白细胞介素18基因可增强小鼠对胰腺癌细胞的非特异性细胞免疫
【摘要】 目的 研究巨噬细胞和外周血单个核细胞(PBMC)对转染白细胞介素18(IL-18)基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用。方法 巨噬细胞由小鼠腹腔注射ConA刺激后分离培养而获得。PBMC用淋巴细胞分离液分离获得。通过脂质体转染法，将含IL-18基因的质粒及空质粒转染至PC-3细胞。以上基因的表达由Western blot免疫印迹法鉴定。采用Calcein-AM释放法行巨噬细胞和PBMC杀伤实验以评估IL-18对肿瘤免疫调节作用。结果 PBMC和巨噬细胞对转染IL-18基因后的PC-3细胞杀伤率较空质粒组显著增高(P<0.001)。结论 IL-18能增强巨噬细胞杀伤PC-3细胞的能力，提示IL-18对于胰腺癌的免疫治疗具有潜在价值。
关键词 外周血单个核细胞 巨噬细胞 胰腺癌 PC-3 杀伤作用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)01-0001-03
, 百拇医药 IL-18gene can enhance the nonspecific cellular immunity
of mice to the pancreatic cancer cell line
Ni Xiaoling，Jin Dayong，Lou Wenhui，et al.
General Surgery，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To study the killing potential of macrophage and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)to cell line PC-3transfected with IL-18.Methods After ConA injection of mouse abdomen，the macrophages were separated and ten cultured in vitro.PBMC was acquired by acquired from the blood of peripheralblood of nude mice.PC-3cells were transfected with IL-18.expressing plasmid or the control vector by liposome transfection.The expression of those genes was measured by western blot analysis.The potential of tumor immune reguˉlation by IL-18was evaluated macrophage cytotoxicity with the calcein-AM release method.Results The killing potential of macrophage and PBMC to PC-3cells transfected with and IL-18was significantly higher than that of cells transfected with control vector(P<0.001).Conclusion IL-18could enhance the killing potential to PC-3cell bymacrophage.Therefore，it is suggested that mIL-18be used as immune therapy of pancreatic cancer.
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Key words PBMC macrophage pancreatic cancer PC-3 cytotoxicity
肿瘤的发生是由机体的免疫监视和防护功能失常引起的，胰腺癌恶性程度高，迄今治疗效果差，手术切除仍然是主要治疗手段，5年生存率低 [1] ，其生长、扩散很大程度决定于机体防御系统的状态。如何增强机体的免疫功能，尤其是细胞免疫对提高肿瘤的局部控制率、远期生存率及降低复发率有重要作用。其中的非特异性细胞免疫包括巨噬细胞、单核细胞及自然杀伤细胞(NK细胞)构成了机体抵抗肿瘤的第一道防线，研究表明，NK细胞对杀伤循环系统中的肿瘤细胞、防止肿瘤细胞经血行播散起着重要作用;巨噬细胞会趋向于已被抗体包裹的肿瘤细胞、增强NK细胞的作用。而以特异性的细胞因子促进免疫细胞增殖并提高其功能，有可能达到增强宿主抗肿瘤免疫的目的。本实验研究小鼠巨噬细胞和裸鼠外周血单个核细胞(PBMC)对转染细胞介素18(IL-18)基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用，从而评价该细胞因子基因的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 IL-18基因转染PC-3胰腺癌细胞株
1.1.1 胰腺癌细胞株的培养 胰腺癌细胞株PC-3(复旦大学胰腺癌诊治中心)在37℃、5%CO2 培养箱中用含10%胎牛血清和青霉素100IU/ml链霉素100μg/ml、5.6%NaHˉCO3 、pH值为7.2的BMPI-1640(Gibco BRL公司)中培养，3天传代一次。
