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第三节 蛋白质浓度测定
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

蛋白质溶液浓度测定方法有多种,下述几种方法可供选用。蛋白质浓度的测定,往往用于计算纯化方法的回收率的重要方法。

一、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,至令仍广泛采用。在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法。硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

二、Lowry法

此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应,即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物,然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂(福林-酚试剂),结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多,适合于测定20mg/L~400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同,而且受他们的影响更大,硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是,加入福林试剂时要特别小心,试剂只在酸性pH环境中才稳定,上述提到的还原反应只有在pH10时才发生,因此,福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时,必须立刻搅拌,以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。

三、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,因此,利用这个特异性吸收,可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在,在280nm处的吸收可用于测定0.1~0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸,核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时,所测得的蛋白质浓度必须作适当校正,一般按下述公式粗略计算:

是蛋白质溶液在280nm波长处(光程1厘米)测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处(光程1厘米)处所测得的光密度值。

此方程是从烯醇酶(在酵母核酸存在时)得出来的。因此,对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同,因此,浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数()在0.5~2.5之间变化。

所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如,牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7,而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在,因此,此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml~100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到:

光密度之差求

得,这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是,蛋白质之间的分子量差异比较大,因此,在比较几种蛋白质含量时,必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化,所以在制作标准曲线时,必须与样品条件一致。

(吴翠华 贺小玲 周新)

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