络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对急性缺血性卒中微小循环障碍的影响
作者简介
蔡定芳教授 现任中国中西医结合学会理事、《中国中西医结合杂志》编委、上海市中西医结合神经科专业委员会委员、中国中医药学会博士学术委员会副主任委员；曾于九十年代作为访问学者和特别研究员，分别留学日本德岛大学医学部和富山医科药科大学，从事神经科学的临床与实验研究；现为复旦大学中西医结合研究所副所长、中山医院中医科主任博士生导师；以第一作者在国内外医学期刊发表学术论文80余篇论著9部；曾承担中日合作攻关、国家自然科学基金、卫生部、教育部、国家中医药管理局等多项研究课题；获国家教委和上海市科技进步二、三等奖项和全国中青年医学科技之星等称号；指导硕士研究生13名、博士研究生6名。
急性缺血性脑卒中脑微小循环障碍是导致半影区低灌注或无灌注现象的重要病理生理过程。为探讨中医络病理论与急性缺血性卒中脑微小循环障碍的内在联系，本研究观察了通心络(TXL)对接受大脑中动脉线栓(MCAO)大鼠神经功能缺损、梗死体积、血脑屏障及金属基质蛋白酶基因表达的影响。
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材料与方法
实验动物：雄性12周龄Sprague-Dawkey大鼠，体重(250～280)g(由中科院上海分院实验动物中心提供)。将大鼠随机分为假手术(SHAM)组、模型组和通心络组，每组20只。通心络组大鼠在MCAO后即刻腹腔给药，以后每隔12h给药一次，直至实验结束。模型组与假手术组均以等体积蒸馏水替代通心络。
大鼠MCAO再灌注模型的建立：动物术前12h禁食不禁水，参照Zea-Longa大鼠MCAO制备动物模型。对动物按Zausinger六分法进行神经功能评分：0分为不能自发行走；1分为自由走动状态下向病变对侧旋转；2分为抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转；3分为对施向病变对侧的侧压力抵抗力下降；4分为不能伸直病变对侧前爪，甚至全身向对侧屈曲；5分为无神经功能缺损。假手术组只分离动脉不行阻断。
血脑屏障通透性测定：制作伊文氏蓝标准曲线：称取伊文氏蓝4
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mg，加生理盐水至总容积为25 mk，取0.3
mk加入5.7 mk甲酰胺混匀作为第1管；从第1管取3
mk加入3 mk甲酰胺作为第2管；并依次类推共作7管，其浓度分别为8，4，2，1，0.25，0.125 μg/mk，60℃孵育24h后比色λ＝632测定OD值，计算线性回归方程。动物处死前2h经尾静脉注入2%伊文氏蓝2 mk/kg，2h后于10%水合氯醛麻醉下心内灌注生理盐水(200～300)mk，迅速断头取脑，解剖显微镜下去除额极和枕极各2mm，左右半球分开，称取左半球湿重后置于甲酰胺1
mk/100g脑组织中。60 ℃孵育24h。1000
rpm离心5 min，用分光光度计λ＝632测定上清液0D值。根据标准曲线计算缺血脑组织伊文氏蓝含量μg/g湿重。
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血脑屏障超微结构观察：于再灌注后不同时间点对大鼠迅速断头取脑，在大脑中动脉供血区取1
mm组织3～4块；用2.5%戊二醛固定2h，0.1
mmok/L磷酸缓冲液漂洗，加1%锇酸后固定2
h。梯度酒精、丙酮脱水，618环氧树脂包埋液浸透包埋，FC4D型超薄切片机切片(600～800)nm，醋酸铀、枸橼酸铅染色，CM-120透射电镜观察。
MMP-9基因表达测定：PCR引物参照文献设计MMP-9及内参照β-actin引物。引物序列为：MMP-9
5primer5AAGGATGGTCTACTGGCAC3；MMP-9
3primer5AGAGATTCTCACTGGGGC3；β-actin
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5primer5ACTCCTACGTGGGCGACGAG3；β-actin