1.1.2 质粒扩增、纯化 制备感受态大肠杆菌Top10F(复旦大学分子病毒学重点实验室)，将pCDNA3.1质粒、pCDˉNA3.1-mIL-18(复旦大学分子病毒学重点实验室)转化入新鲜制备的感受态大肠杆菌，37℃摇振培养，使质粒大量扩增，取菌液，利用小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司)提取并纯化质粒。
, 百拇医药
1.1.3 基因转染 转染前24h，将4×105 个用胰蛋白酶溶液消化PC-3细胞转接于六孔板内，每孔加3ml含10%胎牛血清的1640培养液，37℃、5%CO 2 培养箱中培养。将待转染的细胞用PBS(pH7.4)洗1次。在2个1.5ml的epˉpenddorf离心管中分别将5μg空质粒pCDNA3.1、pCDNA3.1-IL-18溶于未添加血清及二抗的1640培养液中至150μl，加入20μl Fugene6脂质体，轻摇混合后于25℃下放置10min。再加入1ml完全培养液混匀。立即将混合物滴加在培养瓶中待转染的细胞表面。于CO2 培养箱中培养2h后倒掉转染液，PBS(pH7.4)洗3次。37℃，5%CO 2 下培养。1.1.4 Western blot检测 转染48h后，用PBS洗涤3次。加150μl上样Buffer，刮下细胞，收集于1.5ml eppenddorf管，沸水浴5min。高速离心3min。取30μl上样，电泳，转膜。脱脂奶粉溶于1%PBST，配成5%封闭液，封闭室温1～1.5h，用1×PBST洗涤3次。加入1:1000鼠IL-18单抗(Bioˉscience公司)，4℃过夜。用1×PBST洗涤3次，再加入羊抗鼠二抗(华美公司)，作1:1000倍稀释，室温作用1h。避光显色15min，用ddH 2 O冲洗干净后晾干。
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1.2 小鼠免疫细胞对转染IL-18后的PC-3杀伤效应
1.2.1 靶细胞的准备 分别准备PC-3细胞、转染空质粒的PC-3细胞、转染pCDNA3.1-IL-18质粒的PC-3细胞。传代后培养24h备用。
1.2.2 CalceinAM荧光标记肿瘤细胞 用胰酶将各组PC-3肿瘤细胞消化后计数，调整浓度至1×106 /ml。每管加入CalceinAM5μl，37℃水浴40min。用Hank′s液洗涤细胞2次。荧光显微镜下计数，肿瘤细胞荧光标记率>95%备用。
1.2.3 制备裸鼠外周血单个核细胞(PBMC) 用肝素处理后的头皮针从裸鼠静脉内眦静脉内取血2～3ml。加入等体积的Hank’s液中(pH=7.2)，混匀。共取3只，合并。取Ficoll液3ml/管，将血Hank’s混合液各加入Ficoll中，平衡后，放入离心机内，2500rpm×20min。用毛细吸管吸取第二层液体至一干净的试管内，加入Hank’s液至总体积为10ml。混匀后，平衡后洗涤2次，加入2ml的1640完全培基，充分吹匀细胞沉淀，取微量用1640液1:10稀释后，计数。加上0.5ml培养液。安上针套和盖上注射器套，置37℃培养箱中45min。台盼兰染色，活细胞>90%，该细胞悬液即用于PBMC杀伤实验。
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1.2.4 制备巨噬细胞 提前3天往小鼠腹腔注射ConA，100μg/ml/只(Sigma公司)，将小鼠引颈处死后，用酒精消毒，剪开腹部皮肤，用1ml注射器往腹腔内注射3ml无Ca 2+ 和Mg 2+ 的Hank’s液，轻揉腹部片刻。用毛细吸管吸出腹腔内液体，再用Hank’s液冲洗腹腔3次后，收集所有液体，离心。用Hank’s液洗涤细胞2次，加入无血清(无酚红)的1640培养3h。
1.2.5 PBMC杀伤实验 将标记好的PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1和20:1并稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组、空质粒组和对照组每组8份。37℃、5%CO 2 培养。培养24h后，每孔吸取上清200μl到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值。同时设立自发释放组和最大释放组(最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞)，各设3孔，取平均值。PBMC的杀伤能力=(实验组荧光组-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)×100%。
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1.2.6 巨噬细胞杀伤实验 培养3h后的巨噬细胞，弃上清，用无血清的1640培养液洗3次，洗去未贴壁细胞后，每孔加入0.5ml无酚红的1640完全培养液。将标记好的转染不同质粒PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1或20:1，稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组，空质粒组，空白对照组，每组8份，37℃，5%CO 2 培养。同时设立自发释放对照孔和最大释放孔(最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞)，各设3孔，取平均值。培养48h后，每孔吸取 上清200μL到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值，实验组荧光值减去自发释放量，占最大释放量的百分比表示巨噬细胞的杀伤能力。
