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编号:10169023
第二节 3H-Tdr掺入法与Mtt比色法
http://www.100md.com 《动脉粥样硬化》

Cutbert等发现缺乏内源性和外源性胆固醇时,培养于仅含微量LDL营养液中的人外围血淋巴细胞,其生长和增生均依赖与细胞膜表面LDL-R的存在,根据这一原理建立了3H-TdR(3H-thymidine,3H-胸腺嘧啶)掺入法检测人淋巴细胞LDL-R的活性。杨建新等改进了本法,减少用血量,但是未能避免使用同位素,简述止法。

检测原理:细胞分裂增殖所需的大量胆固醇主要通过内源性胆固醇合成,以及加速细胞膜LDL-R介导的特异性结合,摄取血LDL中的外源性胆固醇而获得,当用mevinolin(胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶的抑制剂)阻断细胞内源性胆固醇的合成,并使细胞外环境中LDL浓度降低至无非特异性外源胆固醇摄取时,细胞分裂生长完全取决与细胞膜表面LDL-R活性,掺入3H-TdR量与细胞生长成正比例关系。

验方法:采空腹静脉血5~6ml,肝素抗凝,测血浆血脂,并分离出淋巴细胞;将细胞分成实验组(加含mevinolin的二甲亚矾)和对照组(加不含mevinolin的二甲亚矾),在同样条件下(50μg/mlPHA,5μg/mlLDL-C,37℃,5%CO2,饱和湿度)培养96h,分别加入0.5μCi3H-TdR,混匀后继续培养6h,收集细胞至玻璃纤维纸上测cpm值。

其计算公式为:

淋巴细胞分裂抑制率(%)=(1-Δcpm实验组/Δcpm对照组)×100%

采用本法正常淋巴细胞分裂抑制率<20%;FH杂合子淋巴细胞分裂抑制率>60%,故可将FH患者与正常人以及普通的高脂血症区别开来。

MTT比色法是孟凡青等根据3H-TdR掺入法为避免使用同位素而改用四甲基偶氮唑盐(MTT)建立的一种快速、方便的方法。MTT比色法仅需采空腹静脉血1~2ml,培养90h后,实验组和对照组分别加入MTT溶液(3mg/ml),再培养2h,抽吸上清,加0.04mol/HCL-异内醇,充分溶解,在酶标仪上测吸光度(A)值。详细操作流程见图20-2。

图20-2 MTT比色法检测LDL-R操作流程

细胞分裂抑制率计算公式为:

淋巴细胞分裂抑制率(%)=(1-ΔA实验组/ΔA对照组)×100%

正常人淋巴细胞分裂抑制率为0~18%;FH杂合子淋巴细胞分裂抑制率为21%~58%;FH纯合子淋巴细胞分裂抑制率为36%~60%。

经实验比较MTT比色法与经典的3H-TdR掺入法测定的结果基本相符,但是后者敏感性更强,可以一步将FH杂合子和FH纯合子区分开来。由于MTT比色法不需使用昂贵的仪器和同位素,用血量少,适合一般实验室及临床检验科室的临床诊断,可用于人群FH筛查,这对于减少杂合子之间的婚配,降低FH发病率有重要意义。