采用PCR技术快速诊断MRSA感染对合理治疗MRSA感染的意义(1)
1、传统诊断方法
传统的也是临床通用的耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)诊断方法是体外敏感试验法。包括药敏纸片扩散法、试管二倍稀释法和平皿二倍稀释法。其基础都是使致病菌在含抗菌药物的环境下培养，根据细菌的生长与否判断敏感度。其中纸片法以药敏纸片周围抑菌圈的大小判断敏感性，后两种方法则是以抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)表示细菌对抗菌药物的敏感性。三者中以试管法和平皿法所得结果更为准确，更适合于临床耐药菌的检测。三者均因具有操作简便、结果直观和费用低廉等优点，在MRSA检测中被广泛应用。但对于不同耐药机制的金葡菌，有不同的治疗原则。因此，在耐药菌检测中，不论用哪种方法，均应注意由于环境因素引起的假阳性、假阴性的鉴别诊断。对于传统的诊断方法，检测用抗菌药物种类、浓度；细菌接种量；培养温度；培养基NaCl含量、pH值以及培养时间等均对MRSA检测结果有影响。为此，美国实验室标准全国委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standard, NCCLS)根据美国疾病控制中心(Center for Diseases Control, CDC)的研究，发表MRSA筛选和检测方法，并根据存在的问题进行必要的修改。这些检测方法被许多实验室参考应用。
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鉴于上述原因，许多研究者寻求用分子生物学技术建立一种更加稳定可靠的检测方法。在目前进行的这类研究中，以多聚酶链反应法较为简便可靠。
2、多聚酶链反应
多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种近十几年来发展起来的体外酶法合成特异DNA片断的分子生物学技术。自Saiki 1985年报道以来，以广泛应用于生命科学各个领域的研究中，并且以应用于感染性疾病的诊断。
PCR技术的基本原理是利用两个根据模板DNA特异碱基序列设计的寡核苷酸为引物，在一定反应条件下与模板特异性结合，并通过DNA多聚酶将两个引物沿模板延长，经过数十个反应循环后，可产生百万倍于模板量的特异性扩增产物。整个反应操作十分简便，并且由于自动化的DNA热循环仪和对热稳定的Taq多聚酶的应用，使反应仅需几小时即可完成，十分迅速。
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由于PCR技术具有高敏感性、高特异性和迅速简便易操作的特点，已在细菌感染诊断中广泛应用，并且已用于耐药菌株的检测。为临床早期快速准确诊断和选择合理治疗方案提供了极大便利。
目前已知，MRSA的主要耐药机制是由于细菌细胞内膜上的青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins, PBPs)有重要改变。MRSA能产生一种敏感金黄色葡萄球菌所没有的PBP，称PBP2a 或PBP2'。由于PBP2a与抗菌药物的亲和力极低且能代替其它PBPs的功能，因而细菌能够在高浓度抗菌药物存在的环境中得以生存。编码PBP2a的结构基因为mecA ，并受mecI和 mecR1基因的调节。mecA基因位于MRSA的环状染色体上，现已被克隆，其碱基序列也以清除，这为PCR方法检测MRSA提供了可能。
3、PCR检测MRSA方法
3.1 基本原理
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按mecA基因所特有的碱基序列设计一对寡聚核苷酸引物，以待测菌株DNA为模板，在Taq多聚酶作用下，将引物延伸。扩增区域由两个引物的5'末端决定。由此mecA基因携带株将最终产生特点长度DNA片断。扩增产物用含溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳测定，以特点长度的扩增产物存在与否判定PCR反应阳性或阴性，从而判定待测菌株是否为MRSA。
3.2 引物设计
碱基序列和碱基各成分的含量是引物设计能否成功的关键。引物中碱基序列的特异性是决定PCR特异性的最关键因素。研究表明，99%以上的MRSA具有mecA基因而甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)无此基因。因此，几乎所有研究者都根据mecA基因的碱基序列设计引物。, http://www.100md.com(李耘)
