pSV-VEGF165肌肉原位注射促进兔缺血后肢毛细血管形成(2)
讨 论
血管内皮细胞生长因子(VEGF)能特异地作用于血管内皮细胞(EC),促进其分裂、增殖、形成新的血管[1,2],而对血管平滑肌细胞(SMC)无直接剌激作用,很少引起血管内膜增生,而且VEGF能促进新生侧支血管尽快成熟,使其具有NO依赖性血管舒张反应,从而增加侧支循环血流量[3,4]。它的第一个外显子含有一个分泌肽序列,使VEGF蛋白能从完整的细胞内分泌出来[1,5],即使其转染效率很低,通过旁分泌效应也能使其发挥很大的生理作用。这些优点使VEGF基因成为治疗性血管生成的主要候选基因。
人类VEGF基因全长14kb,由8个外显子、7个内含子组成[6],经剪切可产生4种不同的转录本:VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF121。其中,VEGF165含有分泌肽序列,是一种分泌型生长因子,在体内分布范围广泛,表达水平最高,是体内发挥作用的主要形式,而且VEGF165能与缺血肌肉组织内EC表面的肝素型蛋白多糖结合而聚集在一起,使少量VEGF165也可在缺血局部达到有效浓度[7]。因此我们选择VEGF165作为目的基因构建重组质粒pSV-VEGF165。
, http://www.100md.com
肌肉内原位注射裸DNA的方法首先由Wolff等[8-10]提出,通过转移一系列报告基因的实验研究,他们发现骨骼肌能够摄取和表达直接注入的环状闭合质粒DNA,即裸DNA。采用这种方法,既避免了病毒载体引起的免疫和炎症反应[11],裸DNA又不会整合进入宿主基因组内引起突变而致癌,因此安全性较高。但是裸DNA原位注射的转染效率很低,Tsurumi等[12]用报告基因LacZ测定肌肉内原位转移裸DNA的转染效率<1%。
本实验成功地将pSV-VEGF165原位转染于兔缺血后肢。为了提高转染效率,根据Davis等[9,13]提出的注射质粒的液体量多、渗透压高、速度慢则基因表达量多、稳定、分布均一的观点,我们采用较低浓度的pSV-VEGF165(1μg/μl)缓慢注射,通过组织学检查发现毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值增加,结果表明肌肉内原位注射pSV-VEGF165能被摄取和表达,即使只有少量肌细胞转染了VEFD基因,也足以发挥生物学活性,促进缺血肌肉内毛细血管形成,用此方法进行治疗性血管生成是可行的。本实验结果与Tsurumi的实验结果[12]相符。
, 百拇医药
国外有报道从动脉造影[14]和肢体血流量测定[15]的结果分析,发现肢体缺血程度越高,对治疗性血管生成的反应越大。本实验也发现经VEGF治疗后,缺血严重的小腿部位毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值比缺血相对较轻的大腿质粒注射部位有显著增高。这可能由于缺血使肌母细胞代偿性增殖,对外源性质粒DNA的摄取和表达增加[9,16,17],使缺血肌肉内基因转染效率明显提高[18];也可能与缺血缺氧环境可使VEGF及其受体的表达均增加[19]有关,Brogi报道缺血肌肉内EC表面VEGF受体KDR的表达增加了13倍[20],Flamme等发现VEGF过度表达的部位其受体flk-1基因也过度表达,提示存在一个正向调节机制[21],既增强了VEGF的作用,也加强了其作用的部位特异性,即缺血越严重的部位VEGF的作用越强,使缺血肌肉内新生血管的形成增加[22]。由此可见,基因治疗成功与否不完全取决于转染效率,而与多种因素相互作用有关。
总之,我们认为肌肉内原位注射VEGF裸DNA是一种既简单又有效的基因治疗方法,能显著增加缺血肢体侧支循环的形成。对于下肢缺血病变严重且近端动脉已闭塞的患者,已不可能采用经皮穿刺球囊导管转基因,采用多点注射肌肉内原位转移VEGF裸DNA可能成为一种新的基因治疗途径。进入二十一世纪我国老龄人口将超过10%,下肢缺血性病变发病率增加,届时将面临艰巨的诊疗任务,若能采用肌肉内注射VEGF裸DNA的方法来有效地促进侧支血管形成,无疑将给患者和医生都带来福音。, http://www.100md.com(赵意平 施娅雪 何天源 张皓 陈诗书 张柏根)
