维护血管内皮功能对心脑血管疾病的重要意义系列研究之二——通心络对家兔血管成形术后Mapk表达的影响及机制
作者简介：曾定尹 教授
1939年11月生，中国医科大学第一临床学院教授、博士生导师。中华医学会心血管病分会常委、中华医学会辽宁省心血管病学会主任委员，任《中华心血管病杂志》、《中国循环杂志》、《中华老年心血管病杂志》及《中国实用内科杂志》编委或常务编委等20多个学术团体职务。1990年率先在东北地区开展冠状动脉成型术及心律失常射频消融术，并多次主持召开全国性心血管病及介入性心脏病学术会议，对推动东北地区心血管病研究学术发展作出积极贡献。完成国家“八五”、“九五”攻关协作课题4项。深入研究中药血脂康、通心络及粉防己碱，阐明其抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血及内皮细胞保护作用机制并获科研成果奖。参与编写《中国急性心肌梗死诊疗指南》及《不稳定型心绞痛诊疗建议》。发表论文100多篇，主编和合著专著5部。培养硕士生30多名，博士生21名。
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文章内容
血管成形术(PTA)后内膜平滑肌细胞(SMC)增殖是再狭窄的重要机制之一。近期研究发现丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)与PTA后内膜增殖的发生密切相关，并参与了再狭窄的发生，不少报道证实在动脉粥样硬化灶内的SMC中及经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后内膜损伤处的SMC 中的发现MAPK活性增高，但其作用机制尚不十分清楚。本研究建立家兔动脉粥样硬化血管成形术模型，旨在探讨血管成形术后MAPK的作用和机制以及通心络对其的影响。
材料与方法
一. 建立动物模型及动物分组
采用高胆固醇喂养加两次动脉拉伤的方法。选日本大耳白兔60只，体重2.5±0.5 kg，月龄6～8个月，由中国医科大学实验动物部提供，单笼、恒温、恒湿饲养。在适应性饲养1周后，随机分为3组：单纯拉伤组、高脂拉伤组和通心络组，每组各20只。单纯拉伤组只喂普通饲料；高脂拉伤组喂普通饲料加胆固醇(1.5g/kg·d)8周，于血管成形术后停用胆固醇，只喂普通饲料；通心络组喂普通饲料加胆固醇(1.5g/kg·d)8周，于血管成形术后停用胆固醇，加用通心络(0.5 g/kg·d，以岭药业股份有限公司提供)4 周。所有动物于喂养4周时经一侧腹动脉用3.5～4.0 mm的球囊进行腹主动脉内皮剥脱，至喂养8周时经另一侧腹动脉在X线下行腹主动脉造影，对造影显示狭窄超过30%的部位用 3.5～4.0 mm的带导丝球囊进行球囊扩张，压力为8～12 kPa，扩张3次，每次 30 s，间隔1 min。共成功建立家兔血管成形术模型52只(单纯拉伤组18只，高脂拉伤组16只，通心络组18只)，因肺炎死亡4只，麻醉意外死亡1只，术中大出血死亡3只。
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二. 标本采集和检测
1. 血生化标本的采集与测定
在高胆固醇喂养前(0周)、动脉拉伤术前(4周)、血管成形术前(8周)及处死前(12周)，分别从耳缘静脉采血测定血脂甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及内皮素(ET)和一氧化氮(NO)。血脂测定使用北京中山生物技术有限公司试剂盒； ET测定使用北京东亚免疫研究所试剂盒； NO测定使用南京建成生物有限公司试剂盒，采用分光光度法测定。
2. 动物处死及标本采集
采用气栓法处死动物，4%多聚甲醛原位血管内膜灌流固定，根据X线照片留取血管成形术部位血管做标本进行相应检测。
3. 血管形态学检测
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病变血管标本固定后经梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，制成蜡块，切片 5 μm厚。HE染色后分组行计算机图像分析，测定管腔面积(LA)、内弹力极包绕面积(IEA)、外弹力极包绕面积(EEA)，再计算出内膜面积(NIA)＝IEA-LA，中膜面积(MA)＝EEA-IEA。
4. MAPK(ERK1，ERK2)的免疫组化染色
石蜡切片，采用标准SABC法，DAB显色，抗体购自美国Santa Cruz 公司，试剂盒为北京中山生物技术有限公司生产。染色后利用计算机图像分析系统测定阳性细胞面积的百分比。
5. MAPK(ERK1、ERK2)的蛋白质印迹(Western Bkot)检测
血管标本剪碎后，用裂解液裂解成乳糜状，再经超声粉碎仪进一步粉碎，采用考马斯亮兰法测定目的蛋白浓度， 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭非特异抗原，加1500的一抗(抗小鼠IgG)4 ℃过夜，再加1500的二抗(ERK1、ERK2鼠抗兔IgG)37 ℃ 2 h；显色液显色15 min，流水终止反应。荧光扫描仪扫描计算ERK1、ERK2的相对含量。
