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编号:10169015
第三节 单向免疫扩散法
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

一、原理

将抗载脂蛋白血清均匀地混合于琼脂糖凝胶内,打孔,加样。孔中待测样品的抗原辐射状向含抗体的胶内扩散,至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原Apo含量成正比。

二、试剂

1.0.05mol/L pH8.2巴比妥钠-HCl缓冲液;巴比妥钠15.8g加水至1000ml。以1.17mol/l HCl调pH至8.2,约1.17mol/L Hcl(浓HCl 19.3ml加水180.7ml)18.36ml,最后以蒸馏水补足至1421.8ml。

2.24.0g/L琼脂糖:优质琼脂糖粉2.4g,硫柳汞0.01g,加0.05mol/l pH8.2巴比妥钠HCl缓冲液100ml,加热融化后,根据浇注板的大小分装,每管5.8ml、3.4ml、1.5ml,加塞后4℃或室温保存。

3.0.1g/L硫柳汞生理盐水:1000ml生理盐水中含硫柳汞0.1g。

4.抗血清:临用前根据浇注板的大小,按效价稀释。

三、操作

1.浇注琼脂糖凝胶板

取“凹”型有机玻璃框架,厚1.6mm,两边夹6×12cm玻璃,再用铁夹夹紧玻璃待用。

加热融化24.0g/L琼脂糖,56℃水浴保温。根据抗Apo血清效价,按表18-19进行配制。

表18-19 含抗血清琼脂糖板配制法

试 剂抗 血 清 RID 法 效 价
202530406080
24.0g/L琼脂(ml)5.805.805.805.805.805.80
硫柳汞盐水(ml)5.225.345.415.515.615.65
抗血清(ml)0.580.460.390.290.190.15

将稀释的抗血清倾入已融化的琼脂糖中,颠倒混匀1~2次,避免产生气泡,迅速浇注预置水平位置的双层玻板内,待凝。抗血清效价高时,亦可直接将抗血清混入12.0g/L琼脂中,摇匀后制板。

2.按模式图用直径3mm的金属管打孔,6×12cm免疫扩散板打孔28个,6×8cm免疫扩散板打孔16个。

3.待测血清用硫柳汞盐水稀释(按说明书),用微量加样器每份标本加1孔。加样量10μl。置湿盒(水平位置)37℃扩散24h,测沉淀环直径,如图18-2所示。

图18-2 单向免疫扩散图(0.8%琼脂糖)

4. 标准曲线的制备(参考方法)

(1)参考血清稀释法:取Apo含量标准参考血清用盐水稀释成梯度浓度。ApoAⅠ:20、40、60、80、100mg/dl,同上法操作加样,每一稀释浓度应在两块板的不同位置各加样孔,每孔5μl。37℃湿盒扩散24h,测沉淀环直径,求出各稀释度均值。制作标准曲线。

(2)用半对数纸制作:以抗原含量为纵坐标(对数),沉淀环直径为横坐标,在半对数纸上作图。一般要求至少有4个不同稀释度。增加标准曲线上的点数;可增加其可靠程度。

(3)用推算平均值法制备标准曲线:RID定量法尽管严格遵守所有的试验条件,但不同浓度所求得的沉淀环直径,在绘制曲线时仍然常不在一条直线上,推算平均值法是通过数学方法处理,使不在标准曲线上的各点回归到同一直线上来。可用公式log y=ax+b表示。

结果判断

根据待测血清在含抗Apo血清免疫扩散板上形成的沉淀环直径,查标准曲线即可行相应Apo的含量。可以mg/dl报告,也可以国际单位报告(g/L)