1.3 统计学分析 计量数据用ˉx±s标准差表示。所有成对资料用Independent-samplest test检验。采用SPSS10.0统计软件包分析。
2 结果
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2.1 PC-3细胞株经转染mIL-18后，用Western blot检测(图1)，在相应位置出现特异性条带，说明转染成功，PC-3细胞株能够短暂表达mIL-18。图1 转染细胞的蛋白提取物经Western blot检测见
2.2 PBMC杀伤实验 IL-18组杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较(见表1)，差异有非常显著性(P<0.001)。空质粒组与空白对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.3 巨噬细胞杀伤实验 IL-18组杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较(表2)，差异有非常显著性(P<0.001)。空质粒组与空白对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 PBMC杀伤率 (%，n=8)
表2 巨噬细胞杀伤率 (%，n=8)
, http://www.100md.com 3 讨论
裸鼠外周血由于没有T细胞，经Ficoll液分离去除红细胞、白细胞和血小板，再经尼龙毛柱过滤后，去除B细胞和巨噬细胞，存留主要成分为NK细胞和单核细胞。NK细胞在肿瘤的免疫监视中起非常重要作用，缺乏NK细胞的小鼠肿瘤生长快，转移早 [2] 。动物研究表明，自发性和实验性的肿瘤转移多数发生于NK细胞水平低的动物上，而NK细胞活性较高的动物则表现出较强的抗肿瘤转移，应用高活性的脾细胞治疗能部分地恢复NK细胞活性较低的动物的抗转移能力 [3] 。经脾切除及内源性NK细胞封闭的裸鼠人肿瘤模型中，输注人NK细胞后肿瘤消退，同时给予IL-2能增强其作用 [4，5] 。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。它对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，IL-18既可通过穿孔素又可通过Fas配体介导以提高NK细胞杀伤肿瘤的能力 [6，7] 。有报道提示 [8] NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。Tautsui等在内毒素诱导肝损害的动物模型中发现IL-18可通过刺激肝脏淋巴细胞分泌IFN-γ进而促使TNF-α的产生 [9] 。PBMC杀伤实验中IL-18组的杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较差异有极显著性，说明IL-18能增强NK细胞的杀伤活性。而巨噬细胞是一种多潜能细胞，在全身组织分布广泛并具有迁移性，能以吞噬吞饮和受体介导的方式将抗原性颗粒或液体摄入细胞内，可在第一时间接触，识别从任何部位进入机体的抗原;清除凋亡细胞和突变细胞;也能通过其特有的高效抗原递程能力启动T胞和B胞介导的获得性免疫;此外还能产生毒性物质如NO、髓过氧化物酶、中性蛋白酶、溶酶体脱氢酶、次氯酸盐杀伤靶细胞。巨噬细胞可通过多种途径破坏体内的肿瘤细胞，研究发现即使在较大的肿瘤块中，也存在大量巨噬细胞浸润，认为其浸润程度与肿瘤的转移、扩散有密切的关系。但是有作者指出肿瘤周围的巨噬细胞处于低功能状态 [10] ，因此寻找唤醒或增强巨噬细胞作用的途径是当前肿瘤免疫的一项重要工作。本实验发现巨噬细胞对转染IL-18的PC-3细胞株具有明显的杀伤作用(P<0.001)。而且在效靶比为20:1时，巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用远高于效靶比为10:1组，说明巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用存在量效关系。和单纯应用细胞因子时体内浓度低的情况相比，肿瘤细胞导入编码细胞因子的基因后能在肿瘤组织的微环境中产生高浓度的细胞因子，类似细胞因子的旁分泌机制，使它们能够相互正常作用以调节免疫 反应。此外，细胞因子还可诱导肿瘤细胞表面MHC分子或细胞粘附分子，进一步增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本实验发现PC-3细胞株转染IL-18后，巨噬细胞和PBMC对其的杀伤明显增强，提示IL-18是胰腺癌的免疫治疗方面的一个研究方向，并可能具有一定的应用价值。
, 百拇医药
参考文献
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7 Hyodo Y，Matsui K，Hayashi N，et al.IL-18up-regulates perforin-mediated NKactivity without increasing perforin messenger RNA expesˉsion by binding to constitutively expressed IL-18receptor.J Immunol，1999，162(3):1662-1668.
