细胞凋亡的生物化学机制
凋亡(apoptosis)---有规律的细胞降解---是一个复杂的过程。死亡的决定并非是轻而易 举的做出的，许多基因的活动影响了细胞启动自我降解过程的可能性。这个决定做出之后， 凋亡程序的正确执行有赖于一系列亚过程的协调启动和活化。我在本篇综述中总结了这个死 亡过程的几个基本方面，描述了它们如何相互作用，协调调节凋亡过程，对几个主要的死亡 活化途径进行了讨论。
多细胞生物往往需要去除多余的细胞，在某种程度上讲，如果不这样，将是非常危险的， 就此点而言，它们启用了特定的分子过程。有规律的细胞死亡和细胞的分裂及迁移一样重要， 他是生物可以控制细胞数目的多少及组织形态，使它们免于遭受影响自身稳定的异常细胞的 影响。
发展生物学家及细胞学家的多次发现和重复发现使程序化细胞死亡在过去的两个世纪 里有了数个不同的名字，但最终背人们接受的是apoptosis—凋亡。这个名词由Currie和他 (她)的同事在1972年提出，当时被用来描述许多作者在不同组织和细胞类型中观察到的 共有的程序化细胞死亡。作者们发现这些濒死的细胞中有着许多共有的形态学特点，与在病 理性坏死性细胞死亡中发现的特点有着显著的不同。他们提出这些共有的形态学特点可能是 未被发现的、统一的、保守的、内原性细胞死亡的结果。
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Caspases:中心的执行者
Kerr等观察到的大多数形态学变化都是由一系列在凋亡细胞中被激活的半胱氨酸蛋白 酶(cysteine protease)所导致的。这些死亡性蛋白酶相互之间具有同源性，是Caspases大家 族中的一个部分。Caspases在进化过程中是高度保守的，从人类到昆虫、线虫及水螅，体内 均有发现。人体内已经有十几种Caspases被发现，并且研究显示，其中的2/3与凋亡有关。 目前所有已知的Caspases均有一个活性半胱氨酸位点，且在Asp-Xxx键处分解底物， 即在天冬氨酸残基的后面。Caspases对底物的特异性由断裂点氨基末端侧的四个氨基酸残基 决定。根据Caspases对底物的选择性、序列的同源性、及结构的相似性，可以将Caspases 分为若干个亚家族。由于它们导致了几乎所有可见的细胞凋亡的特征性改变，所以Caspases 可以被认为是凋亡途径中处于中心地位的执行者。实际上，无论是通过突变还是小的药理学 抑制剂导致Caspase活性下降后，均可使凋亡减缓或是细胞完全免于凋亡。一次阻断Caspases 可以挽救已经走向凋亡的细胞的命运。这一点已经引起了制药业的注意。
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它又切又割，而且不仅如此，…
Caspases到底在调往中扮演了一个什么样的重要角色呢?Caspases并不是将细胞蛋白彻 头彻尾的降解,而是降解有限的特定目标蛋白,并且是在一个或数个特定一级序列中的位点 (经常是在天冬氨酸残基的后面)。在大多数情况下，经过Caspases的手术后目标蛋白会失 去活性(Box1)。但是Caspases亦可激活蛋白。可以直接去掉负性调节区，也可以间接的使 调节亚基失活。
近年来，已经有一些重要的Caspase底物被确定。一向令人兴奋的发现是阐明了核酸酶 的激活机制，后者导致了著名的核小体梯子(nucleosomal ladder)。Wyllie首先描述了这种 现象。这种核酸酶在核小体之间切割基因组DNA使DNA降解为约180个碱基对的整数 倍大小的片断(…fragments with length corresponding to multiple integers of approximately 180 base pairs)这种DNA梯子的出现被广泛的用作(甚至是滥用)凋亡性细胞死亡的标志。 在一系列简而精的实验中，Wang和Nagata的小组证实DNA梯子核酸酶(现在公认为 就是Caspase-actived Dnase 或 CAD)在活细胞中就已经存在，只是和抑制性亚基结合成复 合物，即所谓的ICAD。CAD的激活机制是通过Caspase-3介导抑制性亚基去除进而释放 并激活催化亚基。 Caspase介导的特定底物的分解也可以解释凋亡的其他几个特征。例如：核的皱缩和芽 生需要Caspase降解核层状蛋白体，而细胞骨架蛋白胞衬蛋白(fodrin)和凝胶溶胶素 (gelsolin)的破坏是导致细胞整体形态变化的原因。最后，Caspase介导分裂p21激活的 激酶家族成员之一PAK2可能会导致凋亡中所观察到的大疱样变。有趣的是在这个实例中， Caspase在负性调节亚基和催化亚基之间切开了底物。导致了PAK2的基本激活(constitutive activation)。 近年来，报道了大约100种Caspase底物，而且肯定会更多。为什么会有这么多底物呢？ 可能凋亡本身就比我们现在所认为的要复杂的多。事实上人们对一些重要的凋亡的分支过程 如细胞的皱缩和弥散信号的释放还知之甚少。另一种可能是或许所提及的Caspase底物并非 直接相关的底物，而是“被扯进来的无辜的旁观者”。如果有这种原因，当细胞失去功能时， 对这些非直接相关底物上偶尔存在的Caspase酶切位点的选择性可能不是很大。这个问题需 要进一步实验来解决。