3primer5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3。实验结束时各组动物分别于恢复再灌注后1、3、24、48h和5d，迅速断头取脑，解剖显微镜下切取距离额极(4～6)mm的脑片，-80 ℃冻存；常规方法抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA在波长260
nm和280
nm的吸光度，进行定量和纯度检测并用电泳法鉴定其分子完整性。室温静置10
min，42 ℃60 min，70℃ 10 min，4 ℃5
min进行逆转录反应；逆转录后的cDNA保存于-20 ℃。反应循环参数为：94 ℃预变性5
, 百拇医药 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s72 ℃30 s37个循环；72℃延伸7
min。RT-PCR产物的分析和定量：取10 μk
PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后进行电泳条带光密度分析，以靶基因条带光密度参数与内参基因β-actin条带的光密度参数比值作为该标本mRNA的表达水平参数。
统计学处理：各组数据以均数标准差表示，用SAS6.0统计软件对数据进行分析，数据经正态分布检验，组间比较如满足方差齐性用t检验，不满足方差齐性用t′检验。P<0.05为具有统计学意义。
结 果
通心络对MCAO大鼠神经功能缺损评分及梗死体积的影响：大鼠MCAO后出现同侧Horner综合征，麻醉清醒后出现对侧前后肢瘫痪并以前肢为重，24小时存活率为100%。MCAO再灌注12、24、36、48小时的神经缺损积分随缺血再灌注时间的延长而降低，较假手术组有显著差异(P<0.01)。通心络组各时间点神经功能缺损评分均显著高于MCAO再灌注组P<0.05。提示祛风通络方药通心络能有效改善MCAO再灌注大鼠神经功能缺损积分。TTC染色显示，梗死灶从第2脑片延伸至第6脑片，最大梗死面积出现于第3、4脑片(前囟附近)。MCAO再灌注组大鼠脑梗死面积随梗死时间延长而增大。梗死灶位于受损半侧的顶、颞叶皮层及纹状体，以皮层梗死为主。通心络组各时间点脑梗死体积小于MCAO再灌注组(表1、2)。
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表1 通心络对MCAO再灌注大鼠神经功能缺损评分的影响
分组
神经评分(x±s，n＝20)
12h
24h
36h
48h
TXL
5
5
5
5
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MCAO
2.0±1.0
2.5±1.2
2.8±1.3
3.2±1.4
SHAM
2.5±1.5
3.4±1.6*
3.9±1.4*
4.1±1.3*
注：*与MCAO组比较P<0.05
表2
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通心络对MCAO再灌注24小时大鼠梗死体积的影响
分组
病例数
梗死体积(mm3)
MCAO
20
112.21±21.2
TXL
20
86.54±17.51
注：*与MCAO比较P<0.05。
通心络对MCAO再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响：MCAO组大鼠伊文氏蓝含量，于再灌注3小时与48小时时，呈现两个高峰。通心络组再灌注3小时伊文氏蓝含量与MCAO组无显著差异，但24小时、48小时及5天三个时间点，伊文氏蓝含量均显著低于MCAO组P<0.01。提示通心络改善MCAO再灌注大鼠血脑屏障通透性的时间在24小时以后(表3)。
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表3
通心络对MCAO大鼠再灌注血脑屏障的影响(n＝20)
分组
再 灌 注 时 间
1h
3h
24h
48h
5d
TXL
0.44±0.18
0.43±0.12
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0.45±0.13
0.46±0.14
0.43±0.13
MCAO
3.99±0.59*
6.91±2.84*
4.08±0.54*
9.16±3.27*
4.66±2.13*
SHAM
3.06±0.51
6.65±3.28
