转NGF基因星形胶质细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究(基金项目)
http://www.100md.com
中华实用医药杂志 2003年12月 第3卷 第23期
基金项目:江苏省科委应用基础研究计划资助项目(BJ99062)
【摘要】 目的 观察转NGF基因星形胶质细胞移植对大鼠脑出血后神经功能恢复的影响。方法 制作SD大鼠脑出血模型，随机分组:A组，转基因细胞移植组;B组，纯细胞移植组;C组，对照组。3天后分别将转化NGF基因及未经转化的星形胶质细胞注入A，B组血肿区脑组织内。根据神经功能缺陷评分及SEP(体感诱发电位)观察大鼠神经功能恢复情况，应用免疫组化和ELISA法检测纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数目和NGF蛋白表达。结果 功能评分显示，出血2周后A组开始较B，C组有明显的神经功能恢复。出血后3组均出现SEP潜伏期延长，但A组短于另两组，有统计学差异，第4周A组已恢复到出血前水平。第5周取移植区脑组织做GFAP免疫组化，A组GFAP阳性细胞数目显著多于B，C组，经ELISA法检测A组NGF表达明显高于B，C两组。结论 转NGF基因星形胶质细胞可有效表达NGF，并促进脑出血大鼠神经功能恢复。
关键词 NGF 星形胶质细胞 移植 脑出血
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2128-03
Experimental study of transplantation of astrocyte genetically
transferredby NGF for treating mouse cerebral hemorrhage
Liu Ning，Zhu Fengyi，Zhao Chunsheng，et al.
Department of Neurosuegery，The First Affiliated Hospital，NanJing Medical University，
Nang Jing，JiangSu Province，210029.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To observe the affection to neurological functionalrecovery of transplantation of astroˉcyte transferred by NGF gene to treat cerebral hemorrhage.Methods The cerebral hemorrhage mouse models were made and randomly divided into3Groups:NGF/astrocyte group(A)，astrocyte group(B)and control group(C).Astroˉcyte with NGF gene and astrocyte without NGF gene were respectively implanted in the lesion of animals in group A and B72hours after hemorrhage.Meanwhile，animals in group C were injected by NS in the same volume.Three groups were compared in behavioral tests through neurological deficit score and SEP was used to observe the function recovery.Animals were killed5weeks after hemorrhage and the immunohistochemical staining to GFAP was performed for counting the positive cells.ELISA method was employed to detect the express of NGF.ResultsAssessed by neuˉrological deficit scores，functional recovery was found in group A was significantly superior to B and C2weeks after hemorrhage.The latency time of SEP in three groups was prolonged after hemorrhage，but it was shorter in group A than that in group B and C and the time had reached the normal level in the4th week in group A.Significantly inˉcreased numbers of GFAP positive cells could be detected in group A compared to B and C.ELISA method confirmed that the local concerntration of NGF in groupA was significantly higher than the other twogroups.From all the data，difference between group B and C could not be confirmed.Conclusion Astrocyte transferred by NGF gene could surˉvived in host body and express objective gene after transplantation efficiently.It’s transplantationto treat cerebral hemˉorrhage could effectively improve the recovery of neurological function.
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Key words NGF astrocyte transplantation cerebral hemorrhage