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Caspase的活化
既然Caspase的活化在细胞的凋亡中如此重要，要想更好的理解凋亡，就需要理解 Caspases 是如何活化的。正如其他的蛋白酶一样，Caspase在刚开始合成时时以酶原的形式 存在的。这些酶原包含三个结构域：N-末端前结构域、p20和p10结构域，后两者可见于成 熟的Caspases。目前已有的研究证明，成熟的Caspases是异四聚体包括两个p20/p10异二聚 体，含有两个活性位点。虽然许多研究证实活性的Caspase具有两个活性位点，但是没有 结构上的原因可以解释为什么会是这样。因为在一定的条件下Caspase 很可能以活性单体的 形式存在。目前已知，Caspase有三种活化机制，下面分别作简单介绍。
(1) 被上级Caspase活化
多数的Caspase通过在p20和p10基团之间水解而被激活，并且通常在前结构域 (prodomain)和p20之间也被切割。有趣的是这些切割均发生在Asp-X位点，而这正是 Caspase底物的有效位点。事实上最有效的活化前Caspase(procaspase)的方法就是将其暴 露于另一个已经活化的Caspase之中。这种级联式的Caspase活化方法是细胞中三种短前结 构域Caspase的最广泛的激活机制，这三种Caspase是Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7。 这三个下游Caspase被认为是Caspase家族功能的主要执行者。并且比其它的长前结构域的 Caspase更充足，更有活性。这种级联式激活对激活信号的放大和传导具有非常重要的作用。 但是，这种激活方法无法解释处于最上游的一个Caspase是如何被激活的。至少还有两种其 它通路才能使所有现象得到圆满解释。
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(2)诱导聚集激活
Caspase-8是死亡受体途径中的重要起始Caspase与配体结合后死亡受体如CD95会集合 形成膜联结信号传导复合物。(box3)然后这些复合物就会通过调节蛋白接纳几个分子的 procaspase-8结果使局部酶原的浓度上升。诱导聚集模型指出：在这种过于拥挤的情况下 procaspase-8固有的微弱的蛋白酶活性就会使不同的前酶分子之间相互切割并激活 (box2)。有人提出这种机制还介导了其它几种Caspase的激活包括Caspase-2和nematode (线虫)Caspase CED-3。虽然这种强制性的酶原聚集在很多情况下完全可以激活 Caspase，但用这方法来控制细胞的命运未免过于粗糙。这种概念可能是正确的，然而在体 内肯定还存在着其它对这个过程的不同水平的调节。
(3)调节亚基相关性激活
迄今为止，激活机制最为复杂的就要数Caspase-9了，与其它Caspase不同procaspase-9 的蛋白水解处理仅在Caspase-9的催化活性的形成中起到了一小部分作用。而Caspase-9 的激活的一个重要的条件就是与特定的蛋白辅因子Apaf结合( box2)。 已经通过生物化学方法证明，Apaf是Caspase-9激活所必需的2种蛋白之一，另一种是 细胞色素c。原来认为Apaf-1/Caspase-9复合物对于Caspase-9的激活来说仅是一种临时 性需要，而现在看来，它代表着Caspase-9的真正活性形式，因此，我们不能简单的把Apaf-1 看作是Caspase-9的激活因子，它应是Caspase-9全酶所必需的调节性亚基。这种全酶常被 称为apoptosome ,这是一个非常大的复合物，它可能还含有其它几种蛋白。 总而言之，效应Caspase通常被上级Caspase激活，而起始的Caspase则是通过有规律 的蛋白-蛋白相互作用而激活，其真正的分子机制尚不完全清楚，很可能较人们现在所认为 的要复杂的多。
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有规律的蛋白-蛋白相互作用是潜在的凋亡主题之一。无需引用一个酶，即可勾勒出 Caspase活化的途径(box3)。下面我要介绍更多经常遇到的相互作用部件
改变细胞命运的握手
每一个具有长前结构域Caspase均在其前结构域中含有一个蛋白-蛋白相互作用部件使 它们可以和上游调节因子结合并且相互作用。Caspase-8和Caspase-10有一个死亡效应因子 区(DED)，而Caspase-2和-9则有Caspase活化的聚集结构域(CARD)，这些结构域在氨 基酸序列上并无同源性但其三维结构却极其相似。包括6个具有Greek key构型的 antiparrallel-α-helices。在死亡结构域中亦发现有相似的折叠，死亡结构域见于CD95等凋 亡调节因子，是第三个蛋白相互作用部件。死亡结构域、DED和CARD似乎具有相同的 祖先结构域。