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3.02±0.52＃
6.71±2.87＃
2.66±0.93＃
注：*与SHAM组比较P<0.05,＃与MCAO组比较P<0.05。
通心络对MCAO大鼠MMP-9基因表达的影响(表4)：假手术组各时间点MMP-9
mRNA仅见微量表达。MCAO组大鼠再灌注24小时MMP-9基因表达开始增加，于48小时达到高峰，持续至第5天；通心络组24小时、48小时、5天的MMP-9 mRNA与MCAO比较均明显降低(P<0.05)。提示通心络能有效抑制急性脑缺血再灌注大鼠脑组织MMP-9 mRNA表达，改善微小循环。
表4
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通心络对MCAO大鼠脑组织MMP-9 mRNA表达的影响
分组
再 灌 注 时 间(x±s，n＝20)
1h
3h
24h
48h
5d
TXL
0.186±0.039
0.192±0.033
0.209±0.022
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0.212±0.045
0.207±0.047
MCAO
0.187±0.054
0.202±0.045
0.581±0.130*
0.717±0.112*
0.556±0.105*
SHAM
0.190±0.050
0.221±0.061
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0.401±0.116*＃
0.578±0.097*＃
0.435±0.115*＃
与SHAM组比较*P<0.05，与MCAO组比较＃P<0.05。
通心络对MCAO大鼠血脑屏障超微结构的影响假手术组各时间点血管内皮细胞完整，细胞间紧密连接存在，血管基膜连续。MCAO大鼠再灌注48
h血脑屏障损伤，血管内皮细胞之间紧密连接开放，血管基膜不连续，有些毛细血管甚至已溶解破坏。通心络组再灌注48小时血脑屏障结构较MCAO组大鼠明显好转。
讨 论
急性缺血性脑卒中脑微小循环障碍是导致半影区低灌注或无灌注现象的重要病理生理过程。导致脑微小循环障碍的原因若以血管为中心大致可归纳为血管内、血管壁和血管外三大类。血管内因素主要包括血小板活化、白细胞激活、红细胞聚集、凝血酶生成及活化、纤维蛋白血栓形成、血液流变学异常等。这些血管内因素相互作用的结果引起脑血管内机械性阻塞，血液流变学异常，血管内皮损伤，血管内低灌注或无灌注，最终引起或加重微小循环障碍。血管壁因素则是指血管内皮细胞、血管平滑肌和血管周围神经对微小循环障碍的影响。急性脑缺血损伤时，血管内皮细胞产生许多炎症前介质参与微小血管的阻塞和白细胞浸润，导致血小板和中性粒细胞活化和黏附，造成局部脑血流和血液流变学改变及血脑屏障通透性升高。缺血的脑血管内皮细胞释放生物活性炎症因子，在缺血反应时，能上调脑内皮细胞中黏附分子选择素和Ig家族，并能促进白细胞黏附和转移入脑。此外，由于脑缺血使促进血管扩张的内皮型一氧化氮及前列腺素产生减少也与微小循环障碍有关。脑缺血和再灌注时产生的自由基与凝血酶等，同样使血管内皮细胞向凝固性方向转变，血小板直接黏附在内皮细胞上，促进微小循环损害。血管外因素包括兴奋性氨基酸增加，细胞去极化扩散，游离的钾离子引起星形细胞肿胀及脑水肿。脑水肿可压迫毛细血管而加重脑微小循环障碍，造成再灌注后“无复流”现象。
目前治疗对策主要有抗白细胞、抗细胞毒素疗法、抑制血小板活化、抑制凝血酶产生、溶解纤维蛋白、血液稀释和改善各种血液因子及脑水肿等。
本实验结果表明，大鼠大脑中动脉线栓2小时后再灌注，不仅仍然存在神经功能缺损与梗死灶，而且大脑中动脉支配的神经区域的血脑屏障通透性增高，血管内皮超微结构损坏，金属基质蛋白酶基因表达上调，提示血管功能异常，支持脑微小循环障碍的观点。这种变化与中医络病理论极为相符。通心络胶囊是吴以岭教授首创，运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，其作用是益气活血，解痉通络能有效减少MCAO再灌注大鼠神经功能缺损与梗死体积，改善血脑屏障功能，抑制金属基质蛋白酶基因表达，有较好的减轻微小循环障碍的作用。, 百拇医药(复旦大学附属中山医院 复旦大学中西医结合研究所 蔡定芳 闻名 戴巍 顾喜喜 范钰 陈依萍 作者简介)