苓桂术甘汤对实验性心肌缺血及大鼠血液流变学的影响
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冯 东 / 宋 宗 华
北京中顺制药厂 / 沈阳药科大学
摘要：本文探讨了苓桂术甘汤对缺血心肌的保护作用及对大鼠血液流变学的影响。采用常压耐缺氧实验、用大剂量异丙肾上腺素(iso)造成大鼠心肌缺血性损伤模型，观察了苓桂术甘汤3个剂量组和对照组小鼠的存活时间、大鼠的心电、心率以及心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和心肌丙二醛(MDA)含量的变化。也观察了苓桂术甘汤对大鼠血液流变学的影响。结果显示苓桂术甘汤能明显延长常压缺氧小鼠的存活时间；改善iso引起大鼠心肌缺血后ST段变化程度，减慢心率，提高心肌SOD活性和降低心肌MDA含量；同时苓桂术甘汤显著降低300/s、100/S、30/S、3/S四个切变率下的全血粘度、全血还原粘度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞电泳时间。表明苓桂术甘汤能有效对抗实验性心肌缺血。
关键词：苓桂术甘汤 血液流变学 超氧化物歧化酶 丙二醛 全血粘度 全血还原粘度红细胞聚集指数 红细胞刚性指数 红细胞电泳时间。
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Effect of Ling Gui Zhu Gan Tang on acute myocardial ischemia and hemorheology
Feng dong
Beijing ZhongShun Pharmaceutical Factory
Song zhonghua
ShenYang pharmaceutical university pharmacology laboratory 110015
Abstract：The protective effects of LGZGT on acute myocardial ischemia and hemorheology were studied in this research. The mice survival time of hypoxia under normal pressure was measured; rat acute myocardial ischemia was induced by over –dosage isoproternol injected subcutaneously, the changes of ECG, heart rate and cardiac muscle SOD activity and MDA content were detected; the method of hemorheology was performed in rats. The results showed that LGZGT could evidently prolong the mice survival time; the total and mean extents of S-T segment change (∑ST) were significantly reduced,and simultaneously the heart rate was lowered, while enhancing the cardiac muscle SOD activity and reducing MDA content. In hemorheology study,the data showed the blood viscosity in 300/s, 100/s, 30/s, 3/s shear rate, blood reductive viscosity, erythrocyte collect index, rigidity index,electrophoresis time were evidently decreased by the effect of LGZGT. These indicated that LGZGT was effective on anti-myocardial ischemia.
, 百拇医药
Key words: Ling Gui Zhu Gan Tang hemorheology SOD MDA blood viscosity blood reductive viscosity erythrocyte collect index erythrocyte rigidity index electrophoresis time.
苓桂术甘汤出自张仲景的《金匮要略》，方由茯苓、桂枝、白术、甘草组成。方中茯苓淡渗利水，桂枝辛温通阳，两药合用可温阳化水；白术健脾燥湿，甘草和中益气，两药相协又能补土制水；全方共奏健脾渗湿，通阳利水之效。张仲景用于治疗脾阳虚，痰改内停而致的胸肋支满，目眩，心悸，短气，小便不利等证。临床上已将其用于治疗心脏疾病，并且效果明显[1、2、3]。本文对苓桂术甘汤的抗心肌缺血作用及对血液流变学的影响作进一步研究。
