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2002年中华医学科技奖一等奖获奖项目回眸
http://www.100md.com 2003年2月20日 《中国医学论坛报》 2003年第7期
     建立α与β珠蛋白基因簇转基因鼠模型及β基因簇反式因子的研究

    中国医学科学院基础医学研究所

    α与β珠蛋白基因的表达调控,对我国常见的遗传病——地中海贫血的防治,具有重要意义。研究者以组建α与β珠蛋白基因簇的转基因鼠模型为切入点,进行了研究。

    一、建立了细菌人工染色体(BAC)介导的含完整人α-珠蛋白基因簇(110kb)转基因鼠的模型,包括三个含完整人α-珠蛋白基因簇,具组织特异性和胚胎发育阶段特异性表达的独立株系,各株系间的表达水平存在一定差异(是鼠内源珠蛋白表达水平的17%~68%)。

    二、建立BAC介导的含完整人β-珠蛋白基因簇(160kb)的转基因鼠模型。各株系表达水平相当于鼠内源珠蛋白质表达水平的60%~68%,显示了一定的整合位点不依赖性表达。从鼠模型发现α与β珠蛋白基因的表达均呈正常发育模式,但α珠蛋白基因簇的表达水平和发育模式对其上游调控序列的依赖性低于β珠蛋白基因簇对上游基因座控制区(LCR)的依赖性,提示两类基因簇均按孟德尔定律遗传,在LCR及其局部染色质环境均存在较明显差异。
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    三、建立含5’高敏感位点2(HS2)的人β41/42珠蛋白基因的转基因鼠模型,发现整合有13拷贝5’HS2

    β41/42的转基因鼠中,外源基因平均表达量只相当于鼠内源α-珠蛋白的1.9%,但纯合子转基因鼠未见严重β-地中海贫血病人典型的血液学特征。

    四、在β-珠蛋白基因簇LCR和β-珠蛋白基因启动子间相互作用研究中,用连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)与体内足迹法,观察不同来源细胞系中LCR的HS2、HS3.5与β-珠蛋白基因启动子的DNA-蛋白质相互作用,发现LCR与启动子共同参与β-珠蛋白基因的发育调控,且LCR各HS发挥功能需其核心和旁侧序列共同存在。 五、鉴于所建α、β珠蛋白基因簇转基因鼠模型,可模拟体内天然染色质微环境,有助于整体理解并系统认识两类珠蛋白基因表达从胚胎至胎儿直至成人期转换的作用机制。在此基础上,经BAC载体,对α和β珠蛋白基因簇予以修饰,建立相应的突变体转基因鼠模型,辅以其它分析蛋白质-DNA相互作用的新方法,为深入研究两个基因簇中顺式调控元件与反式因子间作用、揭示多个顺式调控元件功能及α和β基因簇表达终末产物始终维持平衡机制等问题具重要指导意义,从而为最终阐明红系遗传与分化的基本规律奠定理论基础。该理论将为重型地中海贫血的基因治疗方案提供重要依据。
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    胸主动脉瘤外科治疗新技术的临床应用研究

    中国医学科学院阜外心血管病医院

    1994年起收治主动脉瘤及主动脉夹层患者530例,平均年龄42.35±11.85岁(8~74岁)。其中主动脉瘤306例,主动脉夹层224例。手术30天死亡率4.34%(23/530例),术后早期并发症发生率13.02%(69/530例)。随诊484例,平均随诊时间46.4个月(6~72个月)。因手术技术改进,各类主动脉瘤手术效果较前期明显提高。

    一、各类胸主动脉瘤手术中的新技术

    (一)经右腋动脉插管,体外循环及选择性脑灌注,针对累及主动脉弓部的动脉瘤进行手术治疗。简便、安全,可有效防止脑部并发症。

    (二)对冠状动脉开口移位< 1 cm的病例,选择性地应用“城门洞法”冠脉吻合术,避免了主动脉根部替换术时大出血并发症。
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    (三)血泵法自体血回收股动脉输入,使胸降主动脉瘤和DeBakey III型主动脉夹层手术更安全,避免了截瘫并发症,减少了用血量。