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三. 数据处理
所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间和组内比较采用t检验，以P<0.05判定为有统计学显著性差异。
结果
一. 血生化测定结果
1. 血脂水平的变化
与单纯拉伤组相比，高脂拉伤组和通心络组TC、LDL-C、TG明显升高； HDL-C升高不明显。12周时，通心络组TC、LDL-C较高脂拉伤组明显下降(P<0.05)，但TG和HDL-C变化不明显。见表1。
表1 各组血脂水平变化(mmol/L)
项目
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组别
实验0周
实验4周
实验8周
实验12周
TG
单纯拉伤组(n=18)
0.83±0.29
0.78±0.13
0.98±0.54
0.82±0.16
高脂拉伤组(n=16)
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0.85±0.25
1.10±0.21*
1.28±0.62*
0.98±0.31
通心络组(n=18)
0.84±0.06
1.12±0.17*
1.17±0.03*
0.84±0.02
TG
单纯拉伤组(n=18)
1.48±0.54
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1.22±0.68
1.12±0.34
1.09±0.03
高脂拉伤组(n=16)
1.46±0.04
8.57±0.46*
17.89±0.72*
4.77±0.08*
通心络组(n=18)
1.42±0.06
8.38±0.50*
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1.32±0.06#
HDL-G
单纯拉伤组(n=18)
0.51±0.13
0.43±0.15
0.44±0.13
0.43±0.16
高脂拉伤组(n=16)
0.60±0.12
1.45±0.86*
0.84±0.42*
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0.43±0.11
通心络组(n=18)
0.53±0.18
1.45±0.56*
0.83±0.12
0.49±0.01
LDL-G
单纯拉伤组(n=18)
0.57±0.02
0.58±0.02
0.61±0.03
0.59±0.01
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高脂拉伤组(n=16)
0.57±0.04
3.52±0.08*
9.08±0.27*
2.62±0.04*
通心络组(n=18)
0.52±0.03
4.89±0.76
8.92±0.97*
0.96±0.04*
注：*与单纯拉伤组相比
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p<0.05；#与高脂拉伤组相比p<0.05。
2. ET和 NO水平的变化
与单纯拉伤组相比，高脂拉伤组和通心络组ET水平0周、4周、8周呈逐渐升高趋势，两组间无显著差异；到12周时通心络组ET水平下降与高脂拉伤组相比差异显著(P<0.05)。而NO水平则正好相反，与单纯拉伤组相比，高脂拉伤组和通心络组NO水平均呈下降趋势，两组间无显著差异，至12周时通心络组NO水平则明显升高，与高脂拉伤组差异显著(P<0.05)。见表2。
表2
各组ET和NO水平变化
项目
组别
实验0周
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实验4周
实验8周
实验12周
ET(pg/ml)
单纯拉伤组(n=18)
218.40±6.60
223.95±5.30
241.31±4.54
252.22±18.80
高脂拉伤组(n=16)
216.12±7.09
265.19±6.62*
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303.17±3.16*
291.19±8.22*
通心络组(n=18)
226.61±4.89
271.70±8.61*
304.64±3.70
240.88±9.80*#
NO
(μmol/L)
单纯拉伤组(n=18)
178.80±2.40
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169.31±6.22
165.50±2.30
170.75±2.52
高脂拉伤组(n=16)
172.76±7.73
148.88±3.89*
121.49±1.23*
129.88±1.66*
通心络组(n=18)
172.36±3.47
144.29±4.97*
128.39±0.94*
164.20±2.70*#
注：*与单纯拉伤组相比
p<0.05；#与高脂拉伤组相比p<0.05。, 百拇医药(中国医科大学第一临床学院心内科 曾定尹 张子新 王绽菲)