材料
, 百拇医药
1.动物：大鼠、小鼠均由中国医科大学第二附属医院动物中心提供。
2.受试药物及试剂：苓桂术甘汤由本校药分实验室提供，2g生药.ml-1。盐酸异丙肾上腺素由武汉制药厂生产，复方丹参片由广州白云山制药厂生产，TBA由北京化工二厂生产，戊巴比妥钠由北京芳草化学试剂厂生产。
3. 仪器：6511型心电图机，日立85P-72低温超速离心机，DY89-1型组织匀浆机。
实验方法与结果
1.小鼠常压耐缺氧实验[4]
小鼠90只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为9组。苓桂术甘汤10g.kg-1，20g.kg-1，40g.kg-1组，复方丹参片500mg.kg-1组，生理盐水组。连续灌胃给药4天，第4天灌胃给药1小时后，分别将小鼠移入底部盛有新鲜钠石灰的150ml广口瓶中，加盖密封。观察其存活时间，以呼吸停止为死亡指征。另取4组小鼠同上，分别给予苓桂术甘汤10，20，40g.kg-1和生理盐水。待给药1小时后再分别给予盐酸异丙肾上腺素2mg.kg-1，并立即放入广口瓶内密封。观察方法同前。实验结果经统计学处理，作t检验判断显著性。
, 百拇医药
实验结果表明，苓桂术甘汤10g. kg-1、20g. kg-1、40g. kg-1均能显著延长常压耐缺氧动物的存活时间(P<0.01)；同时苓桂术甘汤40g. kg-1剂量组也能明显延长给予异丙肾上腺素小鼠常压耐缺氧存活时间(P<0.05)，提示苓桂术甘汤具有调节异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的作用。结果见表1。复方丹参片也能显著延长小鼠存活时间(P<0.01)。
Tab 1. Effect of LGZGT on mice survival time of hypoxia under normal pressure(x±SD)
Group Dosage n Survival time
(min)
, 百拇医药
NS ----- 10 21.2±3.1
FuFang Dan 500mg.k 9 29.3±6.7**
Shen g-1
LGZGT 10g.kg-1 10 26.4±4.2**
20g.kg-1 10 27.4±5.2**
40g.kg-1 10 28.9±5.6**
, 百拇医药
NS+iso ------ 10 20.6±3.0
LGZGT+iso 10g.kg-1 10 22.5±5.6
20g.kg-1 10 22.7±2.5
40g.kg-1 10 23.8±3.8△
Compared with control group ** P<0.01;
compared with NS+iso group △P<0.05
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2.苓桂术甘汤对盐酸异丙肾上腺素所致大鼠心脏缺血损伤的影响。[5]
大鼠200-250g，雌雄各半，共60只。随机分为6组：正常对照组，缺血对照组 (分别预先给予生理盐水)，复方丹参片组 (500mg.kg-1)，苓桂术甘汤组 (6.5g.kg-1，13g.kg-1，26g.kg-1)。连续灌胃给药7天，缺血对照组，复方丹参片组及苓桂术甘汤组第6和第7天给药后1小时各给予盐酸异丙肾上腺素(2mg.kg-1，ip)，分别记录给药前10分钟及第2次给予盐酸异丙肾上腺素后30分钟ECG (5，10，20，30分钟)，测量ST段偏移基线的高度，以每组ST段偏移基线高度的总和 (∑ST) 的mv数均值作为心肌缺血损伤程度的指标。第7天给予盐酸异丙肾上腺素后2小时，迅速取出心脏，冲洗，称重，将心肌剪成碎片，用组织匀浆机在0-4℃条件下将心肌组织制成5%心肌匀浆 (g/m1)，用低温超速离心机以12000g离心15分钟，取上清液备测。采用SOD试剂盒测定心肌SOD，用TBA法测定心肌丙二醛 (MDA) 含量。实验结果经统计学处理，作t检验判断显著性。
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实验结果表明，苓桂术甘汤13g.kg-1和26g.kg-1能显著对抗异丙肾所引起的ST段变化，与生理盐水比P<0.05和P<0.01。复方丹参片组对抗效果显著 (P<0.001)，结果见表2；在给药前后不同时间的心率变化比较中，苓桂术甘汤26g.kg-1显著降低药后5、10、20、30分钟的心率，与药前比P<0.05、P<0.01或P<0.001，13g.kg-1剂量组显著降低药后30分钟心率 (P<0.01)，6.5g.kg-1，剂量组虽有降低趋势，但无统计学意义，结果见表3；同时苓桂术甘汤三个剂量组均能显著增加心肌缺血大鼠心肌组织SOD活性 (P<0.05) 和降低MDA含量 (P<0.001)，结果见表4。以上结果表明苓桂术甘汤对损伤心肌有保护作用，而且作用呈剂量依赖性。
Tab 2. Effect of LGZGT on ∑ST segment change of myocardial ischemia induced by iso in rats
, 百拇医药
