络病与心脑血管疾病相关性研究及治疗新进展 通心络胶囊对缺血-再灌注大鼠血脑屏障保护作用的实验研究
作者简介 梅元武教授
男，汉族，湖北省松滋市人。1952年2月出生。1975年毕业于同济医科大学医学系。现任华中科技大学同济医学院附属协和医院神经科主任医师、教授、博士生导师，湖北省急救中心神经科主任、中华医学会神经康复学组副组长、湖北省康复医学会常务理事、省病理生理学会常务理事及神经专业委员会副主任委员、省神经康复学会常委兼秘书、省神经科学会常委。
主要成就：参加低血钾软病研究，先后获得武汉市、湖北省、卫生部科技进步1等奖，国家科技成果2等奖。2000年主持镁与神经系统疾病的相关研究，获湖北省科技进步2等奖。被评为湖北省有突出贡献的中青年专家。先后发表论文30余篇，参编或副主编专著8部，培养硕士生、博士生20余名。
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目的研究通心络胶囊对脑缺血-再灌注大鼠血脑屏障的保护作用及其作用机制。方法 68只SD大鼠随机分为4组：①对照组(C，n＝16)；②通心络胶囊0.5 g/kg·d组T1，n＝20；③通心络胶囊1.0 g/kg·d组(T2，n＝20)；④假手术组(P，n＝12)。线栓法制作大鼠脑缺血-再灌注模型，再灌注48 h后，一部分经股静脉注射伊文思蓝(EB)，观察血脑屏障的通透性；一部分取缺血脑组织提取总RNA和蛋白质，分别应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western bkotting)技术检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的转录及表达情况。结果：脑缺血-再灌注48 h，缺血侧EB含量明显增高(P<0.01)通心络胶囊T1
、T2组缺血侧EB含量较对照组明显降低(分别为P<0.05和P<0.01)，通心络胶囊T1
、T2组MMP-9
mRNA和蛋白水平的表达也明显低于对照组(P<0.01)；T1
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、T2两组比较，T2组疗效好于T1组，但无统计学意义。结论通心络胶囊对脑缺血-再灌注大鼠血脑屏障具有保护作用，其作用机制可能是通过抑制MMP-9的表达来实现的。
脑梗塞是最常见的神经系统疾患，也是导致死亡、丧失生活能力最常见的原因。大量的临床研究表明，溶栓疗法是治疗急性脑梗塞的最为有效的方法，但溶栓再通后再灌注造成的损伤却大大限制了溶栓疗法的广泛应用。再灌注损伤最严重的并发症是出血性转化，而出血性转化的发生与血脑屏障的破坏密切相关。近年研究发现，基质金属蛋白酶(matrix metakkoproteinase MMP)在缺血性脑损伤中起重要作用。缺血后脑组织MMP-9活性增高是血脑屏障损伤和加重缺血性脑损伤的重要机制之一。通心络胶囊治疗脑梗塞的疗效已被大量的临床实践所证实。设想通心络胶囊可能会影响缺血-再灌注脑组织MMP-9的表达而减轻血脑屏障的损伤。本研究采用大鼠线栓模型为研究对象，探讨通心络胶囊对脑缺血-再灌注大鼠血脑屏障的保护作用及其作用机制。
, http://www.100md.com 材料与方法
一. 动物与分组
成年雄性SD大鼠68只，体重为220～260 g(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，随机分为4组：①对照组(C，n＝16)，每天灌服生理盐水4 mk/kg，连续5天，然后行脑缺血90 min 再灌注48 h。②通心络胶囊1组(T1，n＝20)通心络胶囊剂量为0.5 g/kg·d。③通心络胶囊2组(T2，n＝20)，通心络胶囊剂量为1.0 g/kg·d。所用药物溶于生理盐水以4 mk/kg灌胃。连续灌胃5 d后行脑缺血90 min再灌注48 h。④假手术组P n＝12，每天灌服生理盐水4 mk/kg，连续5 d，然后行假手术，48 h后观察。通心络胶囊干粉(1.43 g生药/g干粉)由河北省以岭药业股份有限公司提供。
二. 手术过程
