠的大脑皮层和边缘系统内存在含CCK mRNA神经元, 用ISH法可检测出CCK mRNA在细胞内的基因表达及其对胃扩张刺激产生的变化。
2.4 半定量RT-PCR检测结果
(1)大鼠脑中CCK mRNA半定量RT-PCR检测结果见图6、图7。 每份标本电泳图均可观察到内参基因264 bp扩增条带作为内参照。(2)对照组的大脑皮层、 海马区标本电泳图中可见有158 bp DNA条带, 表明有CCK mRNA表达, 但条带光密度较弱, 说明CCK mRNA表达水平较低(图6)。(3)实验组大脑皮层、 海马标本电泳图中有明显的158 pb DNA扩增条带。 条带光密度较对照组显著增强, CCK mRNA表达水平提高 (见表1)。 可见, A组∶B组, C组∶D组, (A+C)组∶(B+D)组, 参数经平方根反正弦转换后, 经方差分析, 均呈显著差异(P<0.01), 胃扩张实验组大鼠脑区CCK mRNA表达水平明显高于对照组。 提示胃扩张刺激可使大鼠大脑皮层、 海马内CCK mRNA水平明显提高, 与原位杂交法结果一致。
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图6 对照组大鼠大脑皮层、海马的半定量RT-PCR法测定CCK mRNA的表达
Fig.6 Amplification of CCK mRNA from rat cerebral cortex and hippcompus by means of semi-quentitive RT-PCR in control group lanes 1～4: hippcompus; lanes 5～8: cerebral cortex.
图7 胃扩张刺激对大鼠大脑皮层、 海马内半定量RT-PCR法测定CCK mRNA表达的影响
Fig.7 Amplification of CCK mRNA from rat cerebral cortex and hippcompus by means of semi-quentitive RT-PCR in gastric distention group Lane 1:marker;lanes 2～4: hippcompus; lanes 5～8: cerebral cortex.
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表 1 胃扩张对大鼠大脑皮层、海马CCK mRNA表达的影响
Table 1 Effects of gastric distention on CCK mRNA expression by means of RT-PCR
Ratio of optic d0ensity (CCK mRNA / Intercontrol template)
Control group
Gastric distention
Cerebral cortex
(A)
0.46
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(B)
0.81
0.29
0.79
0.21
0.98
0.17
0.96
Hippocampus
(C)
0.19
(D)
0.62
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0.17
0.68
0.20
0.49
0.37
0.65
3 讨论
Crawley 1984年[5]用损伤迷走神经、孤束核、中脑和室旁核的方法, 证明迷走神经可将胃肠道传入信息传到孤束核(NTS), 继而影响下丘脑的摄食中枢和饱中枢。我们的工作发现, 杏仁核和海马参与CCK调节摄食和胃运动的作用[6,7], 核内CCK含量的增加可降低、抑制胃运动, 此作用是通过CCK-A受体而非CCK-B受体实现的, 下丘脑腹内侧核则是此通路中必要的中介环节。可见, 胃扩张刺激可通过中枢内多级传递直至边缘系统高级部位及有关大脑皮层神经元, 参与胃内压、胃运动及摄食抑制的调控。
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80年代以来, 神经分子生物学研究揭示, CCK mRNA广泛存在于哺乳类动物脑内, 大脑皮层、海马等区含量尤高。 Mocchetti[9]认为, 脑区内CCK mRNA的含量可作为可信赖指标, 以监测电性或化学性传入信号对细胞内CCK合成过程的影响, 从而了解CCK参与生理机能调控或神经精神疾病机制的本质。近年[10]Berthoud等工作表明, 胃扩张刺激可引起延髓NTS和迷走神经复合体(DMX)神经元电活动和c-fos表达增强, 胃扩张程度与核内神经原c-fos表达强度呈线性关系,认为NTS、 DMX是接受胃壁机械性感受冲动的二级神经原。
实验进一步表明, 胃扩张刺激可引起大鼠海马和大脑皮层的CCK mRNA阳性神经元数量显著增加, 胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物明显增多。图像分析的结果显示, 细胞的积分光密度和截面积较对照组显著增加, 说明细胞内CCK mRNA表达信号增强, CCK mRNA表达的提高以及相应的CCK合成速度的增加,是胃扩张组阳性神经元体积显著增大的根本原因。PCR法也证明实验组CCK mRNA相对含量显著增加。
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综上所述,中枢神经系统高级部位CCK神经元在胃扩张刺激胃内压增加的情况下, CCK基因转录水平提高,合成速度加快,从而在细胞分子生物学水平证明, 中枢神经高级部位的海马和大脑皮层内源性CCK的生物合成过程参与对胃内压和胃运动的中枢调控机制。
*Corresponding anthor. Tel: 3838480-3757
作者单位:唐明；倪宏；徐珞 青岛大学医学院生理教研室, 青岛 266021
参考文献
[1]Crawley JN, Corwin RL. Biological actions of cholecystokinin. Peptide, 1994, 15: 731～755.
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[3]Schwartz GJ, McHugh PR, Moran TH. Integration of vagal afferent response to gastric loads and cholecystokinin in rats. Am J Physiol, 1991, 261: 1 pt 2.
[4]Young III WS. In situ hybridization histochemical detection of neuropeptide mRNA using DNA and RNA probe. Methods Enzymol, 1989, 168: 702～709.
[5]Crawley JN, Schwaber JS. Abolish of the behavioral effects of cholecystokinin following bilateral radiofrequency lesions of the paraventricular subdivision of the nucleus tractus solitarius. Brain Res. 1984, 295: 289～299.
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[6]Tang M (唐 明), Su HL (苏海灵). Inhibition of gastric motility by microinjection of CCK-8 into rat amygdala. Acta Physiol Sin (生理学报), 1997, 49 (5): 569～574 (in Chinese with English abstract).
[7]Su HL (苏海灵), Tang M (唐 明). The inhibition of CCK-8 on gastric motility mediated by CCK-A receptor in rat hippocampus. Acta Acad Med Qingdao (青岛医学院学报), 1995, 31: 13～15 (in Chinese with English abstract).
[8]Robert JD, Lori JL, et al. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat pre～pro～cholecys～tokinin. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 726～730.
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[9]Ding XZ， Mocchetti I. Dopaminergic regulation of cholecystokinin mRNA content in rat striatum. Mol Brain Res, 1992, 12: 77～83.
[10]Willing AE， Berthoud HR. Gastric distension-induced c-fos expression in catecholaminergic neurons of rat dorsal vagal complex. Am J Physiol，1997, 272: R59～R67.
收稿:1998-11-15
修回:1999-03-02, http://www.100md.com