死亡结构域、DED和CARD的结构与其功能十分相适。6个 antiparrallel helices 挤入 一个紧密的核心。暴露了一个相当大的表面，在进化过程中，这个表面上行成了广泛的蛋白 -蛋白作用区域。各种蛋白用用来相互作用的部件的特异性交界面是各不相同的。到目 前为止的研究发现，死亡调节部件通常介导家族内部的相互作用，即DED/DED、 CARD/CARD之间的作用。然而结构分析表明，结合后的死亡结构域、DED和CARD仍有 很大空间可以与其它蛋白相互作用。也许死亡调节部件本身的作用即是一个整合平台，可以 结合数种蛋白质，而这些蛋白质又可以调节(部件？)之间的二聚化，增强Caspase的活化。
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与朋友靠近，与敌人靠的更近了
有规律的蛋白-蛋白相互作用，对于我们理解另一套凋亡调节物质系统同样具有重要意 义，这个系统就是bcl-2家族。根据其结构的相似性和功能定义，可以将bcl-2家族分为三 群(group)(box4 )，第一群抗凋亡，第二群、第三群则促进凋亡。 Bcl-2家族到底是如何控制细胞的死亡的呢？bcl-2家族的成员似乎大部分时间都在相互 阻断对方的下一步移动。许多成员可以形成同二聚体，但更重要的是促凋亡成员和抗凋亡成 员之间可以形成异二聚体。由于一个bcl-2家族的成员可以和几种其它成员相互作用，在同 一个细胞中也就可以形成大量的异聚体。做一个简单的比喻，异二聚体的形成是结合的 促凋亡成员和抗凋亡成员之间的相互中和。这样问题就变成了抗凋亡成员与促凋亡成员之间 总体水平的比较：促凋亡成员较多的细胞对凋亡较为敏感，而含抗凋亡成员较多的细胞则对 凋亡有明显的抗性。
显然bcl-2成员要影响细胞的死亡，其相互作用不应仅仅是信息的交换。这些相互作用 的结果是什么呢？在nemanote caenorhabditis elegans(新小杆线虫属？)中具有抗凋亡作用的 bcl-2的同源物CED-9可以通过直接与Apaf-1的同源物CED-4结合，使之隔离，从而保护 细胞免于死亡(ref.37)。虽然这是一个诱人的蓝图，但在哺乳动物中找到相同作用方式的 可能性很小，即使有也非常困难，至少在目前已经测试的条件下尚未找到。不过bcl-2 家族的一项重要作用就是调节一系列促凋亡因子，尤其是细胞色素c从线粒体到细胞质的释 放。
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线粒体——死亡之论坛
线粒体不仅是细胞的能量工厂，并且是一个武器库。线粒体使一系列潜在的促凋亡蛋白 的前体相互隔离，其中最为突出的是细胞色素c，这个忠实的(humble)电子传递者。在过 去的几年的研究中发现：细胞色素c远非无害的。它除了在线粒体内参与氧化磷酸化以外， 它与调节蛋白Apaf-1一起是细胞浆内Caspase-9激活所必需的部件之一。细胞色素c到底 是如何通过线粒体外膜的，目前还尚不清楚。但很明确bcl-2家族密切参与了这一过程的调 节。例如：bcl-2家族中的促凋亡成员与分离(isolated)的线粒体结合以后就足以诱导细胞 色素c的释放。而过度表达的bcl-2家族就能阻断这些。关于bcl-2家族调节细胞色素 c释放的确切机制有几种不同的假说，但都还没有得到确切的证明。下面是三个基本 的模型。
Bcl-2家族成员构成了通道，使蛋白的转运易化。
由于bcl-XL和白喉毒素的穿孔亚基在结构上有相似性，有人推断：当bcl-2蛋白发生 构象变化后，它们可以插入到线粒体的外膜，形成一个通道，甚至是一个大洞。Bcl-2家族 的确可以插入到合成的脂类双层膜上，并且可以寡聚化，形成分散的传导通道，但这些通 道的大小是否可以让蛋白通过还是一个问题。
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Bcl-2家族成员与其它蛋白相互作用形成通道。
Bcl-2家族成员可以与很多蛋白质相互作用。因此存在下面的可能性：bcl-2家族中的促 凋亡成员可以募集线粒体外膜上的其它蛋白质，而形成一个大的孔状通道。其中一个倍受关 注的目标蛋白就是电压依赖型阴离子通道蛋白(VDAC，Voltage Dependent Anion Channel)， 因为有数种bcl-2家族的成员可以与之结合，并调节通道活性。由于已知的VDAC通道孔 径很小，无法让蛋白质通过，因此要承认这个模型就必须设想VDAC在与bcl-2家族成员结 合后发生了明显的构相变化。
Bcl-2家族成员使线粒体外膜破裂。
