当前位置: 首页 > 医学版 > 医学理论 > 其它 > 动脉粥样硬化 > 正文
编号:10169008
第三节 血浆脂蛋白电泳分离定量法
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

(一)原理

以聚丙烯酰胺为支持介质,血清脂质用染料预染,使脂蛋白着色,经电泳后,一般可分出三条区带,即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数,乘以总脂量,可求出三种脂蛋白的含量。

(二)试剂与仪器

1.试剂

(1)分离胶缓冲液:三羟甲基氨基甲烷(Tris)18.3g,lmol/L盐酸24ml,加水至100ml(pH8.9)。

(2)丙烯酰胺Ⅰ液:丙烯酰胺(Acr)15g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g,混匀。

(3)0.35%过硫酸铵(AP)

(4)四甲基乙二胺(TEMED)

(5)丙烯酰胺Ⅱ液:Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml,混匀。

(6)浓缩胶缓冲液:Tris 6g、1mol/L HCl。

(7)0.002%核黄素,48ml,加水至100ml,pH6.7。

(8)电极缓冲液:甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml,pH8.3。

(9)1%苏丹黑B染色液:苏丹黑B200mg,丙二醇20ml,水浴加温至溶,离心,去除沉渣,冰箱保存备用。

(10)40%蔗糖水溶液。

2.仪器

电泳仪、光密度扫描仪

(三)操作

1.制胶

(1)先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管,封口底。

(2)配制5%浓度凝胶:取丙烯酰胺Ⅰ液5ml,分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合,再加TEMED,20μl,混均,用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm,上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面,千万别冲散凝胶界面,使凝胶与空气隔绝。静置20~40min,等凝胶凝固后,除去上层水,再加上浓缩胶。

(3)浓缩胶制备:取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀,加TEMED20μl混匀,迅速加入到分离胶上层约1cm高度,沿管壁仔细加蒸馏水覆盖,千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min,也可在强光下聚合,聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。

2.血清预染与加样

在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml,摇匀,于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣,取预染血清30μl,加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面,再加一滴40%蔗糖液,混匀,然后小心地在上面加满电极缓冲液,再装在电泳槽上。

3.电泳

将电极液加入上下电泳槽内,靠样品端的上槽接负极,下槽为正极,接通电源,调节电流为2-5mA/管,30~40min后,关闭电源。

4.剥胶

从电泳槽上取下凝胶管,用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间,使凝胶与玻管内壁分离,再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪,凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。

电泳后凝胶一般出现三条区带,从正极到负极依次为α-脂蛋白,β-脂蛋白和前β-脂蛋白,前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。

5.定量

浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描,计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比,即为每种脂蛋白组份的百分比。

二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法

(一)原理

以琼脂糖凝胶为支持介质,先用脂类染料将血清进行预染,使血清脂蛋白着色,然后电泳。切下各脂蛋白区带,加热溶解,冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。

(二)试剂

1.巴比妥HCl缓冲液(pH8.6,离子强度0.075):称取巴比妥钠15.5g,加入1mol/LHCl12ml,混匀溶解,加蒸馏水至1000ml,此为电极缓冲液。

2.巴比妥-HCl缓冲液(pH8.6,离子强度0.05):称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/L HCI8ml,混匀溶解,加蒸馏水至1000ml,用于配琼脂糖凝胶用。

3.0.8%琼脂糖凝胶:取琼脂糖0.8g,溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml,置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。

4.1%苏丹黑B的石油醚-乙醇(1:4,V/V)溶液。

(三)操作

1.预染血清:吸血清0.2ml于一小试管中,再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管,2000r/min离心5min,以除去多余的染料。

2.琼脂糖凝胶板制备:将0.8%琼脂糖凝胶溶解后,吸2.5ml到载玻片上,趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。

3.点样与电泳:取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl,注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液,样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳,待预染血清电泳至最高或40min,切断电源。

4.定量:

(1)切割比色法:将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内,为空白管,各管放入沸水煮3min,琼脂糖溶解,待冷,以空白管调零点,于660nm处比色,记录吸光度,以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和,比各自区带的吸光度,求其百分比。这种半定量方法不够准确,误差很大。

(2)扫描定量:预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕,其琼脂糖凝胶板上有色带,可直接置于光密度扫描仪扫描,并得出各区带的百分比,如果输入该病人的血脂总量,即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量,如图16-2所示。

图16-2 血清脂蛋白电泳(琼脂糖)

正常参考值(百分比):

α-脂蛋白 25.7±4.1%

前β-脂蛋白 21.0±4.4%

β-脂蛋白 53.3±5.3%

注意事项:①血清样品要新鲜;②为了免去离心步骤,吸取预染血清时,应吸取上层,下层或管底可能有染料颗粒沉渣,否则应再离心后吸预染血清。