8 Rabinowich H，Vitolo D，Altarac S，et al.Role of cytokines in the adopˉtive immunotherapy of an exprerimental model of human head and neck cancer by human IL-2-activated natural killer cells.J Immunol，1992，149(1):340-349.
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9 Tsutsui H，Matsui K，Kawada N，et al.IL-18accounts for both TNF-alpha-and Fas ligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin-induced liver injury in mice.J Immunol，1997，159(8):3961-3967.
10 Kataki A，Scheid P，Piet M，et al.MarieB potential dual role in lung cancer by supporting both host-defense and tumor progression.J Lab Clin Med，2002，140(5):320-328.
作者单位:200032上海复旦大学附属中山医院普外科
200032上海复旦大学教育部、卫生部医学分子病毒重点实验室
(收稿日期:2003-12-01)
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(倪晓凌 靳大勇 楼文晖 王单松 郑玲洁 袁正宏 吴)
关键词 外周血单个核细胞 巨噬细胞 胰腺癌 PC-3 杀伤作用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)01-0001-03
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of mice to the pancreatic cancer cell line
Ni Xiaoling，Jin Dayong，Lou Wenhui，et al.
General Surgery，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To study the killing potential of macrophage and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)to cell line PC-3transfected with IL-18.Methods After ConA injection of mouse abdomen，the macrophages were separated and ten cultured in vitro.PBMC was acquired by acquired from the blood of peripheralblood of nude mice.PC-3cells were transfected with IL-18.expressing plasmid or the control vector by liposome transfection.The expression of those genes was measured by western blot analysis.The potential of tumor immune reguˉlation by IL-18was evaluated macrophage cytotoxicity with the calcein-AM release method.Results The killing potential of macrophage and PBMC to PC-3cells transfected with and IL-18was significantly higher than that of cells transfected with control vector(P<0.001).Conclusion IL-18could enhance the killing potential to PC-3cell bymacrophage.Therefore，it is suggested that mIL-18be used as immune therapy of pancreatic cancer.
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Key words PBMC macrophage pancreatic cancer PC-3 cytotoxicity
肿瘤的发生是由机体的免疫监视和防护功能失常引起的，胰腺癌恶性程度高，迄今治疗效果差，手术切除仍然是主要治疗手段，5年生存率低 [1] ，其生长、扩散很大程度决定于机体防御系统的状态。如何增强机体的免疫功能，尤其是细胞免疫对提高肿瘤的局部控制率、远期生存率及降低复发率有重要作用。其中的非特异性细胞免疫包括巨噬细胞、单核细胞及自然杀伤细胞(NK细胞)构成了机体抵抗肿瘤的第一道防线，研究表明，NK细胞对杀伤循环系统中的肿瘤细胞、防止肿瘤细胞经血行播散起着重要作用;巨噬细胞会趋向于已被抗体包裹的肿瘤细胞、增强NK细胞的作用。而以特异性的细胞因子促进免疫细胞增殖并提高其功能，有可能达到增强宿主抗肿瘤免疫的目的。本实验研究小鼠巨噬细胞和裸鼠外周血单个核细胞(PBMC)对转染细胞介素18(IL-18)基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用，从而评价该细胞因子基因的作用。