Bcl-2家族成员有可能控制着线粒体的自身稳定作用。在这个模型中，(首先是)凋亡信 号改变了线粒体的生理活动(例如：离子的转运和氧化磷酸化)，进而线粒体发生了肿胀， 最后导致了线粒体外膜的破裂和膜间隙中的蛋白质向细胞质释放。构建一个足够大、可以使 细胞色素c通过的通道的问题就这样被绕道解决了。因为蛋白质可以以单纯扩散得方式通过 脂类双分子膜上的撕裂孔。
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Bcl-2家族可以直接影响(例如通过上面所提及的控制内在离子通道的活性)或间接的 通过对其它线粒体蛋白的调节而影响线粒体的自身稳定。而VDAC同样也是这种调节的一 个引人注目的目标蛋白。因为它是线粒体通透性转换孔(PTP，permeability transition pore) 的一个亚基。而PTP是一个巨大的通道，开放后可以导致膜电位迅速降低和细胞器的肿胀。 PTP的开放会使细胞色素c迅速释放进而使细胞走向凋亡，而PTP的药理性抑制物可以作 为有效的细胞色素c释放的抑制物。因此它可以阻止凋亡。然而在出现细胞色素c的外溢 时可以不伴有膜电位的下降。这些均提示PTP不可能是bcl-2家族的唯一靶部位。 细胞色素c的释放可能是凋亡细胞最普遍地特点之一。但在有些情况下，这是一个非常 晚期的事件。例如死亡受体所介导的细胞凋亡经常可以绕过线粒体途径。正像所想象的一 样，从上面所讨论的模型来看这种细胞死亡对bcl-2的保护作用相对不敏感(ref.45)。而细 胞色素c的释放好象是Caspase激活的结果，而不是原因。
细胞色素c仅仅是存在于线粒体的促凋亡物质之一，存在于线粒体并且可以被凋亡诱导 释放的物质还有AIF、(一种潜在地具有神秘活性的黄素蛋白)、Smac/DIASBLO和其他几种 促凋亡酶：包括促凋亡酶-2，-3 ,-9。多种促死亡因子的释放对于迅速而确定性的细胞死亡是 必需的。后者是确保凋亡级联反应激活成为单向反应的程序的一部分
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凋亡反应的解毒剂和解-解毒剂
线粒体释放促死亡因子是凋亡反应的不可逆点吗？一系列的证据表明细胞偶尔会在这 个水平恢复活力，至少是暂时性的。首先药理性的caspase抑制剂经常可以使细胞免于凋亡。 其次，Caspase-3，-9基因敲除的小鼠在发育过程中神经系统凋亡减少，而且对于刺激引 起的凋亡的反应性有明显得缺陷。第三，在哺乳动物(果蝇，drosophia线虫和一些病毒) 都带有一些可以编码潜在地Caspase抑制物即IAP蛋白的基因，如果它们不能影响凋亡的进 程，那么这些基因地存在就毫无意义了。
根据以上的观点，细胞在凋亡时很可能在经历一个终末的单结果却不确定的事件，让各 种凋亡信号沿各种途径不断地下传，但从不充分的执行。但是这种印象是错误的，恰恰相反， 在凋亡的途径中包含有数个增强步骤和正反馈循环。这样就可以确保细胞要么完全死亡要么 从凋亡进程中脱离。例如，procaspases作为caspase的底物可以使一系列的酶原迅速而完全 的活化，即使在一开始仅有几个分子活化。同样在Capase的激活和线粒体释放细胞色素c 之间也存在正反馈循环。
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但是正反馈必须有缓冲和或减速剂，否则仅有微小的干扰就可以完全激活凋亡进程和最 终导致细胞凋亡。IAP蛋白可能就是这样的减速剂。它很可能不是保护细胞免于自杀性的刺 激，而是阻止那些不适当地、自发？的Caspase的激活。最近发现的哺乳动物IAP抑制物 Smac或者DIABLO也支持这一观点。Reaper，Hid，Grim等对线虫的研究表明Smac/DIABLO 可以与IAP成员结合，中和其抗凋亡活性。更有趣的是Smac/DIABLO在正常情况下是线粒 体的蛋白，在被诱导凋亡的细胞中，它释放到细胞浆中，途径可能和细胞色素c一样。 因此，细胞在凋亡时释放线粒体内容物，Smac/DIABLO也就被释放，隔离了IAP，是 他们无法阻止(凋亡)的进程。同样，bcl-2家族被认为是缓冲意外线粒体释放的物质。很 可能还存在其它待发现的缓冲物质。
凋亡是不是应该改名叫“甜美的死亡”？
Caspase的激活是不是凋亡性细胞死亡的特征呢？正如本文开始提到的那样，大多数甚 至是全部开始被用来描述凋亡的形态学改变得特征的出现都依赖于Caspase的激活。但凋亡 的程序决不仅仅是Caspases。在许多细胞中启动凋亡程序都会不可避免得导致凋亡，但可以 有或没有Caspase的激活。在Caspase被阻断时，程序化细胞死亡的形态学特征一点也不象 凋亡，甚至更像传统的坏死性死亡。
不仅如此，不具有凋亡特点的生理性细胞死亡已经被发现多年，我们对此如何分类呢？ 不典型凋亡？坏死？非凋亡性程序化死亡？最终的决定不能由形态学来判断。主要应看在濒 死的细胞中哪些分子途径被激活，这有赖于对凋亡蛋白更精确的分析。 结论：凋亡领域的研究起源于一些兢兢业业的病理学家的细心观察、理解？、结论。正 如Yogi Berra所说“通过看，我们可以观察到很多东西”。虽然已经发现了许多重要的凋亡 蛋白，但是我们对这些分子的作用和激活机制仍知之甚少。Caspase的下游事件还不清楚。 仍有数种细胞死亡尚未涉及。我们需要“更多的观察，更多的结论”在可预见的将来，细胞 死亡仍是一个研究的热点。, 百拇医药