    (四)胸骨上段小切口主动脉根部替换术和胸骨下段小切口主动脉根部替换术成功,体现了微创外科理念。

    (五)改进保留主动脉瓣膜的根部替换术(David手术),制订了适合国人的手术适应证及方法。

    二、主动脉夹层手术中的新技术

    (一)提出I型夹层近端主动脉病变的分类法,对决定手术方式及判断预后具指导意义。

    (二)提出Ⅲ型夹层主动脉病变新的分类法,便于制订手术适应证及选择基本方法。

    (三)应用“象鼻技术”,成功地治疗DeBakey I型主动脉夹层,提出国人象鼻技术治疗DeBakey I型主动脉夹层的手术适应证、方法及围手术期脑和脊髓的保护措施。
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    (四)应用根部替换、升弓部替换及“象鼻技术”同期手术成功,提出国人用象鼻技术联合主动脉根部替换治疗复杂主动脉夹层的手术适应证、方法及围手术期脑和脊髓的保护措施。

    三、合并症同期手术的技术要点

    (一)提出合并症同期手术的适应证。

    (二)确定不同合并症的手术原则。合并心内畸形时,用上下腔静脉插管;合并主动脉缩窄时用升主动脉(或右锁骨下动脉)和右股动脉双插管;弓降部动脉瘤合并主动脉病变应先正中切口,体外循环下换瓣,再做侧切口,阻断胸主动脉下切除动脉瘤;开腹手术者,先在非体外循环下完成腹部操作后,在体外循环下完成升弓部主动脉手术。积极处理马凡综合征合并的二尖瓣闭锁不全,轻-中度关闭不全者行成形术,以加用人工环为佳,而重度关闭不全应作换瓣术;合并冠状动脉病变应同期作搭桥术,先吻合远心端,再行升弓部主动脉手术后,将近心端与升主动脉人工血管相吻合。
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    四、再次及多次手术

    一手术原因:1.不同部位多发的动脉瘤或夹层;2.其它部位再发的动脉瘤或夹层;3.残余夹层进一步发展;4.术后感染;5.第一次手术时未处理扩张的主动脉,术后出现动脉瘤或夹层。

    (二)防治措施:1.术后综合治疗,将血压控制在正常水平;2.首次手术应尽量切除I、Ⅱ型夹层病变的主动脉,远端开放吻合,弓部及弓降部扩张较明显者行象鼻手术;3.主动脉瓣病变合并升主动脉扩张至4 cm时,应积极处理;4.再次手术时病变不在原手术部位的多发动脉瘤或再发于其它部位的主动脉病变,手术治疗原则与第一次相同;5.升弓部再次手术的最大风险之一是开胸时大出血,劈开胸骨前先行股动静脉心肺转流(CPB)。

    五、临床研究——经右腋动脉(RXA)插管体外循环及选择性脑灌注(SCP)技术的临床研究

    1994年1月~1998年6月用此技术完成70例累及主动脉弓部手术。无围术期死亡,无严重脑并发症。1例患者出院后2个月因双下肢动脉栓塞引起肾功能衰竭而死亡,全组其他患者均恢复健康出院。
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    结果提示:1.单一右腋动脉插管可以满足体外循环和选择性脑灌注的需要,简化了手术操作步骤,避免了因切开头臂血管而引起脑栓塞并发症;2.脑灌注的最佳要求是:鼻咽温度在20~25℃,体外循环流量为5~k0 mk/kg/min。