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1 材料与方法
1.1 IL-18基因转染PC-3胰腺癌细胞株
1.1.1 胰腺癌细胞株的培养 胰腺癌细胞株PC-3(复旦大学胰腺癌诊治中心)在37℃、5%CO2 培养箱中用含10%胎牛血清和青霉素100IU/ml链霉素100μg/ml、5.6%NaHˉCO3 、pH值为7.2的BMPI-1640(Gibco BRL公司)中培养，3天传代一次。
1.1.2 质粒扩增、纯化 制备感受态大肠杆菌Top10F(复旦大学分子病毒学重点实验室)，将pCDNA3.1质粒、pCDˉNA3.1-mIL-18(复旦大学分子病毒学重点实验室)转化入新鲜制备的感受态大肠杆菌，37℃摇振培养，使质粒大量扩增，取菌液，利用小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司)提取并纯化质粒。
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1.1.3 基因转染 转染前24h，将4×105 个用胰蛋白酶溶液消化PC-3细胞转接于六孔板内，每孔加3ml含10%胎牛血清的1640培养液，37℃、5%CO 2 培养箱中培养。将待转染的细胞用PBS(pH7.4)洗1次。在2个1.5ml的epˉpenddorf离心管中分别将5μg空质粒pCDNA3.1、pCDNA3.1-IL-18溶于未添加血清及二抗的1640培养液中至150μl，加入20μl Fugene6脂质体，轻摇混合后于25℃下放置10min。再加入1ml完全培养液混匀。立即将混合物滴加在培养瓶中待转染的细胞表面。于CO2 培养箱中培养2h后倒掉转染液，PBS(pH7.4)洗3次。37℃，5%CO 2 下培养。1.1.4 Western blot检测 转染48h后，用PBS洗涤3次。加150μl上样Buffer，刮下细胞，收集于1.5ml eppenddorf管，沸水浴5min。高速离心3min。取30μl上样，电泳，转膜。脱脂奶粉溶于1%PBST，配成5%封闭液，封闭室温1～1.5h，用1×PBST洗涤3次。加入1:1000鼠IL-18单抗(Bioˉscience公司)，4℃过夜。用1×PBST洗涤3次，再加入羊抗鼠二抗(华美公司)，作1:1000倍稀释，室温作用1h。避光显色15min，用ddH 2 O冲洗干净后晾干。
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1.2 小鼠免疫细胞对转染IL-18后的PC-3杀伤效应
1.2.1 靶细胞的准备 分别准备PC-3细胞、转染空质粒的PC-3细胞、转染pCDNA3.1-IL-18质粒的PC-3细胞。传代后培养24h备用。
1.2.2 CalceinAM荧光标记肿瘤细胞 用胰酶将各组PC-3肿瘤细胞消化后计数，调整浓度至1×106 /ml。每管加入CalceinAM5μl，37℃水浴40min。用Hank′s液洗涤细胞2次。荧光显微镜下计数，肿瘤细胞荧光标记率>95%备用。
1.2.3 制备裸鼠外周血单个核细胞(PBMC) 用肝素处理后的头皮针从裸鼠静脉内眦静脉内取血2～3ml。加入等体积的Hank’s液中(pH=7.2)，混匀。共取3只，合并。取Ficoll液3ml/管，将血Hank’s混合液各加入Ficoll中，平衡后，放入离心机内，2500rpm×20min。用毛细吸管吸取第二层液体至一干净的试管内，加入Hank’s液至总体积为10ml。混匀后，平衡后洗涤2次，加入2ml的1640完全培基，充分吹匀细胞沉淀，取微量用1640液1:10稀释后，计数。加上0.5ml培养液。安上针套和盖上注射器套，置37℃培养箱中45min。台盼兰染色，活细胞>90%，该细胞悬液即用于PBMC杀伤实验。
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1.2.4 制备巨噬细胞 提前3天往小鼠腹腔注射ConA，100μg/ml/只(Sigma公司)，将小鼠引颈处死后，用酒精消毒，剪开腹部皮肤，用1ml注射器往腹腔内注射3ml无Ca 2+ 和Mg 2+ 的Hank’s液，轻揉腹部片刻。用毛细吸管吸出腹腔内液体，再用Hank’s液冲洗腹腔3次后，收集所有液体，离心。用Hank’s液洗涤细胞2次，加入无血清(无酚红)的1640培养3h。
1.2.5 PBMC杀伤实验 将标记好的PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1和20:1并稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组、空质粒组和对照组每组8份。37℃、5%CO 2 培养。培养24h后，每孔吸取上清200μl到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值。同时设立自发释放组和最大释放组(最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞)，各设3孔，取平均值。PBMC的杀伤能力=(实验组荧光组-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)×100%。