多细胞生物往往需要去除多余的细胞，在某种程度上讲，如果不这样，将是非常危险的， 就此点而言，它们启用了特定的分子过程。有规律的细胞死亡和细胞的分裂及迁移一样重要， 他是生物可以控制细胞数目的多少及组织形态，使它们免于遭受影响自身稳定的异常细胞的 影响。
发展生物学家及细胞学家的多次发现和重复发现使程序化细胞死亡在过去的两个世纪 里有了数个不同的名字，但最终背人们接受的是apoptosis—凋亡。这个名词由Currie和他 (她)的同事在1972年提出，当时被用来描述许多作者在不同组织和细胞类型中观察到的 共有的程序化细胞死亡。作者们发现这些濒死的细胞中有着许多共有的形态学特点，与在病 理性坏死性细胞死亡中发现的特点有着显著的不同。他们提出这些共有的形态学特点可能是 未被发现的、统一的、保守的、内原性细胞死亡的结果。
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Caspases:中心的执行者
Kerr等观察到的大多数形态学变化都是由一系列在凋亡细胞中被激活的半胱氨酸蛋白 酶(cysteine protease)所导致的。这些死亡性蛋白酶相互之间具有同源性，是Caspases大家 族中的一个部分。Caspases在进化过程中是高度保守的，从人类到昆虫、线虫及水螅，体内 均有发现。人体内已经有十几种Caspases被发现，并且研究显示，其中的2/3与凋亡有关。 目前所有已知的Caspases均有一个活性半胱氨酸位点，且在Asp-Xxx键处分解底物， 即在天冬氨酸残基的后面。Caspases对底物的特异性由断裂点氨基末端侧的四个氨基酸残基 决定。根据Caspases对底物的选择性、序列的同源性、及结构的相似性，可以将Caspases 分为若干个亚家族。由于它们导致了几乎所有可见的细胞凋亡的特征性改变，所以Caspases 可以被认为是凋亡途径中处于中心地位的执行者。实际上，无论是通过突变还是小的药理学 抑制剂导致Caspase活性下降后，均可使凋亡减缓或是细胞完全免于凋亡。一次阻断Caspases 可以挽救已经走向凋亡的细胞的命运。这一点已经引起了制药业的注意。
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它又切又割，而且不仅如此，…
Caspases到底在调往中扮演了一个什么样的重要角色呢?Caspases并不是将细胞蛋白彻 头彻尾的降解,而是降解有限的特定目标蛋白,并且是在一个或数个特定一级序列中的位点 (经常是在天冬氨酸残基的后面)。在大多数情况下，经过Caspases的手术后目标蛋白会失 去活性(Box1)。但是Caspases亦可激活蛋白。可以直接去掉负性调节区，也可以间接的使 调节亚基失活。
近年来，已经有一些重要的Caspase底物被确定。一向令人兴奋的发现是阐明了核酸酶 的激活机制，后者导致了著名的核小体梯子(nucleosomal ladder)。Wyllie首先描述了这种 现象。这种核酸酶在核小体之间切割基因组DNA使DNA降解为约180个碱基对的整数 倍大小的片断(…fragments with length corresponding to multiple integers of approximately 180 base pairs)这种DNA梯子的出现被广泛的用作(甚至是滥用)凋亡性细胞死亡的标志。 在一系列简而精的实验中，Wang和Nagata的小组证实DNA梯子核酸酶(现在公认为 就是Caspase-actived Dnase 或 CAD)在活细胞中就已经存在，只是和抑制性亚基结合成复 合物，即所谓的ICAD。CAD的激活机制是通过Caspase-3介导抑制性亚基去除进而释放 并激活催化亚基。 Caspase介导的特定底物的分解也可以解释凋亡的其他几个特征。例如：核的皱缩和芽 生需要Caspase降解核层状蛋白体，而细胞骨架蛋白胞衬蛋白(fodrin)和凝胶溶胶素 (gelsolin)的破坏是导致细胞整体形态变化的原因。最后，Caspase介导分裂p21激活的 激酶家族成员之一PAK2可能会导致凋亡中所观察到的大疱样变。有趣的是在这个实例中， Caspase在负性调节亚基和催化亚基之间切开了底物。导致了PAK2的基本激活(constitutive activation)。 近年来，报道了大约100种Caspase底物，而且肯定会更多。为什么会有这么多底物呢？ 可能凋亡本身就比我们现在所认为的要复杂的多。事实上人们对一些重要的凋亡的分支过程 如细胞的皱缩和弥散信号的释放还知之甚少。另一种可能是或许所提及的Caspase底物并非 直接相关的底物，而是“被扯进来的无辜的旁观者”。如果有这种原因，当细胞失去功能时， 对这些非直接相关底物上偶尔存在的Caspase酶切位点的选择性可能不是很大。这个问题需 要进一步实验来解决。
