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第二节 甘油三酯测定
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

甘油三酯又称中性脂肪,由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸,相应称为甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)和甘油一酯(MG)。血清中90%~95%是TG,TG中结合的脂肪酸分别为油酸(44%)、软脂酸(26%)、亚油酸(16%)和棕榈油酸(7%)。

血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

血清中TG的化学组成并不单一,准确求其分子较为困难。因标准不同,测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807.3)、三油精(分子量895.4)为标准,按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

1.化学法

化学测定法包括:①TG的抽提分离;②皂化;③甘油糖的氧化;④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。操作较为繁杂,影响测定因素太多,本法准确性差,一般很少用。

2.酶法测定

酶法测定包括:①TG的抽提与皂化;②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶(glycerol kinase,GK)法和甘油氧化酶(glycerol Oxidase,GOD)法。操作简便,快速准确,并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

一、乙酰丙酮法

1.原理

血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯,经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸,甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛,在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3,5二乙酰,1,4二氢甲基吡啶,其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比,420nm测定定量。该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。

2.试剂组成

代号种类浓度组成贮2-8℃有效时间
R1抽提液(CH3)CHOH(A.R)重蒸馏
R2吸附剂 氧化铝,水洗除去微细颗粒,
110℃烤干3h以上
闭封一周
R3皂化剂5%KOH 5g+H2O→100ml
R4醋酸溶液2mol/LCH3COOH 11.5ml+H2O→100ml
R5过碘酸钠0.05mol/LNaIO4 1.07g+H2O→100ml
R6氧化剂 R4 1体积+R51体积 一周
R7醋酸铵液 CH3COONH2 15.4g+H2O→100ml
R8显色剂CH3COCH2COCH30.75ml+R-1
40ml+R-7 100ml+R-4 80ml
R9参考液2mg/dl三油酸甘油酯

2mg+R-1→100ml(TG100mg/dl)

3.操作

按图15-3操作。

图15-3 血清甘油三酯(乙酯丙酮法)测定操作图

4.计算

血清TG浓度=ESA/EST×1.13(mmol/L)

二、酶法(GK-GPO-POD比色法)

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸,甘油在甘油激酶(GK)及ATP存在下,生成3-磷酸甘油,尔后,在磷酸甘油氧化酶(GPO)作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2,H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶(POD)作用下,生成红色亚醌化合物(quinoneimine),比色(500nm),其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。

(一)手工测定法

1.试剂组成

代号种类浓度贮存2~8℃
R1磷酸甘油氧化酶≥3.0KU/L冷藏
(A液)抗坏血酸氧化酶≥1.0KU/L
甘油激酶≥0.7KU/L
4-氨基安替比林80mg/L
R2脂蛋白脂酶≥2.0KU/L冷藏
过氧化物酶≥10KU/L
ESPAS300mg/L
R3(参考液)甘油酸三脂200mg/dl(2.26mmol/L)冷藏

*:一般采用商品试剂盒

图15-4 血清甘油三酯测定法(酶法)操作图

2.操作

按图15-4操作。

3.计算

血清TG浓度=ESA/EST×2.26(mmol/L)

(二)生化分析仪检测

全自动生化分析仪测定操作(以CL-7200型为例)。

1.试剂

A液:GK,GPO,4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。

B液:POD,Lipase,ESPAS等。

标准液:甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。

2.上机参数

名称参数
方法终点法
波长双波长(540nm 700nm)
试剂A反应时间2~3min
试剂B反应时间5~6min
反应温度37℃
样本用量4μl
试剂A用量200μl
试剂B用量100μl
单位mmol/L

3.操作过程

4.计算

以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算,自动打印结果。

5.注意事项

①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

②试剂在有效期内2~8℃避光保存。

③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。