Total ∑ST Mean ∑ST
Group Dosage n change (mv) change ( x±SD)
(mv)
NS —— 9 3.744 0.416±0.146
FuFangD 500mg.kg-1 9 1.285 0.143±0.089
anShen ***
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LGZGT 6.5g.kg-1 8 2.725 0.340±0.120
13g.kg-1 8 2.225 0.278±0.058
26g.kg-1 *
8 1.620 0.203±0.109
**
Compared with control group *P<0.05 ** P<0.01 *** P<0.001
, 百拇医药 Tab 3.The changes of heart rate in rats before and after administration in different time (x±SD)
Befor heart rate 1 hour after administration
Group Dos e in rats injected iso
age admin 5min 10min 20min 30min
iatration
NS —— 495±2 516±4 507±4 474±3 458±40
, 百拇医药
1 9 6 7
FuFangDa 500 441±6 410±3 398±3 388±3 377±35*
nShen mg.kg-1 1 9 7 7
LGZGT 6.5g. 464±3 477±5 457±5 433±6 386±122
kg-1 2 5 2 8
13 445±6 463±6 444±6 415±6 395±96*
, 百拇医药
g.kg-1 8 6 8 8 *
26 471±6 427±4 414±4 401±9 388±54*
g.kg-1 2 2* 6** 8** **
Compared with itself control *P<0.05 ** P<0.01 ***P<0.001
Tab 4.Effect of LGZGT on cardiac muscle SOD activity and MDA content in rats (x±SD)
Group Dosag SOD activity MDA
, 百拇医药
e (U/ml) content (nmol/ml)
Normal —— 169.1±30.9 0.208±0.07
NS —— 121.2±22.6 0.295±0.03
FuFang 500mg 150.7±27.3* 0.184±0.116**
DanShen kg-1
LGZGT 6.5g.kg 142.2±13.4* 0.213±0.04***
, 百拇医药
-1
13 144.2±14.2* 0.165±0.04***
g.kg-1
26 150.2±32.9* 0.146±0.02***
g.kg-1
Compared with control group *P<0.05 ** P<0.01 ***P<0.001
3.苓桂术甘汤对大鼠血液流变学的影响[6]
, 百拇医药 大鼠49只，体重200-250g，随机分为5组：(1)空白组，生理盐水10ml.kg-1；(2)苓桂术甘汤低剂量组，6.5g.kg-1；(3)苓桂术甘汤中剂量组，13g.kg-1；(4)苓桂术甘汤高剂量组，26g.kg-1；(5)复方丹参片组，1g.kg-1。连续灌胃给药或生理盐水五天，最后一次给药一小时后，将动物用2%的戊巴比妥钠30mg.kg-1腹腔注射麻醉，然后心脏取血5ml。用多功能血液流变学测定仪在300/S，100/S，30/s，3/s的切速下测定全血粘度，全血还原粘度；红细胞聚集指数：红细胞刚性指数；红细胞电泳时间；用毛细管微量法测红细胞压积。试验结果进行统计学处理，以t检验判断其显著性。
实验结果表明，苓桂术甘汤三个剂量组均能降低300/S、100/s、30/S、3/s四个切变率下的全血粘度、全血还原粘度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞电泳时间(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，对红细胞压积、红细胞计数无明显影响。结果见表5。
, 百拇医药
Tab 5.Effect of LGZGT on hemorheology in rats ( n=10 x±SD)
Control L G Z G T Fufang
danshen
Dosa
ge
30
O/s
10
O/s
30
, 百拇医药
/s
3/
s
Brv
Arbc
Eri
Hct
Et
Ec
1
5
4
4
40
, 百拇医药
4
6
0
4
22
2
10ml.kg-
5.80±0.3
6.13±0.3
6.37±0.3
11.70±0.
9.60±1.1
7.08±0.4
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0.91±0.1
0.43±0.0
20.29±1.
