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编号:10169004
第三节 磷脂测定
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

磷脂(PL)并非单一的化合物,其分子内含有磷酸基的多种脂质,磷脂是这一类物质的总称。血中PL包括:①卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%~10%;②磷脂酰乙醇胺等,占2%;③鞘磷脂,占20%。

血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。

1.化学测定法过程包括:①抽提分离;②灰化;③显色、比色的三个阶段。

2.酶测定法

可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用,加水分解,测定其产物,对PL进行定量。一般多采用磷脂酶D(PL-D)进行定量。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂,这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。本法快速准确,便于自动生化分析仪器进行批量检测。

一、化学法(消化法)

1.原理

以有机混合试剂(无水乙醇、乙醇)抽提血清中磷脂,再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物,用硝酸盐与磷反应生成有色化合物,比色定量。本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。

2.试剂组成

代号种类浓度组成贮2~8℃有效时间
R-1抽提液无水乙醇:乙醇=3:1
R-2消化液用1L密器,加水约500ml,置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中,冷却后加过氯酸(70%,AR)65ml,混匀,加蒸馏水至1000ml
R-3显色剂钼酸铵(A.R)2.5g+无水醋酸钠8.2g,加蒸馏水溶解并稀释至1L,监用时取此液体9份加新配的VitC液(10%)1份,混合即可
R-4参考液(贮存液)1mg/L 称干燥KH2PO(A.R)0.4393g,溶于蒸馏水中,转移至100ml的容量中,用蒸馏水加至刻度。冷藏
R-5参考应用液0.04mg/ml取贮存液2ml加至50ml容量中,加水至刻度冷藏

3.操作

按图15-5操作。

4.计算

血清脂性磷浓度=ESA/EST×10(mg/dl)

血清磷脂(以卵磷脂计)=ESA/EST×10×0.3229(mmol/L)

图15-5 血清磷脂测定(消化法)操作图*采用带塞玻璃试管

二、酶法

1.原理

磷脂酶D因特异性不高,能水解血清中卵磷脂,溶血卵磷脂和神经磷脂(三者占血清总磷脂的95%),释放出胆碱,胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2,在过氧化物酶作用下,H2O2,4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物,其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比,在500nm波长下比色计算结果为:

2.试剂

(1)酶应用液(参考配方):每100ml Tris-His缓冲液(50mmol/L,pH7.8)中含:

磷脂酶D45U
胆碱氧化酶100U
过氧化物酶220U
4-氨基安替比林12mg
20mg
CaCl2·2H2O8mg
TritonX-1000.2g

(2)标准液:纯卵磷脂,临用前配制,5mg/2.5ml蒸馏水(含TritonX-1000.5%)

3.操作

(1)标本采集:空腹12h抽静脉血,不抗凝,分离血清或抗凝血分离血浆

(2)在3.0ml酶应用液中加入血清(浆)20μl,标准管加标准液20μl,空白管加水20μl,放置37℃水浴10min后,波长500nm,比色,空白管液调零。

4.计算

血清磷脂(mg/dl)=TA/SA×200

血清磷脂(mmol/L)=血清磷脂(mg/dl)×0.01292