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Caspase的活化
既然Caspase的活化在细胞的凋亡中如此重要，要想更好的理解凋亡，就需要理解 Caspases 是如何活化的。正如其他的蛋白酶一样，Caspase在刚开始合成时时以酶原的形式 存在的。这些酶原包含三个结构域：N-末端前结构域、p20和p10结构域，后两者可见于成 熟的Caspases。目前已有的研究证明，成熟的Caspases是异四聚体包括两个p20/p10异二聚 体，含有两个活性位点。虽然许多研究证实活性的Caspase具有两个活性位点，但是没有 结构上的原因可以解释为什么会是这样。因为在一定的条件下Caspase 很可能以活性单体的 形式存在。目前已知，Caspase有三种活化机制，下面分别作简单介绍。
(1) 被上级Caspase活化
多数的Caspase通过在p20和p10基团之间水解而被激活，并且通常在前结构域 (prodomain)和p20之间也被切割。有趣的是这些切割均发生在Asp-X位点，而这正是 Caspase底物的有效位点。事实上最有效的活化前Caspase(procaspase)的方法就是将其暴 露于另一个已经活化的Caspase之中。这种级联式的Caspase活化方法是细胞中三种短前结 构域Caspase的最广泛的激活机制，这三种Caspase是Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7。 这三个下游Caspase被认为是Caspase家族功能的主要执行者。并且比其它的长前结构域的 Caspase更充足，更有活性。这种级联式激活对激活信号的放大和传导具有非常重要的作用。 但是，这种激活方法无法解释处于最上游的一个Caspase是如何被激活的。至少还有两种其 它通路才能使所有现象得到圆满解释。
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(2)诱导聚集激活
Caspase-8是死亡受体途径中的重要起始Caspase与配体结合后死亡受体如CD95会集合 形成膜联结信号传导复合物。(box3)然后这些复合物就会通过调节蛋白接纳几个分子的 procaspase-8结果使局部酶原的浓度上升。诱导聚集模型指出：在这种过于拥挤的情况下 procaspase-8固有的微弱的蛋白酶活性就会使不同的前酶分子之间相互切割并激活 (box2)。有人提出这种机制还介导了其它几种Caspase的激活包括Caspase-2和nematode (线虫)Caspase CED-3。虽然这种强制性的酶原聚集在很多情况下完全可以激活 Caspase，但用这方法来控制细胞的命运未免过于粗糙。这种概念可能是正确的，然而在体 内肯定还存在着其它对这个过程的不同水平的调节。
(3)调节亚基相关性激活
迄今为止，激活机制最为复杂的就要数Caspase-9了，与其它Caspase不同procaspase-9 的蛋白水解处理仅在Caspase-9的催化活性的形成中起到了一小部分作用。而Caspase-9 的激活的一个重要的条件就是与特定的蛋白辅因子Apaf结合( box2)。 已经通过生物化学方法证明，Apaf是Caspase-9激活所必需的2种蛋白之一，另一种是 细胞色素c。原来认为Apaf-1/Caspase-9复合物对于Caspase-9的激活来说仅是一种临时 性需要，而现在看来，它代表着Caspase-9的真正活性形式，因此，我们不能简单的把Apaf-1 看作是Caspase-9的激活因子，它应是Caspase-9全酶所必需的调节性亚基。这种全酶常被 称为apoptosome ,这是一个非常大的复合物，它可能还含有其它几种蛋白。 总而言之，效应Caspase通常被上级Caspase激活，而起始的Caspase则是通过有规律 的蛋白-蛋白相互作用而激活，其真正的分子机制尚不完全清楚，很可能较人们现在所认为 的要复杂的多。
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有规律的蛋白-蛋白相互作用是潜在的凋亡主题之一。无需引用一个酶，即可勾勒出 Caspase活化的途径(box3)。下面我要介绍更多经常遇到的相互作用部件
改变细胞命运的握手
每一个具有长前结构域Caspase均在其前结构域中含有一个蛋白-蛋白相互作用部件使 它们可以和上游调节因子结合并且相互作用。Caspase-8和Caspase-10有一个死亡效应因子 区(DED)，而Caspase-2和-9则有Caspase活化的聚集结构域(CARD)，这些结构域在氨 基酸序列上并无同源性但其三维结构却极其相似。包括6个具有Greek key构型的 antiparrallel-α-helices。在死亡结构域中亦发现有相似的折叠，死亡结构域见于CD95等凋 亡调节因子，是第三个蛋白相互作用部件。死亡结构域、DED和CARD似乎具有相同的 祖先结构域。