4.84±0.4
*
*
*
*
**
6.5g.kg-1
5.06±0.60*
5.73±0.64
, 百拇医药
5.59±0.67*
10.83±1.32
7.80±1.54*
6.08±0.81*
0.80±0.09*
0.42±0.02
17.70±2.11
4.69±0.21
*
*
*
*
, 百拇医药
**
*
**
**
13g.kg-1
5.00±0.62*
5.31±0.66*
5.52±0.69*
10.37±1.56
7.50±1.08*
5.70±0.90*
0.77±0.05*
, 百拇医药
0.42±0.02
17.51±2.16
4.71±0.21
*
*
*
*
*
*
**
26g.kg-1
4.69±0.57**
4.96±0.60**
, 百拇医药
5.16±0.63**
9.54±1.32**
7.37±1.30**
5.29±0.53**
0.80±0.06**
0.39±0.04
16.39±1.98*
4.40±0.40
**
1g.kg-1
5.15±0.52**
, 百拇医药
5.47±0.55**
5.69±0.57**
10.99±1.07
7.97±1.11**
6.79±0.73
0.83±0.05*
0.44±0.01
18.03±1.80
4.93±0.13
Compared with control group *P<0.05； ** P<0.01； ***P<0.001
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讨论
在小鼠常压耐缺氧实验中，观察了苓桂术甘汤对小鼠缺氧条件下的存活时间，发现苓桂术甘汤三个剂量都能明显延长小鼠生存时间。同时由于小鼠耐缺氧实验易受动物活动状态，中枢兴奋或抑制作用所干扰，其缺氧反应包括了需氧较敏锐的大脑，特异性不强，本实验中采用了腹腔注射异丙肾上腺素以增加心肌耗氧量[7]，更能代表心肌缺氧的特异状态，结果发现苓桂术甘汤能延长给予异丙肾上腺素状态下的小鼠的存活时间，其中40g.kg-1剂量与空白对照组比较，差异显著(P<0.05)。说明苓桂术甘汤能拮抗异丙肾上腺素所致心肌损伤作用。
异丙肾上腺素诱发心肌损伤的机理目前认为与氧自由基产生[8]和心肌细胞内钙超载[9]有关。大剂量异丙肾上腺素致心脏β受体过度兴奋，心率加快，心肌收缩力增强，心肌耗氧量增加；兴奋β2受体，扩张外周血管，降低外周血管阻力，血压降低，尤其舒张压降低，减少冠状动脉供血。结果导致心肌缺氧，大量氧自由基产生。心脏β受体的过度兴奋，尚使心血管局部血管紧张素增加，进而促进心肌细胞内Ca2+超载[10]。在异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血模型中，苓桂术甘汤能显著恢复ECG的ST段偏移程度，表明其可改善心肌缺血的早期损伤。并且苓桂术甘汤可明显减慢心率，有利于拮抗异丙肾上腺素所致心肌耗氧量增加。
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近年来，随着对心肌缺血性损伤机制研究的深入，发现大量氧自由基生成及脂质过氧化反应是心肌缺血损伤性的主要机制之一[11]。SOD是氧自由基的特异性降解酶，SOD活性及含量的变化直接反映氧自由基的消长情况。心肌梗死时，氧自由基生成增加，而氧自由基清除酶SOD活性降低，使氧自由基堆积，后者转化为羟自由基后可对心肌细胞膜产生脂质过氧化作用，加剧心肌损伤[12]。MDA是脂质过氧化产物，其血中含量的变化可直接反映过氧化的速度，在一定程度上也能间接反映氧自由基的生成情况[13]。实验发现，苓桂术甘汤能明显提高SOD活性，降低MDA含量，这可能是其保护心肌的重要机制之一。
冠心病患者常伴有血液流变学异常[14]，易形成冠脉内血栓而诱发急性心肌缺血。一旦发生心肌缺血，无论梗死前的血液流变学状况如何，机体对梗死的损伤组织的生物学反应即可导致血液流变学的动态变化：血液粘度、血沉、红细胞聚集指数、红细胞电泳时间、红细胞计数、红细胞刚性指数增高，红细胞变形性下降，这些变化可持续2-3月，甚至1-2年[15]，对缺血心肌具负性效应。本实验显示苓桂术甘汤显著降低血液粘度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞电泳时间，间接增加红细胞变形性，对血沉、红细胞计数没有明显影响。
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