[网摘]增感显影在荧光显微摄影中的应用
张淼丽 原悦萍
第四军医大学解剖学教研室 梁銶琚脑研究中心
前 言
神经科学研究的方法中，免疫荧光标记集束有着它独特的优势，快速、准确、特异性强。技术方法也由单一的标记发展到双重、三重以上的多重标记技术。由于荧光素种类较多，发出不同波长的荧光且光强弱不等，荧光又极易粹灭。黑白全色胶卷虽然对可见光谱均感光，但对各色光的感光性略有不同( 图1)。因此要想准确拍摄荧光显微镜下观察到的实验结果非常困难。
本实验是根据感光材料的特性，探讨适应荧光显微镜摄影特点的曝光条件和显影技术，最大限度地发挥胶片的性能。实验结果证明黑白胶片经增感显影，提高胶片原有规定的感光度，大大缩短了曝光时间，减少了光对标本的照射，保护了标本，同时也有可能捕捉到微弱的荧光像。增感显影使影调反差发生改变，增加了画面的反差，恰好有利于表现荧光像。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1. 感光材料
⑴ Kodak T-MAX 400高速黑白全色胶卷
⑵ LUCKY 400高速黑白全色胶卷
⑶ LUCKY 100黑白全色胶卷
⑷ Kodak Gray Scale
2. 免疫荧光标记标本
3. 器材：
Nikon F3 照相机，55mm、F2.8镜头
4×100W白炽灯照明的翻拍架
, 百拇医药
Olympus BX-60荧光显微镜
二、方法
对三种感光胶片分别进行感光性能实验。如下表所示
7.5分钟
10分钟
15分钟
Kodak 400 ISO
400
800
2000
LK 400 ISO
400
, 百拇医药
800
1600
LK 100 ISO
100
200
400
使用Kodak Gray Scale标准光楔，在4×100白炽灯翻拍架下由Nikon F3照相机、55mm、F2.8镜头翻拍。曝光时间选用自动曝光，分别设定3个感光度值进行曝光，以LK100 ISO黑白全色胶片为例， 设标准感光度100 ISO, 标准显影7.5分钟，提高感光度设定ISO 200，增感显影10分钟，再提高感光度设定感光度ISO 400，延长时间增感显影15分钟。然后用同样条件、同号数放大相纸放印照片，可以得到相同于标准曝光和标准显影的结果(图3)。
, 百拇医药
结果与讨论
三种胶片经逐倍减少曝光时间，再经不同时间增感显影可以得到相同于标准曝光与标准显影的结果。如图1。图1分别为a，标准显影，b，10分钟增感显影，c，15分钟增感显影，可见经增感显影的画面与标准显影的图像基本一致。而且弱光区域也有显影。实验结果也得出LUCKY 400 ISO黑白全色片和Kodak 400 ISO全色黑白胶片的结果。Kodak 400 ISO黑白全色片具有良好的颗粒性及粒子分辩力、灰雾度小，增感度可达到2000 ISO (IE值)。LUCKY 400同样有着明显增感效果，LUCKY 400 ISO胶片除感光性能稳定、胶片的片基特别透明，效果非常好。
感光胶片的性能指标显示具有增感的可能性 (图1)。图1和图2是化学工业部第一胶片厂提供的LUCKY 400 ISO黑白高速全色胶片的技术性能。光谱感光度曲线表显示胶片对不同波长的感光能力；特性曲线显示随显影时间的延长，密度增加。用于增感显影的PQ ID-68显影剂，其显影特点可将胶片规定的感光速度提高30~60%左右，而颗粒度增加甚少，清晰度良好，反差稍大。配方中具有显影作用的菲尼酮，其特点是对胶片接受弱光潜影区有强显作用。这些性能特点恰恰适合于荧光显微镜摄影的特点，弥补了荧光强弱不一 (大部分较弱)，荧光易粹灭等不足(还有发出红外波长的荧光，需用特殊感光材料，本实验不包括这部分)。
, 百拇医药
实际应用，荧光标本的拍摄结果( 图4 )，可清楚看到a, b 中神经纤维等细微标记荧光，a是FITC标记的绿色荧光、b是Texas-Red标记的红色荧光，均能有很好的成像。a'，b'未经增感显影的照片，图像反差弱，标记物不明亮。在蓝色荧光AMCA标记的标本，c，c'的比较中也可明显发现其效果的不同。