    高转移人肝癌裸鼠模型和细胞系的研究

    复旦大学附属中山医院

    一、建立模型及细胞系

    (一)高转移人肝癌裸鼠模型(LCI-D20)。30例人肝细胞癌瘤组织小块,原位移植于BALB/c-nu/nu裸鼠肝脏,经裸鼠体内传代筛选后获得。LCI-D20移植潜伏期1周,传代间期为20天,移植成功率100%,转移率(肺、肝内及腹腔淋巴结)100%,已在裸鼠体内传代近6年,鼠间肝内传代120代,皮下传代103代。生物学特性、病理学、染色体核型分析等证明,该移植瘤细胞与源于人肝癌细胞相似,核型为三倍体,生长及转移方式类似人肝癌,表现为浸润性生长、血道转移(肝内及肺转移)、淋巴道转移和种植性转移,晚期宿主全身衰竭伴血性腹水。免疫组化证实LCI-D20细胞分泌AFP、HBsAg(+)。
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    (二)低转移人肝癌裸鼠模型(LCI-D35)。与LCI-D20相同方法,将化疗4次后的人癌组织小块,BALB/c-nu/nu裸小鼠肝内移植后获得。潜伏期3周,移植成功率100%。传代间期35天,已在肝内传59代,皮下传60代,仍具原有人肝癌的生物学特性,肿瘤细胞核型为二倍体。移植瘤呈膨胀性生长,不侵袭肝及其周围脏器。解剖及组织学检查未见器官转移。

    (三)高转移人肝癌细胞系MHCC97。用LCI-D20模型的皮下移植瘤细胞悬液,10%人AB型血清的高糖DMEM培养液培养,以裸鼠体内培养与体外培养交替进行,78次后成功建系。MHCC97为典型多边形上皮细胞,符合一般上皮性恶性肿瘤细胞的病理学特征。MHCC97细胞为异倍体细胞,染色体均数为超二倍体,染色体数59~65不等。染色体众数60条和61条占总数的73%,标记染色体为i1q和der4pter→q35::﹖,无完整Y染色体。细胞倍增时间约31小时,集落形成率17%,分泌AFP,用不同代细胞悬液0.2 mk(106~107个细胞),裸鼠原位及肝内注射后,潜伏期15~20天,肿瘤生长率100%,自发转移率100%。该细胞基本生物特性稳定,已在体外连续传代2年,传120代后冻存。
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    二、与模型相关的生物学特性

    (一)从p53突变、c-fos、N-ras、CD44和nm23-H1等观察,发现与侵袭性相关者LCI-D20模型大多表达,而LCI-35则多不表达,提示LCI-D20模型具高转移特性。

    (二)发现LCI-D20的N-乙酰葡萄糖胺基转移酶(GnTV)活性明显高于LCI-D35,提示GnTV活性与肝癌转移有关。

    (三)发现细胞间黏附分子(ICAM-1)在LCI-D20模型中,随瘤体增大而上升,当肝癌发生转移时,突然明显升高。有转移者ICAM-1明显高于未转移者。

    (四)从BALB/cA裸鼠角膜微囊模型,发现接种LCI-D20细胞的角膜,其癌周出现较多肿瘤血管,而接种LCI-D35癌细胞角膜的肿瘤血管较少,提示高转移模型的癌细胞可诱导肿瘤血管增多。
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    (五)比较基因组杂交技术(CGH)证实8q缺失是与转移相关的诸多染色体缺失的重要原因。

    (六)发现MHCC97细胞表达uPA-R受体、原癌基因c-Met等,但不表达转移抑制因子如E-钙粘素等。

    (七)MHCC97细胞中存在p53第249位密码子的突变,可能与肝癌转移有关。

    三、LCI-D20模型的实验性干预

    为寻找复发转移的预测指标及防治措施,用LCI-D20模型进行实验性干预。

    (一)用反义H-ras寡核苷酸、反义血管内皮生长因子(VEGF)、突变型fik-1(VEGF受体)、基因转染等技术观察复发转移时的动态变化。

    (二)观察金属蛋白酶抑制剂BB94、肝素等的干预作用。
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    (三)观察ICAM-1、抑制剂β肽的干预机制。

    (四)观察苏拉明、内皮抑素、干扰素α1b等抗肿瘤血管生成的作用。

    (五)卡培他滨对LCI-D20模型肝癌切除后有预防复发及转移作用。且治疗后PD-ECGF表达下降,肿瘤血管的生成减少。顺铂与内皮抑素合用有协同作用。

    (六)观察全反式维甲酸、细胞分化诱导剂(CDA-Ⅱ)的干预效果。上述干预治疗,除维甲酸未见明显疗效外,其它干预实验均有不同程度效果,其中干扰素α1b已进入随机分组临床观察,获较好疗效。

