加强对乙型肝炎病毒准种特点的研究(1)
一、准种(quasispecies)的基本概念
病原微生物，特别是核酸成分为RNA的病原微生物，其核酸成分在自身复制过程中由于RNA聚合酶/逆转录酶缺乏严密的自我校正功能，或同时在感染宿主的免疫压力或抗微生物药物的选择压力下，其核酸成分在少数位点上发生突变是一种十分常见的现象。在长期的生存环境中，早期来源于同一个祖先的病原微生物，因为这种突变现象的不断累积，就可能发展为核酸成分差别很大的病原微生物群，以至于造成核酸成分的显著差别，最终逐渐形成不同的基因型(genotype)；如果某些核酸序列位点的改变导致其编码产物抗原位点的改变，就逐渐构成了不同的血清型(serotype)。这就是病原微生物基因型和血清型形成的基本过程。但是，对于感染的单一病原体来说，在相对较短的时间内，病原微生物核酸的突变则造成体内同时存有基因序列有微小差别的种群。种群的各个成员之间，其差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2~5%，这种差别不至于构成病原体不同的基因型或血清型，但又的确存在着差别，这种现象就称为准种(quasispecies)。关于病原微生物的准种现象，早期是在一些RNA病毒核苷酸序列变化的规律中发现的，但是目前认为在DNA病毒中也存在这种所谓的准种现象。不仅病毒基因组的变化存在准种的现象，在幽门螺杆菌及其它一些病原微生物中也发现了准种。看来准种的特点是病原微生物界一个普遍存在的现象。
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二、 乙型肝炎病毒的准种特点
关于病毒的准种特点的认识是从人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的研究中逐步形成的。在慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染中，HBV是否有准种现象，一直没有引起人们的广泛关注。我们的研究表明，在慢性HBV感染患者中，的确存在者准种现象。我们研究了两个慢性HBV感染者血清中HBV DNA序列，特别是相对保守的S基因区的核苷酸序列不均一性的特点。董菁等(见本期论文)设计了S基因(包括前-S1、前-S2和S区)的特异性引物，以HBV慢性感染者血清提取物为模板，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增，获得了1 400 bp的DNA片段，将这种扩增的DNA片段尽可能多地克隆到T载体中以实现克隆化，分别获得了29和28个克隆。当以EcoRI/XhoI进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析时，在每一例病人中至少发现5种以上的表现形式，这种RFLP特点经核苷酸序列的测定得到证实。因此，为慢性HBV感染者体内存在HBV DNA的准种特点提供了直接的证据。
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三、乙型肝炎病毒准种研究的意义
早在1979年HBV研究者就克隆了HBV DNA的全基因序列，随后也有一些研究陆续报导了不同基因型和不同血清型的HBV DNA的全基因序列。从研究方法上来说，绝大部分的研究，或者郁于当时技术的局限性，或者对于HBV准种特点认识不够，都是分段克隆的，然后根据重叠部分的序列，人工拼接完成HBV DNA的核苷酸全序列。这种HBV DNA的全序列虽然对于当时的HBV 分子生物学研究起到了不可磨灭的推动作用，但也存在着严重的缺陷。如果把HBV DNA序列的准种特点考虑在内，那么如果进行分段克隆时，很可能得到来源于不同病毒基因的核苷酸序列，每次克隆所采用的病毒模板是随机的，很难是控制实验条件保证扩增产物的模板来源于同一种病毒。换句话说，这样分段克隆的HBV DNA序列在自然界是不存在的，这只是一种人工拼接的HBV DNA序列。因此，只有通过设计特异性引物，做长距离PCR扩增，一次获得全长的HBV DNA才能代表自然界存在的
作者单位：100039 北京，解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心
HBV DNA序列，目前我们正在测序之中。, http://www.100md.com(成军)
病原微生物，特别是核酸成分为RNA的病原微生物，其核酸成分在自身复制过程中由于RNA聚合酶/逆转录酶缺乏严密的自我校正功能，或同时在感染宿主的免疫压力或抗微生物药物的选择压力下，其核酸成分在少数位点上发生突变是一种十分常见的现象。在长期的生存环境中，早期来源于同一个祖先的病原微生物，因为这种突变现象的不断累积，就可能发展为核酸成分差别很大的病原微生物群，以至于造成核酸成分的显著差别，最终逐渐形成不同的基因型(genotype)；如果某些核酸序列位点的改变导致其编码产物抗原位点的改变，就逐渐构成了不同的血清型(serotype)。这就是病原微生物基因型和血清型形成的基本过程。但是，对于感染的单一病原体来说，在相对较短的时间内，病原微生物核酸的突变则造成体内同时存有基因序列有微小差别的种群。种群的各个成员之间，其差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2~5%，这种差别不至于构成病原体不同的基因型或血清型，但又的确存在着差别，这种现象就称为准种(quasispecies)。关于病原微生物的准种现象，早期是在一些RNA病毒核苷酸序列变化的规律中发现的，但是目前认为在DNA病毒中也存在这种所谓的准种现象。不仅病毒基因组的变化存在准种的现象，在幽门螺杆菌及其它一些病原微生物中也发现了准种。看来准种的特点是病原微生物界一个普遍存在的现象。
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二、 乙型肝炎病毒的准种特点
关于病毒的准种特点的认识是从人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的研究中逐步形成的。在慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染中，HBV是否有准种现象，一直没有引起人们的广泛关注。我们的研究表明，在慢性HBV感染患者中，的确存在者准种现象。我们研究了两个慢性HBV感染者血清中HBV DNA序列，特别是相对保守的S基因区的核苷酸序列不均一性的特点。董菁等(见本期论文)设计了S基因(包括前-S1、前-S2和S区)的特异性引物，以HBV慢性感染者血清提取物为模板，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增，获得了1 400 bp的DNA片段，将这种扩增的DNA片段尽可能多地克隆到T载体中以实现克隆化，分别获得了29和28个克隆。当以EcoRI/XhoI进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析时，在每一例病人中至少发现5种以上的表现形式，这种RFLP特点经核苷酸序列的测定得到证实。因此，为慢性HBV感染者体内存在HBV DNA的准种特点提供了直接的证据。
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三、乙型肝炎病毒准种研究的意义
早在1979年HBV研究者就克隆了HBV DNA的全基因序列，随后也有一些研究陆续报导了不同基因型和不同血清型的HBV DNA的全基因序列。从研究方法上来说，绝大部分的研究，或者郁于当时技术的局限性，或者对于HBV准种特点认识不够，都是分段克隆的，然后根据重叠部分的序列，人工拼接完成HBV DNA的核苷酸全序列。这种HBV DNA的全序列虽然对于当时的HBV 分子生物学研究起到了不可磨灭的推动作用，但也存在着严重的缺陷。如果把HBV DNA序列的准种特点考虑在内，那么如果进行分段克隆时，很可能得到来源于不同病毒基因的核苷酸序列，每次克隆所采用的病毒模板是随机的，很难是控制实验条件保证扩增产物的模板来源于同一种病毒。换句话说，这样分段克隆的HBV DNA序列在自然界是不存在的，这只是一种人工拼接的HBV DNA序列。因此，只有通过设计特异性引物，做长距离PCR扩增，一次获得全长的HBV DNA才能代表自然界存在的
作者单位：100039 北京，解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心
HBV DNA序列，目前我们正在测序之中。, http://www.100md.com(成军)