被标记的标本，在荧光显微镜下观察到的荧光，波长有不同，光强弱也有不等，有些是荧光素本身性质决定，也有因为技术方法的差异造成。常常会出现结果理想，但荧光像却很弱。所以在摄影时，要根据发出荧光颜色的不同，强弱的不同而设定曝光条件。(图5) a，b是同一部位标记两种荧光素，a是将FG(荧光金)注入孤束核后在中缝大核(RMg)内的FG逆标神经元(金黄色)；b是在同一部位用Texas-Red 标记的5-HT能神经元(红色)。使用LK 400黑白全色胶片，感光度设定为1000 ISO， ID-68显影液显影，显影时间20℃，10分钟。感光度为100 ISO的胶片虽然也具有可增感的性能，但在较弱荧光的摄影时仍显不足，故不推荐使用。感光度400 ISO以上的胶片，原则上感光度越高越好，但要注意随感光度的增加，胶片的颗粒会变粗。另外照片的放印也是实现显微镜摄影的重要环节，除选择相应号数的相纸还应考虑到显影液的性质。作者选用D-72冷色调显影液，显影温度20℃，显影时间90秒~120秒，此显影液具有颗粒细、影调丰富的特点。
, 百拇医药
综上所述，增感显影在荧光显微镜摄影中的应用是十分有效的。
附表：ID-68、D-72(冷)显影液配方
ID-68
温水 750 ml
无水亚硫酸钠 85 g
对苯二酚 5 g
四硼酸钠 7 g
硼酸 2 g
菲尼酮 0.13 g
溴化钾 1 g
, 百拇医药 加水至 1000 ml
D-72
温水 750 ml
米吐尔 4 g
无水亚硫酸钠 50 g
对苯二酚 10 g
无水碳酸钠 50 g
四硼酸钠 2 g
溴化钾 5 g
加水至 1000 ml
图版说明
, 百拇医药
图1 LK 400 黑白全色胶片光谱感光度曲线
图2 LK 400 黑白全色胶片特性曲线
图3 LK 100 黑白全色胶片经增感显影反差及颗粒性的变化
A .ISO 设定100 ID- 68 200 C 7.5 min
B . ISO 设定200 ID- 68 200 C 10 min
C . ISO 设定400 ID- 68 200 C 15 min
图4 增感现影与标准显影的对比
a , b , c 增感现影
a', b', c' 标准显影
图5 a. 荧光金逆标神经元(金黄色)，b., Texas-Red 标记5-HT 能神经元(红色)
a，b，均为LK 400黑白全色胶片，ISO 设定1000 ID- 68 20℃ 10 min
3 号放大相纸，D-72(冷) 20℃ 2分钟, 百拇医药
第四军医大学解剖学教研室 梁銶琚脑研究中心
前 言
神经科学研究的方法中，免疫荧光标记集束有着它独特的优势，快速、准确、特异性强。技术方法也由单一的标记发展到双重、三重以上的多重标记技术。由于荧光素种类较多，发出不同波长的荧光且光强弱不等，荧光又极易粹灭。黑白全色胶卷虽然对可见光谱均感光，但对各色光的感光性略有不同( 图1)。因此要想准确拍摄荧光显微镜下观察到的实验结果非常困难。
本实验是根据感光材料的特性，探讨适应荧光显微镜摄影特点的曝光条件和显影技术，最大限度地发挥胶片的性能。实验结果证明黑白胶片经增感显影，提高胶片原有规定的感光度，大大缩短了曝光时间，减少了光对标本的照射，保护了标本，同时也有可能捕捉到微弱的荧光像。增感显影使影调反差发生改变，增加了画面的反差，恰好有利于表现荧光像。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1. 感光材料
⑴ Kodak T-MAX 400高速黑白全色胶卷
⑵ LUCKY 400高速黑白全色胶卷
⑶ LUCKY 100黑白全色胶卷
⑷ Kodak Gray Scale
2. 免疫荧光标记标本
3. 器材：
Nikon F3 照相机，55mm、F2.8镜头
4×100W白炽灯照明的翻拍架
, 百拇医药
Olympus BX-60荧光显微镜
二、方法
对三种感光胶片分别进行感光性能实验。如下表所示
7.5分钟
10分钟
15分钟
Kodak 400 ISO
400
800
2000
LK 400 ISO
400
, 百拇医药
800
1600
LK 100 ISO
100
200
400
使用Kodak Gray Scale标准光楔，在4×100白炽灯翻拍架下由Nikon F3照相机、55mm、F2.8镜头翻拍。曝光时间选用自动曝光，分别设定3个感光度值进行曝光，以LK100 ISO黑白全色胶片为例， 设标准感光度100 ISO, 标准显影7.5分钟，提高感光度设定ISO 200，增感显影10分钟，再提高感光度设定感光度ISO 400，延长时间增感显影15分钟。然后用同样条件、同号数放大相纸放印照片，可以得到相同于标准曝光和标准显影的结果(图3)。
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结果与讨论
