甲状腺疾病患者促甲状腺素受体膜外区基因突变的研究(2)
PCR产物上样5μl, 以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ为核酸分子量标准，80V 恒压电泳40分钟，在紫外灯下观察并摄片。
4.hTSHR膜外区cDNA序列分析：由于DNA测序仪有效DNA测定长度为550-600bp，故将此长为1304bp的hTSHR膜外区cDNA PCR产物分为三段测序，我们设计并合成了三对正、反向测序引物。hTSHR膜外区基因第一段正向引物P1—即上游引物，反向引物P1R 5'-GTCCAGTGTTGAAAATGCC-3'(494-512)；第二段正向引物P2 5'-ATGCCCTCAAAGAGCTCC-3'(459-476)，反向引物：P2R 5'-GTGAAGGAAACTCAAGGAAAGTGG-3'(890-913)；第三段正向引物P3 5'-ACCTGAAGGAACTGATAGC-3'(843-861)，反向引物：P3R—即下游引物。这样每个区域测序结果之间均有50个以上碱基互相重叠以便于衔接，保证了hTSHR膜外区基因序列分析的完整和准确。各段正、反向的测序又保证了hTSHR膜外区基因两端起始部位碱基的清晰阅读。采用Sanger双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)链末端终止法，进行PCR反应。反应体系为10×测序反应缓冲液5μl dNTP混和物1.0μl， ddUTP Dye Terminator各2.0μl，聚合酶(Polymerase Enzyme)1.0μl，DNA模板(纯化PCR产物)50ng，测序引物8.0 pmol，加超纯水至20μl。反应条件为96℃20秒，48℃20秒，60℃4分钟；共45个循环。PCR产物纯化后分三段进行正、反向序列测定。
, 百拇医药
结 果
一、甲状腺总RNA提取
所有甲状腺组织样品总RNA在260nm和280nm波长的光密度比值OD260nm/OD280nm，在1.7―2.0之间，说明所得总RNA质量较好，蛋白质等污染少。
二、RT-PCR扩增hTSHR膜外区cDNA
样品PCR产物在λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ核酸分子量标准的1375bp前方1304bp处有一条清晰带，与引物设计时预期的基因片段大小相符。阳性对照PCR产物在564bp前方523bp处可见一条清晰带，与逆转录试剂盒相符。而阴性对照未见任何条带。
三.正常人和甲状腺疾病患者hTSHR膜外区基因序列分析
将所有样品的hTSHR膜外区基因序列进行比较分析后发现，正常甲状腺组织与各种甲状腺疾病患者的甲状腺组织的TSHR膜外区基因序列均与Nagayama Y等[4]或Misrahi M等[5]报告的hTSHR膜外区基因序列完全相同。甲状腺疾病组未发现有hTSHR膜外区的基因突变。但在第661位核苷酸(187号密码子的最后一位核苷酸)发现有碱基替代现象：在正常人中3例为胸腺嘧啶“T”，1例为胞嘧啶“C”；27例患者中，17例为碱基 “T”，10例为碱基“C”。此位置上碱基为“T”者共20例，与Nagayama Y等报告的hTSHR膜外区基因序列相同，其中8例在测序电泳图上呈单色峰，12例在测序电泳图上呈双色峰，“T”峰与“C”峰的峰高相等或相近。测序仪自动识别为“T”。在此位置上碱基为“C”者共11例，与Misrahi M等报告的hTSHR膜外区基因序列相同，在测序电泳图上呈单色峰。由于在此位置上无论是“T”还是“C”，即第187密码子无论是“AAT”还是“AAC"，因为遗传密码的简并性，它们所编码的氨基酸是相同的，均为天冬酰胺(asparagine，Asn)，故并不影响hTSHR膜外区蛋白的氨基酸组成。
讨 论
编码hTSHR的基因长度为60多千碱基(kilobase，kb)。由10个外显子(exon)和9个内含子(intron)组成。TSHR蛋白分为膜外、跨膜和膜内区三部分，膜外区较长，由418个氨基酸组成；跨膜区由264个氨基酸组成，有7个跨膜段，3个膜外区环和3个膜内区环；膜内区有82个氨基酸。其中编码hTSHR蛋白的基因长度是2470碱基对(bp)，第1-9外显子编码hTSHR的膜外区蛋白，第10外显子编码跨膜区和膜内区蛋白，编码hTSHR膜外区的基因长度是1300bp[4]。, 百拇医药(张遵城 方佩华 周津东)