传统的也是临床通用的耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)诊断方法是体外敏感试验法。包括药敏纸片扩散法、试管二倍稀释法和平皿二倍稀释法。其基础都是使致病菌在含抗菌药物的环境下培养，根据细菌的生长与否判断敏感度。其中纸片法以药敏纸片周围抑菌圈的大小判断敏感性，后两种方法则是以抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)表示细菌对抗菌药物的敏感性。三者中以试管法和平皿法所得结果更为准确，更适合于临床耐药菌的检测。三者均因具有操作简便、结果直观和费用低廉等优点，在MRSA检测中被广泛应用。但对于不同耐药机制的金葡菌，有不同的治疗原则。因此，在耐药菌检测中，不论用哪种方法，均应注意由于环境因素引起的假阳性、假阴性的鉴别诊断。对于传统的诊断方法，检测用抗菌药物种类、浓度；细菌接种量；培养温度；培养基NaCl含量、pH值以及培养时间等均对MRSA检测结果有影响。为此，美国实验室标准全国委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standard, NCCLS)根据美国疾病控制中心(Center for Diseases Control, CDC)的研究，发表MRSA筛选和检测方法，并根据存在的问题进行必要的修改。这些检测方法被许多实验室参考应用。
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鉴于上述原因，许多研究者寻求用分子生物学技术建立一种更加稳定可靠的检测方法。在目前进行的这类研究中，以多聚酶链反应法较为简便可靠。
2、多聚酶链反应
多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种近十几年来发展起来的体外酶法合成特异DNA片断的分子生物学技术。自Saiki 1985年报道以来，以广泛应用于生命科学各个领域的研究中，并且以应用于感染性疾病的诊断。
PCR技术的基本原理是利用两个根据模板DNA特异碱基序列设计的寡核苷酸为引物，在一定反应条件下与模板特异性结合，并通过DNA多聚酶将两个引物沿模板延长，经过数十个反应循环后，可产生百万倍于模板量的特异性扩增产物。整个反应操作十分简便，并且由于自动化的DNA热循环仪和对热稳定的Taq多聚酶的应用，使反应仅需几小时即可完成，十分迅速。
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由于PCR技术具有高敏感性、高特异性和迅速简便易操作的特点，已在细菌感染诊断中广泛应用，并且已用于耐药菌株的检测。为临床早期快速准确诊断和选择合理治疗方案提供了极大便利。
目前已知，MRSA的主要耐药机制是由于细菌细胞内膜上的青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins, PBPs)有重要改变。MRSA能产生一种敏感金黄色葡萄球菌所没有的PBP，称PBP2a 或PBP2'。由于PBP2a与抗菌药物的亲和力极低且能代替其它PBPs的功能，因而细菌能够在高浓度抗菌药物存在的环境中得以生存。编码PBP2a的结构基因为mecA ，并受mecI和 mecR1基因的调节。mecA基因位于MRSA的环状染色体上，现已被克隆，其碱基序列也以清除，这为PCR方法检测MRSA提供了可能。
3、PCR检测MRSA方法
3.1 基本原理
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按mecA基因所特有的碱基序列设计一对寡聚核苷酸引物，以待测菌株DNA为模板，在Taq多聚酶作用下，将引物延伸。扩增区域由两个引物的5'末端决定。由此mecA基因携带株将最终产生特点长度DNA片断。扩增产物用含溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳测定，以特点长度的扩增产物存在与否判定PCR反应阳性或阴性，从而判定待测菌株是否为MRSA。
3.2 引物设计
碱基序列和碱基各成分的含量是引物设计能否成功的关键。引物中碱基序列的特异性是决定PCR特异性的最关键因素。研究表明，99%以上的MRSA具有mecA基因而甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)无此基因。因此，几乎所有研究者都根据mecA基因的碱基序列设计引物。, http://www.100md.com(李耘)