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1.2.6 巨噬细胞杀伤实验 培养3h后的巨噬细胞，弃上清，用无血清的1640培养液洗3次，洗去未贴壁细胞后，每孔加入0.5ml无酚红的1640完全培养液。将标记好的转染不同质粒PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1或20:1，稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组，空质粒组，空白对照组，每组8份，37℃，5%CO 2 培养。同时设立自发释放对照孔和最大释放孔(最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞)，各设3孔，取平均值。培养48h后，每孔吸取 上清200μL到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值，实验组荧光值减去自发释放量，占最大释放量的百分比表示巨噬细胞的杀伤能力。
1.3 统计学分析 计量数据用ˉx±s标准差表示。所有成对资料用Independent-samplest test检验。采用SPSS10.0统计软件包分析。
2 结果
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2.1 PC-3细胞株经转染mIL-18后，用Western blot检测(图1)，在相应位置出现特异性条带，说明转染成功，PC-3细胞株能够短暂表达mIL-18。图1 转染细胞的蛋白提取物经Western blot检测见
2.2 PBMC杀伤实验 IL-18组杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较(见表1)，差异有非常显著性(P<0.001)。空质粒组与空白对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.3 巨噬细胞杀伤实验 IL-18组杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较(表2)，差异有非常显著性(P<0.001)。空质粒组与空白对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 PBMC杀伤率 (%，n=8)
表2 巨噬细胞杀伤率 (%，n=8)
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裸鼠外周血由于没有T细胞，经Ficoll液分离去除红细胞、白细胞和血小板，再经尼龙毛柱过滤后，去除B细胞和巨噬细胞，存留主要成分为NK细胞和单核细胞。NK细胞在肿瘤的免疫监视中起非常重要作用，缺乏NK细胞的小鼠肿瘤生长快，转移早 [2] 。动物研究表明，自发性和实验性的肿瘤转移多数发生于NK细胞水平低的动物上，而NK细胞活性较高的动物则表现出较强的抗肿瘤转移，应用高活性的脾细胞治疗能部分地恢复NK细胞活性较低的动物的抗转移能力 [3] 。经脾切除及内源性NK细胞封闭的裸鼠人肿瘤模型中，输注人NK细胞后肿瘤消退，同时给予IL-2能增强其作用 [4，5] 。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。它对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，IL-18既可通过穿孔素又可通过Fas配体介导以提高NK细胞杀伤肿瘤的能力 [6，7] 。有报道提示 [8] NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。Tautsui等在内毒素诱导肝损害的动物模型中发现IL-18可通过刺激肝脏淋巴细胞分泌IFN-γ进而促使TNF-α的产生 [9] 。PBMC杀伤实验中IL-18组的杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较差异有极显著性，说明IL-18能增强NK细胞的杀伤活性。而巨噬细胞是一种多潜能细胞，在全身组织分布广泛并具有迁移性，能以吞噬吞饮和受体介导的方式将抗原性颗粒或液体摄入细胞内，可在第一时间接触，识别从任何部位进入机体的抗原;清除凋亡细胞和突变细胞;也能通过其特有的高效抗原递程能力启动T胞和B胞介导的获得性免疫;此外还能产生毒性物质如NO、髓过氧化物酶、中性蛋白酶、溶酶体脱氢酶、次氯酸盐杀伤靶细胞。巨噬细胞可通过多种途径破坏体内的肿瘤细胞，研究发现即使在较大的肿瘤块中，也存在大量巨噬细胞浸润，认为其浸润程度与肿瘤的转移、扩散有密切的关系。但是有作者指出肿瘤周围的巨噬细胞处于低功能状态 [10] ，因此寻找唤醒或增强巨噬细胞作用的途径是当前肿瘤免疫的一项重要工作。本实验发现巨噬细胞对转染IL-18的PC-3细胞株具有明显的杀伤作用(P<0.001)。而且在效靶比为20:1时，巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用远高于效靶比为10:1组，说明巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用存在量效关系。和单纯应用细胞因子时体内浓度低的情况相比，肿瘤细胞导入编码细胞因子的基因后能在肿瘤组织的微环境中产生高浓度的细胞因子，类似细胞因子的旁分泌机制，使它们能够相互正常作用以调节免疫 反应。此外，细胞因子还可诱导肿瘤细胞表面MHC分子或细胞粘附分子，进一步增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本实验发现PC-3细胞株转染IL-18后，巨噬细胞和PBMC对其的杀伤明显增强，提示IL-18是胰腺癌的免疫治疗方面的一个研究方向，并可能具有一定的应用价值。
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作者单位:200032上海复旦大学附属中山医院普外科
200032上海复旦大学教育部、卫生部医学分子病毒重点实验室
(收稿日期:2003-12-01)
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(倪晓凌 靳大勇 楼文晖 王单松 郑玲洁 袁正宏 吴)