4.hTSHR膜外区cDNA序列分析：由于DNA测序仪有效DNA测定长度为550-600bp，故将此长为1304bp的hTSHR膜外区cDNA PCR产物分为三段测序，我们设计并合成了三对正、反向测序引物。hTSHR膜外区基因第一段正向引物P1—即上游引物，反向引物P1R 5'-GTCCAGTGTTGAAAATGCC-3'(494-512)；第二段正向引物P2 5'-ATGCCCTCAAAGAGCTCC-3'(459-476)，反向引物：P2R 5'-GTGAAGGAAACTCAAGGAAAGTGG-3'(890-913)；第三段正向引物P3 5'-ACCTGAAGGAACTGATAGC-3'(843-861)，反向引物：P3R—即下游引物。这样每个区域测序结果之间均有50个以上碱基互相重叠以便于衔接，保证了hTSHR膜外区基因序列分析的完整和准确。各段正、反向的测序又保证了hTSHR膜外区基因两端起始部位碱基的清晰阅读。采用Sanger双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)链末端终止法，进行PCR反应。反应体系为10×测序反应缓冲液5μl dNTP混和物1.0μl， ddUTP Dye Terminator各2.0μl，聚合酶(Polymerase Enzyme)1.0μl，DNA模板(纯化PCR产物)50ng，测序引物8.0 pmol，加超纯水至20μl。反应条件为96℃20秒，48℃20秒，60℃4分钟；共45个循环。PCR产物纯化后分三段进行正、反向序列测定。
, 百拇医药
结 果
一、甲状腺总RNA提取
所有甲状腺组织样品总RNA在260nm和280nm波长的光密度比值OD260nm/OD280nm，在1.7―2.0之间，说明所得总RNA质量较好，蛋白质等污染少。
二、RT-PCR扩增hTSHR膜外区cDNA
样品PCR产物在λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ核酸分子量标准的1375bp前方1304bp处有一条清晰带，与引物设计时预期的基因片段大小相符。阳性对照PCR产物在564bp前方523bp处可见一条清晰带，与逆转录试剂盒相符。而阴性对照未见任何条带。
三.正常人和甲状腺疾病患者hTSHR膜外区基因序列分析
将所有样品的hTSHR膜外区基因序列进行比较分析后发现，正常甲状腺组织与各种甲状腺疾病患者的甲状腺组织的TSHR膜外区基因序列均与Nagayama Y等[4]或Misrahi M等[5]报告的hTSHR膜外区基因序列完全相同。甲状腺疾病组未发现有hTSHR膜外区的基因突变。但在第661位核苷酸(187号密码子的最后一位核苷酸)发现有碱基替代现象：在正常人中3例为胸腺嘧啶“T”，1例为胞嘧啶“C”；27例患者中，17例为碱基 “T”，10例为碱基“C”。此位置上碱基为“T”者共20例，与Nagayama Y等报告的hTSHR膜外区基因序列相同，其中8例在测序电泳图上呈单色峰，12例在测序电泳图上呈双色峰，“T”峰与“C”峰的峰高相等或相近。测序仪自动识别为“T”。在此位置上碱基为“C”者共11例，与Misrahi M等报告的hTSHR膜外区基因序列相同，在测序电泳图上呈单色峰。由于在此位置上无论是“T”还是“C”，即第187密码子无论是“AAT”还是“AAC"，因为遗传密码的简并性，它们所编码的氨基酸是相同的，均为天冬酰胺(asparagine，Asn)，故并不影响hTSHR膜外区蛋白的氨基酸组成。
讨 论
编码hTSHR的基因长度为60多千碱基(kilobase，kb)。由10个外显子(exon)和9个内含子(intron)组成。TSHR蛋白分为膜外、跨膜和膜内区三部分，膜外区较长，由418个氨基酸组成；跨膜区由264个氨基酸组成，有7个跨膜段，3个膜外区环和3个膜内区环；膜内区有82个氨基酸。其中编码hTSHR蛋白的基因长度是2470碱基对(bp)，第1-9外显子编码hTSHR的膜外区蛋白，第10外显子编码跨膜区和膜内区蛋白，编码hTSHR膜外区的基因长度是1300bp[4]。, 百拇医药(张遵城 方佩华 周津东)