死亡结构域、DED和CARD的结构与其功能十分相适。6个 antiparrallel helices 挤入 一个紧密的核心。暴露了一个相当大的表面，在进化过程中，这个表面上行成了广泛的蛋白 -蛋白作用区域。各种蛋白用用来相互作用的部件的特异性交界面是各不相同的。到目 前为止的研究发现，死亡调节部件通常介导家族内部的相互作用，即DED/DED、 CARD/CARD之间的作用。然而结构分析表明，结合后的死亡结构域、DED和CARD仍有 很大空间可以与其它蛋白相互作用。也许死亡调节部件本身的作用即是一个整合平台，可以 结合数种蛋白质，而这些蛋白质又可以调节(部件？)之间的二聚化，增强Caspase的活化。
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有规律的蛋白-蛋白相互作用，对于我们理解另一套凋亡调节物质系统同样具有重要意 义，这个系统就是bcl-2家族。根据其结构的相似性和功能定义，可以将bcl-2家族分为三 群(group)(box4 )，第一群抗凋亡，第二群、第三群则促进凋亡。 Bcl-2家族到底是如何控制细胞的死亡的呢？bcl-2家族的成员似乎大部分时间都在相互 阻断对方的下一步移动。许多成员可以形成同二聚体，但更重要的是促凋亡成员和抗凋亡成 员之间可以形成异二聚体。由于一个bcl-2家族的成员可以和几种其它成员相互作用，在同 一个细胞中也就可以形成大量的异聚体。做一个简单的比喻，异二聚体的形成是结合的 促凋亡成员和抗凋亡成员之间的相互中和。这样问题就变成了抗凋亡成员与促凋亡成员之间 总体水平的比较：促凋亡成员较多的细胞对凋亡较为敏感，而含抗凋亡成员较多的细胞则对 凋亡有明显的抗性。
显然bcl-2成员要影响细胞的死亡，其相互作用不应仅仅是信息的交换。这些相互作用 的结果是什么呢？在nemanote caenorhabditis elegans(新小杆线虫属？)中具有抗凋亡作用的 bcl-2的同源物CED-9可以通过直接与Apaf-1的同源物CED-4结合，使之隔离，从而保护 细胞免于死亡(ref.37)。虽然这是一个诱人的蓝图，但在哺乳动物中找到相同作用方式的 可能性很小，即使有也非常困难，至少在目前已经测试的条件下尚未找到。不过bcl-2 家族的一项重要作用就是调节一系列促凋亡因子，尤其是细胞色素c从线粒体到细胞质的释 放。
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线粒体——死亡之论坛
线粒体不仅是细胞的能量工厂，并且是一个武器库。线粒体使一系列潜在的促凋亡蛋白 的前体相互隔离，其中最为突出的是细胞色素c，这个忠实的(humble)电子传递者。在过 去的几年的研究中发现：细胞色素c远非无害的。它除了在线粒体内参与氧化磷酸化以外， 它与调节蛋白Apaf-1一起是细胞浆内Caspase-9激活所必需的部件之一。细胞色素c到底 是如何通过线粒体外膜的，目前还尚不清楚。但很明确bcl-2家族密切参与了这一过程的调 节。例如：bcl-2家族中的促凋亡成员与分离(isolated)的线粒体结合以后就足以诱导细胞 色素c的释放。而过度表达的bcl-2家族就能阻断这些。关于bcl-2家族调节细胞色素 c释放的确切机制有几种不同的假说，但都还没有得到确切的证明。下面是三个基本 的模型。
Bcl-2家族成员构成了通道，使蛋白的转运易化。
由于bcl-XL和白喉毒素的穿孔亚基在结构上有相似性，有人推断：当bcl-2蛋白发生 构象变化后，它们可以插入到线粒体的外膜，形成一个通道，甚至是一个大洞。Bcl-2家族 的确可以插入到合成的脂类双层膜上，并且可以寡聚化，形成分散的传导通道，但这些通 道的大小是否可以让蛋白通过还是一个问题。
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Bcl-2家族成员与其它蛋白相互作用形成通道。
Bcl-2家族成员可以与很多蛋白质相互作用。因此存在下面的可能性：bcl-2家族中的促 凋亡成员可以募集线粒体外膜上的其它蛋白质，而形成一个大的孔状通道。其中一个倍受关 注的目标蛋白就是电压依赖型阴离子通道蛋白(VDAC，Voltage Dependent Anion Channel)， 因为有数种bcl-2家族的成员可以与之结合，并调节通道活性。由于已知的VDAC通道孔 径很小，无法让蛋白质通过，因此要承认这个模型就必须设想VDAC在与bcl-2家族成员结 合后发生了明显的构相变化。
Bcl-2家族成员使线粒体外膜破裂。
Bcl-2家族成员有可能控制着线粒体的自身稳定作用。在这个模型中，(首先是)凋亡信 号改变了线粒体的生理活动(例如：离子的转运和氧化磷酸化)，进而线粒体发生了肿胀， 最后导致了线粒体外膜的破裂和膜间隙中的蛋白质向细胞质释放。构建一个足够大、可以使 细胞色素c通过的通道的问题就这样被绕道解决了。因为蛋白质可以以单纯扩散得方式通过 脂类双分子膜上的撕裂孔。