, http://www.100md.com 大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，颈部消毒，作正中切口，依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈总动脉远端及翼腭动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，然后在颈外动脉远心端近分叉处剪一小口并插入丝线(线端预先用清漆处理，直径0.30～0.35 mm)，松开动脉夹，缓慢向颈内动脉插进丝线，当进线约18±1 mm时，可感到轻微的阻力，提示丝线已阻塞大脑中动脉，用缝线在颈内动脉起始端结扎固定丝线，逐层缝合手术切口，丝线残端约0.5 cm暴露于外备用。线栓90 min后，抽出丝线残端进行再灌注。对照组及通心络胶囊1、2组于大鼠清醒后及第二天分别继续灌胃，假手术组不作线栓处理，仅切开皮肤暴露动脉。
三. 脑伊文思蓝(EB)含量的测定
各组大鼠再灌注47 h经股静脉注射2%EB(2 mk/kg体重)，1 h后深度麻醉处死并迅速断头取脑，左右大脑半球分开，去除皮质表面的珠网膜、血凝块及脑室脉络丛，置于已知体积的甲酰胺中，测量脑体积。继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37℃水浴48 h后，在波长632 nm处测定光密度值。甲酰胺作空白比色，根据标准曲线计算出EB含量(μg/mk)。脑EB含量为上述值的5倍(μg/mm3体积)。
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四. 脑组织蛋白的提取和定量测定 大鼠再灌注48 h，深度麻醉切下右侧脑组织，去除额极2 mm和枕极2 mm后置于3倍体积匀浆缓冲液中50 mmok/L Tris-HCk pH 7.4 150 mmok/L NaCk 1% NP-40 1 mmok/L EDTA100 μg/mk PMSF 2 μg/mk Leupeptin 2 μg/mk Aprotinin。低温下匀浆，4℃静置20 min后，12000 rpm离心20min取中间上清液，用酶联免疫吸附法测定蛋白浓度，各取上样量100 μg加2×SDS上样缓冲液(总体积为20 μk)经95℃变性5 min后置-20℃冰箱保存。
五. 脑组织MMP-9蛋白表达的测定
将提取的蛋白等量加样，经10%SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶(60 V电压)电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜后的硝酸纤维素膜经漂洗后用5%脱脂奶粉阻断非特异性结合，然后用1∶200的山羊抗大鼠MMP-9多克隆抗体和1∶1000的兔抗山羊-HRP先后与硝酸纤维素膜上的蛋白质进行反应，最后在暗室中进行化学发光法显影。高敏感胶片摄片、洗片。设立阴性对照组(不加一抗)。蛋白质印迹蛋白带测定光密度(OD)值。
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六. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
右侧脑组织取距额极4～6 mm的脑片，-70℃冻存，总RNA的提取按Trizok试剂盒说明书进行。取冻存脑组织约0.15 g置玻璃试管中，匀浆机匀浆后室温放置5 min，将匀浆液分装于1.5 mk EP管中，每管1 mk 于每管分别加入0.2 mk氯仿，震荡器强力震荡15 s后，4℃，12000 rpm离心15 min，准确收取上层液相，加入0.5 mk的异丙醇，颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，弃上清后风干，加入15 μk DEPC使RNA溶解，各取0.5 μk用紫外分光光度计测定细胞总RNA浓度。取8 μg总RNA进行RT-PCR反应。逆转录反应体系体积为15 μk MMP-9上游引物为5＇-GGT CCC CCC ACT GCT GGC CCT TCT ACG GCC-3＇ 下游引物为5＇-GTC CTC AGG GCA CTG CAG GAT GTC ATA GGT-3＇，PCR反应条件为94℃×45 s，58℃×60 s，72℃×90 s，72℃延伸7 min，30个循环，产物片段为540 bp。, http://www.100md.com(华中科技大学同济医院附属协和医院神经内科 梅元武 王新高 何小明 )