    老年性痴呆骨架蛋白异常修饰及其机制

    华中科技大学同济医学院 一、探索老年性痴呆(AD)患者微管相关蛋白tau蛋白有无磷酸化以外的异常修饰及其在AD发病中的作用时,发现AD患者异常磷酸化的tau蛋白被异常糖基化。异常糖基化在双螺旋丝的螺旋结构形成和稳定中起重要作用。
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    二、发现并提出蛋白磷酸酯酶(PP)-2A可能是AD患者tau蛋白异常磷酸化的关键性磷酸酯酶,并提出AD患者tau蛋白病理学的可预防性理论。

    三、(一)发现特定蛋白激酶联合使用可促进tau蛋白的AD样异常磷酸化,而蛋白质的磷酸化平衡,受蛋白磷酸酯酶和蛋白激酶的双重调节。(二)根据研究结果及tau蛋白在体内暴露于数种蛋白激酶的状况,建立了两种蛋白激酶联合磷酸化tau蛋白的技术。(三)发现蛋白激酶A(PKA)和糖元合酶激酶-3(GSK-3)联用可增强tau蛋白的磷酸化作用,而钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡCaMKⅡ与GSK-3联合磷酸化的tau蛋白则完全丧失其生物学活性。(四)以免疫印迹技术,利用磷酸化神经细丝(NF)与tau蛋白分子量的差异,证实AD患者脑脊液中磷酸化NF含量增高,表明NF含量增高并非信使核糖核酸(mRNA)水平升高所致。(五)用人神经瘤细胞株(SH-SYSY)复制AD样磷酸酯酶缺陷。发现抑制蛋白磷酸酯酶可提高人神经瘤细胞内钙离子浓度,并出现AD样神经细丝过度磷酸化和胞体聚积、细胞骨架破坏及活性降低,为建立AD实验模型奠定了基础。
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    有关肝外科手术的系列研究和技术改进

    华中科技大学同济医学院附属同济医院

    一、常温下肝缺血的“安全时限”

    (一)健康家兔56只,分5组,按30、45、60、90、120分钟5个时段,观察术前及术后1~10天血胆红质、血清谷丙转氨酶(SGPT)等生化指征,肝血流阻断前、后肝及胃肠道组织大体变化。发现常温下阻断家兔肝门的安全时限为60分钟。

    (二)1980年~1989年,常温下长时间(20~60分钟)阻断入肝血流作肝切除术46例,限时性阻断入肝血流(20分钟以下)作肝切除术35例,其中原发性肝癌共45例。术后两组共81例切肝患者均无手术死亡,提示常温下人入肝血流阻断的最大耐受时限可能超过40~60分钟。

    二、不解剖肝门作规则性肝切除术
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    (一)1988年1月~1997年12月,用直接结扎右侧入肝和出肝血管施行右侧肝切除术,切除右半肝29例,右后叶切除38例,全组无手术死亡,术中出血量510±270 mk,其中2例患者未输血,总手术时间最短的1例右半肝切除术仅45分钟。

    (二)1988年1月~1997年12月,用不解剖肝门预结扎出入肝血管行左半肝切除42例,左外叶切除76例,全组无手术死亡,总手术时间最短者仅25分钟,术中出血量240±150 mk,其中41例患者术中无输血。

    三、巨大肝癌切除术

    (一)1987年~1993年,作巨大肝癌切除术38例,平均年龄29岁。手术方式包括肝右三叶切除3例,右半肝切除16例,左三叶切除2例,左半肝切除8例等。切除肿瘤最大为32 cm×15 cm×14 cm,标本湿重750 g~5000 g。全组术后30天内无死亡,术后并发症包括右侧胸腔积液14例,膈下感染1例,少量胆瘘1例。SGPT均在术后3周内降至正常。全组病例中有6例仍生存,术后各生存34、20、17、11、8和7个月。本组病例术后1、2、3年生存率各为63%、10.5%和5.3%,提示巨大肝癌切除术延长生命效果明显。
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    (二)切除巨大肝癌171例,其中男性152例,女性19例,同时伴膈肌、肾上腺、胃、结肠和脾切除者各6、3、2、2、7例,肿瘤体积13.7±2.2 cm,切除肝标本湿重855±67 g,术后1个月内无死亡,术后1、2、3、5、10年生存率各为66.1%、42.1%、32.7%、12.2%及2.3%。提示巨大原发性肝癌作肝切除是有效的。