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Bcl-2家族可以直接影响(例如通过上面所提及的控制内在离子通道的活性)或间接的 通过对其它线粒体蛋白的调节而影响线粒体的自身稳定。而VDAC同样也是这种调节的一 个引人注目的目标蛋白。因为它是线粒体通透性转换孔(PTP，permeability transition pore) 的一个亚基。而PTP是一个巨大的通道，开放后可以导致膜电位迅速降低和细胞器的肿胀。 PTP的开放会使细胞色素c迅速释放进而使细胞走向凋亡，而PTP的药理性抑制物可以作 为有效的细胞色素c释放的抑制物。因此它可以阻止凋亡。然而在出现细胞色素c的外溢 时可以不伴有膜电位的下降。这些均提示PTP不可能是bcl-2家族的唯一靶部位。 细胞色素c的释放可能是凋亡细胞最普遍地特点之一。但在有些情况下，这是一个非常 晚期的事件。例如死亡受体所介导的细胞凋亡经常可以绕过线粒体途径。正像所想象的一 样，从上面所讨论的模型来看这种细胞死亡对bcl-2的保护作用相对不敏感(ref.45)。而细 胞色素c的释放好象是Caspase激活的结果，而不是原因。
细胞色素c仅仅是存在于线粒体的促凋亡物质之一，存在于线粒体并且可以被凋亡诱导 释放的物质还有AIF、(一种潜在地具有神秘活性的黄素蛋白)、Smac/DIASBLO和其他几种 促凋亡酶：包括促凋亡酶-2，-3 ,-9。多种促死亡因子的释放对于迅速而确定性的细胞死亡是 必需的。后者是确保凋亡级联反应激活成为单向反应的程序的一部分
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凋亡反应的解毒剂和解-解毒剂
线粒体释放促死亡因子是凋亡反应的不可逆点吗？一系列的证据表明细胞偶尔会在这 个水平恢复活力，至少是暂时性的。首先药理性的caspase抑制剂经常可以使细胞免于凋亡。 其次，Caspase-3，-9基因敲除的小鼠在发育过程中神经系统凋亡减少，而且对于刺激引 起的凋亡的反应性有明显得缺陷。第三，在哺乳动物(果蝇，drosophia线虫和一些病毒) 都带有一些可以编码潜在地Caspase抑制物即IAP蛋白的基因，如果它们不能影响凋亡的进 程，那么这些基因地存在就毫无意义了。
根据以上的观点，细胞在凋亡时很可能在经历一个终末的单结果却不确定的事件，让各 种凋亡信号沿各种途径不断地下传，但从不充分的执行。但是这种印象是错误的，恰恰相反， 在凋亡的途径中包含有数个增强步骤和正反馈循环。这样就可以确保细胞要么完全死亡要么 从凋亡进程中脱离。例如，procaspases作为caspase的底物可以使一系列的酶原迅速而完全 的活化，即使在一开始仅有几个分子活化。同样在Capase的激活和线粒体释放细胞色素c 之间也存在正反馈循环。
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但是正反馈必须有缓冲和或减速剂，否则仅有微小的干扰就可以完全激活凋亡进程和最 终导致细胞凋亡。IAP蛋白可能就是这样的减速剂。它很可能不是保护细胞免于自杀性的刺 激，而是阻止那些不适当地、自发？的Caspase的激活。最近发现的哺乳动物IAP抑制物 Smac或者DIABLO也支持这一观点。Reaper，Hid，Grim等对线虫的研究表明Smac/DIABLO 可以与IAP成员结合，中和其抗凋亡活性。更有趣的是Smac/DIABLO在正常情况下是线粒 体的蛋白，在被诱导凋亡的细胞中，它释放到细胞浆中，途径可能和细胞色素c一样。 因此，细胞在凋亡时释放线粒体内容物，Smac/DIABLO也就被释放，隔离了IAP，是 他们无法阻止(凋亡)的进程。同样，bcl-2家族被认为是缓冲意外线粒体释放的物质。很 可能还存在其它待发现的缓冲物质。
凋亡是不是应该改名叫“甜美的死亡”？
Caspase的激活是不是凋亡性细胞死亡的特征呢？正如本文开始提到的那样，大多数甚 至是全部开始被用来描述凋亡的形态学改变得特征的出现都依赖于Caspase的激活。但凋亡 的程序决不仅仅是Caspases。在许多细胞中启动凋亡程序都会不可避免得导致凋亡，但可以 有或没有Caspase的激活。在Caspase被阻断时，程序化细胞死亡的形态学特征一点也不象 凋亡，甚至更像传统的坏死性死亡。
不仅如此，不具有凋亡特点的生理性细胞死亡已经被发现多年，我们对此如何分类呢？ 不典型凋亡？坏死？非凋亡性程序化死亡？最终的决定不能由形态学来判断。主要应看在濒 死的细胞中哪些分子途径被激活，这有赖于对凋亡蛋白更精确的分析。 结论：凋亡领域的研究起源于一些兢兢业业的病理学家的细心观察、理解？、结论。正 如Yogi Berra所说“通过看，我们可以观察到很多东西”。虽然已经发现了许多重要的凋亡 蛋白，但是我们对这些分子的作用和激活机制仍知之甚少。Caspase的下游事件还不清楚。 仍有数种细胞死亡尚未涉及。我们需要“更多的观察，更多的结论”在可预见的将来，细胞 死亡仍是一个研究的热点。, 百拇医药