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维护血管内皮功能对心脑血管疾病的重要意义——系列研究之十六(续1) 通心络对实验家兔血管球囊损伤后内膜增生和血管重构的抑制作用
http://www.100md.com 2003年11月20日 《中国医学论坛报》 2003年第44期
     逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR):①引物序列:PDGF-BB上游引物5’-AGG AGG CCC ATC TAC ATC ATC ACC GAG

    T-3’下游引物5’-CCT TTC ATG TCC AGC CAT GGG CCA

    CGT-3’扩增片断259bp;MMP-2上游引物5’-CCA CAT TCT GGC CTG AGC

    T-3’下游引物5’-TGA TGC TTC CAA ACT TCA

    C-3’扩增片断430bp;MMP-3上游引物5’-GCC AAG AGA TGC TGT TGA

    TG-3’下游引物5’-AGG TCT GTG AAG GGG TTG

    TA-3’扩增片断363bp;TIMP-1上游引物5’-GCA ACT CCG ACC TTG TCA

    TC-3’下游引物5’-AGC GTA GGT CTT GGT GAA

    GC-3’扩增片断326bp;β-actin(内参照)上游引物5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC

    A-3’下游引物5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC

    CA-3’扩增片段300bp。②RT-PCR反应:于DEPC处理的EP管中依次加入总RNA

    1μk、MMLV 1μk、逆转录反应体系7μk和下游引物1μk,去Rnase水补至20μk,快速离心混匀;先后37℃1h、90℃10min灭活MMLV,快速离心使蒸汽沉于管底;然后依次加入PCR反应体系19μk、上游引物1μk和超净水58μk,快速离心混匀;90℃5min,离心使蒸汽沉于管底,加入2μk Taq

    DNA(1u/μk)聚合物快速离心混匀,加100μk液体石蜡。循环条件:94℃

    1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,循环35次,末次延长7

    min。对扩增产物行琼脂糖凝胶电泳25min。

    血清胆固醇(CH)和一氧化氮(NO)含量测定:对三组家兔分别于术前及术后第2、4周经耳缘静脉采血,每只(6~8)mk,4000r/min超速离心,分离血清,置于-70℃冰箱保存备检。用酶法测定血清CH含量;血清NO测定以血清NO3-

    与NO2-

    之和作为NO的生成指标,采用硝酸还原酶将NO3- 还原为

    NO2-

    ,并与显色剂作用,将生成的有色物质与标准管和空白管对照检测吸光度(540nm波长比色)的大小,计算血清NO含量。

    统计方法

    采用SPSS软件做统计学处理。计数资料用±s表示,组间比较用双向t检验或方差分析。P<0.05为有显著性差异。

    结 果

    血管横截面组织形态学表现

    假手术组:光镜下见血管全层结构,内皮细胞完整呈扁平状,内弹力膜完整;中层平滑肌细胞(VSMC)呈梭形,细胞核小而扁。电镜下中膜VSMC呈“收缩型”,细胞浆内有大量肌丝、密斑和密体,细胞核呈梭状。

    对照组和通心络组:

    1.损伤后即刻:对照组光镜下见内皮消失,有时内弹力膜断裂,损伤可达中层。电镜下见内皮细胞消失,内膜表面有时见散在的单核细胞和大量脱颗粒血小板附着;内弹力膜及其附近中膜的VSMC变长,细胞核呈螺旋状。

    2.损伤后第1周:对照组光镜下见管腔面有较完整的扁平内皮,增生的内膜呈均匀性或非均匀性增厚,细胞排列紊乱,有少许纤维组织形成和迁移的VSMC。电镜下见新生内膜中增生的VSMC呈典型的“合成型”表现:核大而圆,胞浆丰富,有大量内质网和高尔基复合体,肌丝减少。

    3.损伤后第2周:对照组光镜下见内膜增厚,VSMC由中膜向内膜大量迁移并增生,细胞排列紊乱,纤维组织大量形成,中膜增厚,管腔明显狭窄(图1)。

    图1

    球囊损伤后2周对照组血管横截面光镜下所见(×100):新生内膜明显增厚,有大量增生的VSMC和纤维组织形成,细胞排列紊乱,管腔狭窄。

    电镜下新生内膜和中膜的VSMC呈典型的“合成型”,胞核有时呈螺旋状。通心络组光镜下见新生内膜中的VSMC和纤维组织较对照组明显减少,内皮较完整、光滑,管腔狭窄程度减轻(图2);电镜下VSMC胞浆肌丝较对照组明显增多,内质网和高尔基复合体较对照组减少。

    图2

    球囊损伤后2周通心络组血管横截面光镜下所见(×100):新生内膜中的VSMC和纤维组织较同期对照组显著减少,内皮较完整、光滑,管腔较大。

    4.损伤后第4周:对照组光镜下见中膜和内膜均明显增厚,有较多增生的VSMC,呈环形排列整齐,新生内膜中有大量ECM形成,管腔明显狭窄;透射电镜见内膜VSMC胞浆内肌丝明显减少或消失,有大量内质网、高尔基体和线粒体,呈典型的“合成型”表现(图3)。通心络组光镜下见内膜增生程度较对照组显著减轻,增生的VSMC和纤维组织明显减少,内皮完整、光滑,管腔显著增大;电镜下VSMC胞浆肌丝较对照组明显增多,内质网、高尔基复合体和线粒体显著减少,胞核较对照组变扁平(图4)。