三种胶片经逐倍减少曝光时间，再经不同时间增感显影可以得到相同于标准曝光与标准显影的结果。如图1。图1分别为a，标准显影，b，10分钟增感显影，c，15分钟增感显影，可见经增感显影的画面与标准显影的图像基本一致。而且弱光区域也有显影。实验结果也得出LUCKY 400 ISO黑白全色片和Kodak 400 ISO全色黑白胶片的结果。Kodak 400 ISO黑白全色片具有良好的颗粒性及粒子分辩力、灰雾度小，增感度可达到2000 ISO (IE值)。LUCKY 400同样有着明显增感效果，LUCKY 400 ISO胶片除感光性能稳定、胶片的片基特别透明，效果非常好。
感光胶片的性能指标显示具有增感的可能性 (图1)。图1和图2是化学工业部第一胶片厂提供的LUCKY 400 ISO黑白高速全色胶片的技术性能。光谱感光度曲线表显示胶片对不同波长的感光能力；特性曲线显示随显影时间的延长，密度增加。用于增感显影的PQ ID-68显影剂，其显影特点可将胶片规定的感光速度提高30~60%左右，而颗粒度增加甚少，清晰度良好，反差稍大。配方中具有显影作用的菲尼酮，其特点是对胶片接受弱光潜影区有强显作用。这些性能特点恰恰适合于荧光显微镜摄影的特点，弥补了荧光强弱不一 (大部分较弱)，荧光易粹灭等不足(还有发出红外波长的荧光，需用特殊感光材料，本实验不包括这部分)。
, 百拇医药
实际应用，荧光标本的拍摄结果( 图4 )，可清楚看到a, b 中神经纤维等细微标记荧光，a是FITC标记的绿色荧光、b是Texas-Red标记的红色荧光，均能有很好的成像。a'，b'未经增感显影的照片，图像反差弱，标记物不明亮。在蓝色荧光AMCA标记的标本，c，c'的比较中也可明显发现其效果的不同。
被标记的标本，在荧光显微镜下观察到的荧光，波长有不同，光强弱也有不等，有些是荧光素本身性质决定，也有因为技术方法的差异造成。常常会出现结果理想，但荧光像却很弱。所以在摄影时，要根据发出荧光颜色的不同，强弱的不同而设定曝光条件。(图5) a，b是同一部位标记两种荧光素，a是将FG(荧光金)注入孤束核后在中缝大核(RMg)内的FG逆标神经元(金黄色)；b是在同一部位用Texas-Red 标记的5-HT能神经元(红色)。使用LK 400黑白全色胶片，感光度设定为1000 ISO， ID-68显影液显影，显影时间20℃，10分钟。感光度为100 ISO的胶片虽然也具有可增感的性能，但在较弱荧光的摄影时仍显不足，故不推荐使用。感光度400 ISO以上的胶片，原则上感光度越高越好，但要注意随感光度的增加，胶片的颗粒会变粗。另外照片的放印也是实现显微镜摄影的重要环节，除选择相应号数的相纸还应考虑到显影液的性质。作者选用D-72冷色调显影液，显影温度20℃，显影时间90秒~120秒，此显影液具有颗粒细、影调丰富的特点。
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综上所述，增感显影在荧光显微镜摄影中的应用是十分有效的。
附表：ID-68、D-72(冷)显影液配方
ID-68
温水 750 ml
无水亚硫酸钠 85 g
对苯二酚 5 g
四硼酸钠 7 g
硼酸 2 g
菲尼酮 0.13 g
溴化钾 1 g
, 百拇医药 加水至 1000 ml
D-72
温水 750 ml
米吐尔 4 g
无水亚硫酸钠 50 g
对苯二酚 10 g
无水碳酸钠 50 g
四硼酸钠 2 g
溴化钾 5 g
加水至 1000 ml
图版说明
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图1 LK 400 黑白全色胶片光谱感光度曲线
图2 LK 400 黑白全色胶片特性曲线
图3 LK 100 黑白全色胶片经增感显影反差及颗粒性的变化
A .ISO 设定100 ID- 68 200 C 7.5 min
B . ISO 设定200 ID- 68 200 C 10 min
C . ISO 设定400 ID- 68 200 C 15 min
图4 增感现影与标准显影的对比
a , b , c 增感现影
a', b', c' 标准显影
图5 a. 荧光金逆标神经元(金黄色)，b., Texas-Red 标记5-HT 能神经元(红色)
a，b，均为LK 400黑白全色胶片，ISO 设定1000 ID- 68 20℃ 10 min
3 号放大相纸，D-72(冷) 20℃ 2分钟, 百拇医药