哮喘大鼠支气管上皮ICAM-1的表达与IL-5变化的关系(1)
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支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道疾病。近年来的研究表明发病率和死亡率呈上升趋势【1】。哮喘的发病机制至今尚未完全被阐明。WHO制定的“哮喘管理和预防的全球策略”认为哮喘的基本概念是：一种慢性气道变态反应性炎症(AAI)。随着细胞表面粘附分子的发现，人们对炎症细胞浸润的机制有了更深入的了解。一些研究结果显示哮喘患者气道上皮细胞及粘膜下层血管内皮细胞ICAM-1表达增加[1]。白细胞介素-5(IL-5)有称为B细胞生长因子Ⅱ(BCGFⅡ)，在亚计量的IL-5存在下，对IL-4诱导IgE合成有显著的协同作用[2]。诸多实验证明Th2细胞所产生的IL-5能增强嗜酸性粒细胞(EOS)对血管内皮细胞的粘附能力，并对EOS具有强烈的趋化作性，还可使EOS分化及释放炎症介质。本研究通过免疫组化方法观察大鼠哮喘模型肺组织ICAM-1的表达情况及其与IL-5的关系。
1 材料及方法
1.2哮喘大鼠动物模型的复制【3】
雄性Wistar大鼠32只，体重160-250g，随机分成生理盐水对照组(对照组)和哮喘发作组(哮喘组)。在实验的第1天、第3天、第5天大鼠腹腔注射抗原液1ml(含卵蛋白100mg，灭活百日咳杆菌疫苗5×109个，氢氧化铝干粉100mg)致敏；对照组则用等量生理盐水替代抗原液。2周后哮喘组超声雾化器向自制体描箱内喷雾1%卵蛋白激发，每天8：00~9：00吸入20min，隔日激发1次，共3次；对照组则用生理盐水代替抗原液以同样方法激发和记录。7天后按设计取材。所有大鼠均经呼吸曲线描记及肺组织病理学检查。
1.3实验方法
1.2.1取材：⑴腹腔注射麻醉戊巴比妥钠后，开胸气管插管，用生理盐水10ml注入气管肺组织内，反复抽吸三次，将抽取的肺泡灌洗液(BALF)放入离心管中，1000r/min离心5~10min，取上清液用于检测IL-5活性。离心的细胞沉淀，用含5%胎牛血清(FCS)的M-199培养液反复冲洗3次，调整培养液为1ml，取少量于载玻片上涂片，HE染色测定BALF中的细胞数及细胞分类。⑵在麻醉状态下取出肺脏，放入液氮罐迅速冰冻。⑶将上述组织制备冰冻切片厚度10μm，用于免疫组化染色。
1.2.2方法及试剂：⑴IL-5的测定：采用酶联免疫检测试剂盒(美国Endoger公司产品)，按说明书进行。⑵ICAM-1： ABC免疫组化染色。羊抗大鼠ICAM-1单抗为日本Seikagaku Corporti公司产品；ABC试剂盒购于北京邦定生物技术公司；DAB为美国Zymed公司产品。
1.2.3程序：切片水化后用95%的已醇脱脂，入3%的甲醇-H2O2孵育30min，封闭内源性过氧化物酶，3mol的尿素消化30min(室温)。然后按常规ABC法进行染色，羊抗大鼠ICAM-1单抗稀释度1：600，4℃过夜，生物素化的羊抗小鼠IgG 1：200，30min(37℃)，ABC复合物1：100，30min(37℃)，DAB显色，甲基绿复染，二甲苯透明，DPX封片。阴性对照以PBS和正常兔血清分别代替一抗作空白对照和替代对照。
1.2.4结果观察：细胞膜有棕黄色着染者为阳性。应用病理图象分析处理系统处理每一张切片，计算出阳性面积。, 百拇医药(魏庆宇)
支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道疾病。近年来的研究表明发病率和死亡率呈上升趋势【1】。哮喘的发病机制至今尚未完全被阐明。WHO制定的“哮喘管理和预防的全球策略”认为哮喘的基本概念是：一种慢性气道变态反应性炎症(AAI)。随着细胞表面粘附分子的发现，人们对炎症细胞浸润的机制有了更深入的了解。一些研究结果显示哮喘患者气道上皮细胞及粘膜下层血管内皮细胞ICAM-1表达增加[1]。白细胞介素-5(IL-5)有称为B细胞生长因子Ⅱ(BCGFⅡ)，在亚计量的IL-5存在下，对IL-4诱导IgE合成有显著的协同作用[2]。诸多实验证明Th2细胞所产生的IL-5能增强嗜酸性粒细胞(EOS)对血管内皮细胞的粘附能力，并对EOS具有强烈的趋化作性，还可使EOS分化及释放炎症介质。本研究通过免疫组化方法观察大鼠哮喘模型肺组织ICAM-1的表达情况及其与IL-5的关系。
1 材料及方法
1.2哮喘大鼠动物模型的复制【3】
雄性Wistar大鼠32只，体重160-250g，随机分成生理盐水对照组(对照组)和哮喘发作组(哮喘组)。在实验的第1天、第3天、第5天大鼠腹腔注射抗原液1ml(含卵蛋白100mg，灭活百日咳杆菌疫苗5×109个，氢氧化铝干粉100mg)致敏；对照组则用等量生理盐水替代抗原液。2周后哮喘组超声雾化器向自制体描箱内喷雾1%卵蛋白激发，每天8：00~9：00吸入20min，隔日激发1次，共3次；对照组则用生理盐水代替抗原液以同样方法激发和记录。7天后按设计取材。所有大鼠均经呼吸曲线描记及肺组织病理学检查。
1.3实验方法
1.2.1取材：⑴腹腔注射麻醉戊巴比妥钠后，开胸气管插管，用生理盐水10ml注入气管肺组织内，反复抽吸三次，将抽取的肺泡灌洗液(BALF)放入离心管中，1000r/min离心5~10min，取上清液用于检测IL-5活性。离心的细胞沉淀，用含5%胎牛血清(FCS)的M-199培养液反复冲洗3次，调整培养液为1ml，取少量于载玻片上涂片，HE染色测定BALF中的细胞数及细胞分类。⑵在麻醉状态下取出肺脏，放入液氮罐迅速冰冻。⑶将上述组织制备冰冻切片厚度10μm，用于免疫组化染色。
1.2.2方法及试剂：⑴IL-5的测定：采用酶联免疫检测试剂盒(美国Endoger公司产品)，按说明书进行。⑵ICAM-1： ABC免疫组化染色。羊抗大鼠ICAM-1单抗为日本Seikagaku Corporti公司产品；ABC试剂盒购于北京邦定生物技术公司；DAB为美国Zymed公司产品。
1.2.3程序：切片水化后用95%的已醇脱脂，入3%的甲醇-H2O2孵育30min，封闭内源性过氧化物酶，3mol的尿素消化30min(室温)。然后按常规ABC法进行染色，羊抗大鼠ICAM-1单抗稀释度1：600，4℃过夜，生物素化的羊抗小鼠IgG 1：200，30min(37℃)，ABC复合物1：100，30min(37℃)，DAB显色，甲基绿复染，二甲苯透明，DPX封片。阴性对照以PBS和正常兔血清分别代替一抗作空白对照和替代对照。
1.2.4结果观察：细胞膜有棕黄色着染者为阳性。应用病理图象分析处理系统处理每一张切片，计算出阳性面积。, 百拇医药(魏庆宇)