    图3

    球囊损伤后2周对照组血管横截面电镜下所见(×10000):新生内膜中VSM呈典型的“合成型”表现,即:胞核大而圆,胞浆丰富,有大量内质网和高尔基复合体,肌丝减少。

    图4

    球囊损伤后2周通心络组血管横截面电镜下所见(×10000):新生内膜中VSMC胞浆肌丝较同期对照组增多,内质网中和高尔基复合体减少。

    5.损伤后第6周:对照组光镜下见内膜增厚仍明显,VSMC细胞相对较少,周围基质大量增生,管腔明显狭窄,中膜增厚。通心络组光镜下见内膜增生程度较对照组显著减轻,增生的VSMC和纤维组织明显减少,管腔较对照组增大。

    血管形态学参数比较

    假手术组、对照组和通心络组内弹力膜环绕总面积(IEL)比较:结果显示(表1)术后第1周三组IEL差异无显著性,术后第2、4、6周对照组IEL明显小于通心络组。

    表1 三组IEL比较(×104 μm2)

    组别

    术后1周

    术后2周

    术后4周

    术后6周

    假手术组

    12.26±0.92

    1.89±1.011

    11.78±1.01

    11.14±1.02

    对照组

    13.08±1.00

    10.56±0.98*

    9.34±0.97*

    8.93±0.96#

    通心络组

    12.96±0.96

    12.35±0.92△

    11.89±1.01△

    11.67±1.11△

    注与假手术组比较

    *P<0.05#P<0.01与对照组比较 △P<0.01

    假手术组、对照组和通心络组新生内膜面积比较:结果显示(表2) 术后对照组和通心络组新生内膜面积均明显大于假手术组,对照组显著大于通心络组。

    表2 三组新生内膜增生面积比较(×104 μm2)

    组别

    术后1周

    术后2周

    术后4周

    术后6周

    假手术组

    1.55±0.72

    1.58±0.69

    1.63±0.67

    1.61±0.70

    对照组

    5.28±0.65*

    5.90±0.59*

    5.96±0.61*

    6.06±0.62*

    通心络组

    4.30±0.57#

    4.07±0.60*#

    3.49±0.53*#

    3.42±0.58*#

    注L与假手术组比较

    *P<0.001;与对照组比较 #P<0.01。

    假手术组、对照组和通心络组管腔面积比较:结果显示(表3)术后对照组和通心络组管腔面积均明显小于假手术组,对照组显著小于通心络组。

    表3 三组管腔面积比较(×104 μm2)

    组别

    术后1周

    术后2周

    术后4周

    术后6周

    假手术组

    10.71±1.32

    9.62±1.14

    9.87±1.21

    10.03±1.22

    对照组

    7.14±1.09#

    5.20±1.18#

    4.12±0.98#

    4.08±0.97#

    通心络组

    8.33±0.96*△

    8.08±0.97*▲

    8.20±1.16*▲

    8.34±1.01*▲

    注与假手术组比较

    ×P<0.05;#P<0.001;与对照组比较 △P<0.05;▲P<0.001。

    假手术组、对照组和通心络组内膜增生指数比较:结果显示术后对照组和通心络组新生内膜面积均明显大于假手术组,对照组显著大于通心络组。

    表4 三组内膜增生指数(%)

    组别

    术后1周

    术后2周

    术后4周

    术后6周

    假手术组

    10.14±1.06

    9.25±0.92

    10.61±0.96

    9.62±1.21

    对照组

    25.51±4.04

    26.51±4.31

    27.06±4.17

    29.00±4.23

    通心络组

    22.60±

    4.12#

    21.05±3.96#

    17.50±3.87#

    17.01±4.06#

    注:与假手术组比较

    *P<0.001;与对照组比较 #P<0.05。

    假手术组、对照组和通心络组管腔狭窄指数比较:结果显示(表5)术后对照组和通心络组管腔面积均明显小于假手术组,对照组显著小于通心络组。

    免疫组化、原位杂交和RT-PCR结果

    假手术组:PCNA、PDGF-BB、MMP-2、MMP-3、TIMP-1和NF-kB

    p65无或有少许表达。

    对照组:①术后PCNA阳性细胞数和PCNA增殖指数均明显高于假手术组和通心络组(表6)。②PDGF-BB术后即刻表达,2周达高峰,以后继续维持在较高水平(图5)。③MMP-2术后即刻表达,1周显著表达并达高峰,2周后开始下降,4周后几乎无表达。④MMP-3术后即刻表达,2周表达最明显,4周后表达很少(图7)。⑤TIMP-1在术后表达逐渐增强,2周后达高峰,4周后表达仍较强。⑥NF-κB

    p65术后1周胞核中表达显著,胞浆中有轻微表达,以后表达下降(图8)。

    通心络组:PCNA、PDGF-BB(图6)、MMP-2、MMP-3(图7)和NF-κB

    p65(图9)术后各时间点的表达均显著弱于同期对照组,而TIMP-1则明显强于对照组。, 百拇医药