血管内皮细胞生长因子(VEGF)能特异地作用于血管内皮细胞(EC),促进其分裂、增殖、形成新的血管[1,2],而对血管平滑肌细胞(SMC)无直接剌激作用,很少引起血管内膜增生,而且VEGF能促进新生侧支血管尽快成熟,使其具有NO依赖性血管舒张反应,从而增加侧支循环血流量[3,4]。它的第一个外显子含有一个分泌肽序列,使VEGF蛋白能从完整的细胞内分泌出来[1,5],即使其转染效率很低,通过旁分泌效应也能使其发挥很大的生理作用。这些优点使VEGF基因成为治疗性血管生成的主要候选基因。
人类VEGF基因全长14kb,由8个外显子、7个内含子组成[6],经剪切可产生4种不同的转录本:VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF121。其中,VEGF165含有分泌肽序列,是一种分泌型生长因子,在体内分布范围广泛,表达水平最高,是体内发挥作用的主要形式,而且VEGF165能与缺血肌肉组织内EC表面的肝素型蛋白多糖结合而聚集在一起,使少量VEGF165也可在缺血局部达到有效浓度[7]。因此我们选择VEGF165作为目的基因构建重组质粒pSV-VEGF165。
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肌肉内原位注射裸DNA的方法首先由Wolff等[8-10]提出,通过转移一系列报告基因的实验研究,他们发现骨骼肌能够摄取和表达直接注入的环状闭合质粒DNA,即裸DNA。采用这种方法,既避免了病毒载体引起的免疫和炎症反应[11],裸DNA又不会整合进入宿主基因组内引起突变而致癌,因此安全性较高。但是裸DNA原位注射的转染效率很低,Tsurumi等[12]用报告基因LacZ测定肌肉内原位转移裸DNA的转染效率<1%。
本实验成功地将pSV-VEGF165原位转染于兔缺血后肢。为了提高转染效率,根据Davis等[9,13]提出的注射质粒的液体量多、渗透压高、速度慢则基因表达量多、稳定、分布均一的观点,我们采用较低浓度的pSV-VEGF165(1μg/μl)缓慢注射,通过组织学检查发现毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值增加,结果表明肌肉内原位注射pSV-VEGF165能被摄取和表达,即使只有少量肌细胞转染了VEFD基因,也足以发挥生物学活性,促进缺血肌肉内毛细血管形成,用此方法进行治疗性血管生成是可行的。本实验结果与Tsurumi的实验结果[12]相符。
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国外有报道从动脉造影[14]和肢体血流量测定[15]的结果分析,发现肢体缺血程度越高,对治疗性血管生成的反应越大。本实验也发现经VEGF治疗后,缺血严重的小腿部位毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值比缺血相对较轻的大腿质粒注射部位有显著增高。这可能由于缺血使肌母细胞代偿性增殖,对外源性质粒DNA的摄取和表达增加[9,16,17],使缺血肌肉内基因转染效率明显提高[18];也可能与缺血缺氧环境可使VEGF及其受体的表达均增加[19]有关,Brogi报道缺血肌肉内EC表面VEGF受体KDR的表达增加了13倍[20],Flamme等发现VEGF过度表达的部位其受体flk-1基因也过度表达,提示存在一个正向调节机制[21],既增强了VEGF的作用,也加强了其作用的部位特异性,即缺血越严重的部位VEGF的作用越强,使缺血肌肉内新生血管的形成增加[22]。由此可见,基因治疗成功与否不完全取决于转染效率,而与多种因素相互作用有关。
总之,我们认为肌肉内原位注射VEGF裸DNA是一种既简单又有效的基因治疗方法,能显著增加缺血肢体侧支循环的形成。对于下肢缺血病变严重且近端动脉已闭塞的患者,已不可能采用经皮穿刺球囊导管转基因,采用多点注射肌肉内原位转移VEGF裸DNA可能成为一种新的基因治疗途径。进入二十一世纪我国老龄人口将超过10%,下肢缺血性病变发病率增加,届时将面临艰巨的诊疗任务,若能采用肌肉内注射VEGF裸DNA的方法来有效地促进侧支血管形成,无疑将给患者和医生都带来福音。, http://www.100md.com(赵意平 施娅雪 何天源 张皓 陈诗书 张柏根)