尿脱落细胞ras癌基因突变的检测(1)
目前临床上对膀胱移行上皮细胞癌(TCC)的诊断还依赖于膀胱镜检查、B超检查和尿液脱落细胞学检查,前两者不易普及,而且不能发现早期的无症状TCC,后者虽为无损伤性、常规检查手段,但这种方法不仅检出率低,且易受感染、结石、放化疗等因素的影响,假阴性率、假阳性率还很高。大量研究表明,在TCC的发生、发展过程中,伴随着癌基因ras发生突变。由于尿液取材方便,人们设想通过尿液检查来无创伤性地早期诊断膀胱癌及监测其复发。我们利用聚合酶链反应 单链构象多态性分析技术(PCR SSCP)银染色法检测TCC患者晨尿脱落细胞ras癌基因突变,并且结合本组病例临床和病理资料分析,旨在探讨ras基因突变与TCC生物学行为的关系,及该方法的临床应用价值。
材料和方法
一、临床资料以48份经手术病理证实的TCC患者术前晨尿脱落细胞为研究组,患者年龄46～73岁(平均55.8岁),男35例,女13例;以14份正常健康者和14份非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的晨尿脱落细胞为对照组,对照组年龄45～82岁(平均63岁),男18例,女10例。48例TCC按国际癌症防治联合会(UICC)和WHO评定标准,I、II、III级肿瘤分别为32、9和7例;Ptis、PTa、PT1、PT2、PT3～4期肿瘤分别为5、9、18、8和8例。
, 百拇医药
二、晨尿的收集与处理分别收取TCC患者术前晨尿和对照组每人晨尿200ml,4℃,15000g离心收集尿脱落细胞。加入500μlDNA抽提液(10mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,100mg/L蛋白酶K),58℃过夜,酚 氯仿法抽提每份尿脱落细胞基因组DNA,用TE溶解,测定A260/A280比值,确定其浓度和含量,保存备用。每例TCC患者同时做尿脱落细胞学检查。
三、主要试剂与研究方法
1 PCR引物:根据基因库人ras癌基因的基因组序列,对其突变热点外显子1设计引物:引物1: 5′GACGGAATATAAGCTGGTGG 3′,引物2: 5′ TGGATG GTCAGCGCACTCTT 3′(由上海生工生物技术公司合成)。PCR扩增产物长度为63bp。
2 PCR SSCP:PCR试剂盒购自PromegA公司。以尿脱落细胞基因DNA为模板,PCR扩增ras基因外显子1特异性片断。PCR反应条件:94℃预变性6min,然后94℃45s,58℃30s,72℃1min,反应循环38次,72℃延伸7min。以pBR 322DNA/HAeIII为分子量标准,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。最后取PCR产物10μl,加二甲基亚砜变性缓冲液5μl,95℃变性10min,立即置于冰中,取变性后的PCR产物上样,至99份丙烯酰胺:1份N,N′ 亚甲双丙烯酰胺的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,室温、恒压200v,电泳2～3h,银染法染色。在灯箱上进行SSCP结果分析[1]。
3 二次PCR,低溶点琼脂糖凝胶回收目的片段:把有泳动变位片段的PCR产物50～100μl与正常对照8μl再次在同样条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,从银染的聚丙烯酰胺凝胶中割下有泳动变位的片段,加400μl TE室温浸泡过夜,沸水煮20min,自然冷却后于12000r/min离心10min,酚 氯仿抽提,无水乙醇沉淀。作二次PCR扩增模板。将二次PCR扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶上,电泳1～2h,用1%低溶点琼脂糖凝胶回收目的条带,酚 氯仿再次抽提,无水乙醇沉淀,以这步回收的DNA为测序模板。
4 用Sanger双脱氧链终止法测定DNA扩增产物的序列:测序试剂盒购自GENE基因有限公司,γ P32购自北京亚辉生物工程公司。, http://www.100md.com(何晓文 李峻 靳小青 卢建 马小兵 孙民 钮燕 陆翠琴)
材料和方法
一、临床资料以48份经手术病理证实的TCC患者术前晨尿脱落细胞为研究组,患者年龄46～73岁(平均55.8岁),男35例,女13例;以14份正常健康者和14份非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的晨尿脱落细胞为对照组,对照组年龄45～82岁(平均63岁),男18例,女10例。48例TCC按国际癌症防治联合会(UICC)和WHO评定标准,I、II、III级肿瘤分别为32、9和7例;Ptis、PTa、PT1、PT2、PT3～4期肿瘤分别为5、9、18、8和8例。
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二、晨尿的收集与处理分别收取TCC患者术前晨尿和对照组每人晨尿200ml,4℃,15000g离心收集尿脱落细胞。加入500μlDNA抽提液(10mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,100mg/L蛋白酶K),58℃过夜,酚 氯仿法抽提每份尿脱落细胞基因组DNA,用TE溶解,测定A260/A280比值,确定其浓度和含量,保存备用。每例TCC患者同时做尿脱落细胞学检查。
三、主要试剂与研究方法
1 PCR引物:根据基因库人ras癌基因的基因组序列,对其突变热点外显子1设计引物:引物1: 5′GACGGAATATAAGCTGGTGG 3′,引物2: 5′ TGGATG GTCAGCGCACTCTT 3′(由上海生工生物技术公司合成)。PCR扩增产物长度为63bp。
2 PCR SSCP:PCR试剂盒购自PromegA公司。以尿脱落细胞基因DNA为模板,PCR扩增ras基因外显子1特异性片断。PCR反应条件:94℃预变性6min,然后94℃45s,58℃30s,72℃1min,反应循环38次,72℃延伸7min。以pBR 322DNA/HAeIII为分子量标准,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。最后取PCR产物10μl,加二甲基亚砜变性缓冲液5μl,95℃变性10min,立即置于冰中,取变性后的PCR产物上样,至99份丙烯酰胺:1份N,N′ 亚甲双丙烯酰胺的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,室温、恒压200v,电泳2～3h,银染法染色。在灯箱上进行SSCP结果分析[1]。
3 二次PCR,低溶点琼脂糖凝胶回收目的片段:把有泳动变位片段的PCR产物50～100μl与正常对照8μl再次在同样条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,从银染的聚丙烯酰胺凝胶中割下有泳动变位的片段,加400μl TE室温浸泡过夜,沸水煮20min,自然冷却后于12000r/min离心10min,酚 氯仿抽提,无水乙醇沉淀。作二次PCR扩增模板。将二次PCR扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶上,电泳1～2h,用1%低溶点琼脂糖凝胶回收目的条带,酚 氯仿再次抽提,无水乙醇沉淀,以这步回收的DNA为测序模板。
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