    四、肝段切除

    (一)1987年10月~1989年7月,作各种肝段(包括I~Ⅷ段)切除术120例,术中平均输血670 mk。术后死亡1例为原发性肝癌伴肝硬化合并糖尿病者。81例原发性肝癌除9例平均生存10.8个月外其余病例生存情况良好。

    二1987年10月~1992年12月,作各类肝段切除术211例,其中原发性肝癌136例,转移性肝癌11例;年龄8岁~69岁,平均39岁。切肝时,135例用常温下完全阻断入肝血流法控制出血,其中22例阻断血流20分钟~60分钟(长时间组),113例为2分钟~19分钟(限时间组),46例为5分钟~18分钟(选择性阻断组)。全组术中无死亡,术后死亡2例。术后并发症包括反应性胸腔积液19例,肝性脑病2例,膈下感染3例,胆瘘3例,经保守治疗均痊愈。
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    五、肝外伤非手术治疗 (一)从1955年1月~1992年12月收治207例肝损伤患者(2岁~65岁)。非手术治疗11例均获成功,提出用于外伤非手术治疗指征为:B超或CT确定I~Ⅱ级肝损伤,无其它内脏合并伤,脉率低于100次/分,收缩压在12kPa以上,神志清楚无腹膜炎体征。

    (二)家兔放射性核素显像实验,以腹部血池图像诊断肝外伤持续性出血,敏感度为95%(19/20)、特异性100%,漏诊率5%(1/20),可较准确地判断肝破裂有无持续性出血。

    帕金森病病因的分子遗传学研究中山大学附属第一医院

    首都医科大学宣武医院
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    一、遗传流行病学。1989年在广州中山大学第一附属医院门诊或住院的846例帕金森病(PD)患者中,进行环境危险因素-对照研究,确定PD遗传度约为40%,结合头发中锰、铜、铅、镉和汞元素含量检测,提出遗传因素可能是PD发病的易感因素,PD发病是由遗传易感性、神经系统老化和环境危险因素三者共同作用的结果,原发性PD患者可能存在锰代谢缺陷。

    二、分子遗传学。从PD易感基因多态性及家族性PD的致病基因突变及其多态性与散发性PD间的相互关系,进行了探索。

    (一)100例41~79岁特发性PD患者与100名正常人静脉血用Xba I限制性片段长度多态性(RFLP)和聚合酶链反应PCR-RFLP技术,发现解毒酶细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因突变与PD发病具相关性,二相解毒酶GSTM与CYP2D6共存时,患病危险性提高6倍,证实机体内、外源性毒素解毒酶基因缺陷提高PD患病的危险性。从相同环境中仅部分人患病的状况,说明PD遗传异质性、病因复杂性及基因与基因相互间的作用,为深入探索机体复杂的解毒系统在PD发病中的作用提供了依据。 (二)经对171例原发性PD患者多巴胺代谢酶系统研究,发现单胺氧化酶B(MAO-B)基因多态性与PD无明显相关性,NADPH醌氧化酶、儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)基因多态性与PD有一定相关性,提出COMT酶活性均衡性在PD发病中的保护作用。发现多巴胺转运蛋白(DAT)基因上游重复序列多态性,增加多种类似多巴胺环境毒素(MPTP)的黑质细胞毒性而导致PD;多巴胺受体在多巴胺信号传导和多巴胺药物治疗中引起的运动障碍具重要作用,特别是多巴胺基因多态性与药物副作用相互关系的研究,对早诊PD、选用多巴类药物治疗具重要意义。

    (三)提出中国人早发性PD中常见Parkin基因突变,报告部分新突变如2号、5号外显子缺失突变及1号、2号外显子的点突变。还报告了中国人散发性PD中未发现家族性PD致病基因a-synuckein突变基因。, http://www.100md.com