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对交感和感觉神经元的生长、发育、分化、存活和功能特性的表达具有重要的调节作用，并能促进损伤后神经元的再生与修复 [1] 。外源性NGF同样对脑损伤后神经元变性、坏死具有保护和修复作用 [2] 。本研究选用SD大鼠制作脑出血模型，将转NGF基因星形胶质细胞移植入出血区，观察其对大鼠脑出血性损伤的治疗作用。
1 材料和方法
1.1 动物及主要试剂 健康SD大鼠由南京医科大学动物实验中心提供。转大鼠β-NGF基因及正常纯化培养的星形胶质细胞均由本课题的前期工作完成。生物素标记的羊抗兔IgG和ABC复合物均为Sigma公司产品，兔抗大鼠GFAP购自Zymed公司。大鼠NGF ELISA试剂盒购自Promega公司。
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1.2 大鼠脑出血模型的制作 随机选取220～250g雄性SD大鼠35只，以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(35mg/kg体重)，备皮后固定在江湾C型立体定向仪上，调整定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前囟和后囟基本上在同一平面上;局部皮肤消毒，在前囟前0.2mm，中线右旁3mm处做一长度为2mm左右的纵行切口，暴露颅骨，用牙科钻钻一直径约1mm的圆孔。用40℃温水浸泡鼠尾数分钟，消毒后用微量注射器抽取鼠尾血50μl，沿钻孔方向垂直进针，深约6mm，接着缓慢均速推注入脑，注血后留针10min后缓慢退出，缝合头皮，送动物房饲养。术后3天内2只死亡，淘汰另3只无明显偏瘫症状者，余30只供脑内移植使用。
1.3 动物分组与脑内移植 将脑出血大鼠模型随机分为3 组，转NGF基因星形胶质细胞移植组(A组)，星形胶质细胞移植组(B组)，对照组(C组)各10只。模型制备3天后将大鼠麻醉，取事先贮备计数培养的细胞悬液浓度均调整为1×10 7 细胞/100μl。取15μl上述细胞悬液，进行分组移植，沿原骨孔处垂直进针，进入5mm、6mm和7mm处各缓慢注入细胞悬液5μl，留针10min后缓慢拔针。对照组以同样方法注入同量生理盐水。
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1.4 大鼠行为能力观察 参照Del Bigio [5] 等方法，从以下四方面进行大鼠神经功能缺陷评分:(1)自发对侧转圈，不转为0分，连续转圈为4分;(2)对侧后肢给以2～3cm的牵拉，即刻回缩为0分，不回缩4分;(3)通过70cm长，2.4cm木桥:能通过为0分，不能通过或掉落为4分;(4)抓握2mm直径钢环的能力:能正常用前爪抓持为0分，不能为4分。这四方面总计分即为功能缺陷评分，最高16分，分值越大，提示神经功能受损越重。
1.5 体感诱发电位观察 分别检测各组体感诱发电位(SEPs)。方法是:将大鼠固定，经皮肤电刺激左后肢踝部胫后神经，刺激参数为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在左后肢近端以皮下针头接地。记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下。引得的信号经滤波放大后，输入微机操作系统进行平均叠加，叠加次数1000次，分析时间为80ms，最后显示和打印SEP图形，以施加刺激开始到N 2 波波峰的潜伏时限为测量指标。
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1.6 GFAP免疫组化检测 脑出血5周后每组处死大鼠5只，取大脑后用冰冻切片机将移植区脑组织切成30μm厚的连续冠状切片，进行GFAP免疫组织化学反应:切片在0.01mmol/L PBS中漂洗后，经二甲苯脱水，以3%H 2 O 2 阻断内源性过氧化酶5min后，用10%羊血清室温下作用1h，以阻断非特异性抗原结合，然后在含0.5%tritonX-100的PBS中与1∶500多克隆兔抗大鼠GFAP于4℃反应24h，加入二抗:生物素化的1∶200羊抗兔IgG，4℃反应24h，与1∶200ABC复合物室温反应3h。以上各步骤间均用PBS液充分漂洗3次，每次10min。最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法呈色。常规脱水、透明、封片，光镜观察。PBS代替一抗作对照。
1.7 ELISA法测定NGF表达 鼠脑出血5周后每组另处死5只大鼠，取移植区及对侧相应部位脑组织迅速放入干冰内-80℃保存，按1∶10比例(1g组织/10ml液体)加入Hank’s液，超声匀化组织，4℃、15000r/min、离心30min后取上清。用大鼠NGF ELISA试剂盒，按盒内操作说明，加测定稀释液后，加入标准品和待测标本，室温下孵化2h，洗涤3次，加HRP-抗体结合物，室温下孵化2h，洗涤3次，加底物显色25min，终止显色，用酶联免疫检测仪测OD450nm值， 按标准曲线计算上清NGF含量，单位换算为pg/mg脑组织。
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1.8 统计学方法 单因素成组设计方差分析、多重比较q检验用SPSS11.0统计软件分析，Sigmaplot2000软件作图。
2 结果
2.1 移植后各组神经功能缺陷评分比较 分别记录各组动物脑出血后3、5、7、14、21、28、35天的神经功能缺陷评分，显示三组的评分随时间进展而递减，说明脑出血后神经功能具有自然恢复过程;对照组(C组)与单纯细胞移植组(B组)评分始终无统计学差异(P>0.05);在出血后2周内，三组间的评分无明显差异;但后3周内移植转基因组(A组)的评分则较另两组有显著下降(P<0.01)(表1)。
2.2 移植后体感诱发电位的改变 1、2、4周测SEPs，B、C两组潜伏期均较出血前明显延长(P<0.01)，A组在1、2周亦有延长，但4周已经与出血前无明显差异(P>0.05)，且2、4周所测结果较另两组潜伏期下降明显，组间比较P<0.01(表2)。
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2.3 GFAP免疫组化观察及NGF表达 每一标本均取移植区部位5张不同断面切片，3组所选断面一致。400×光镜下记录每张切片10个随机高倍视野中的阳性细胞数，不论染色程度，凡胞浆显棕褐色者为阳性，取算术平均数作为计数结果，5张切片计数结果再取算术平均数代表该区的星形胶质细胞数目。镜下可见移植组(A，B)GFAP阳性细胞数目明显多于对照组(图1，2)，其均值均达对照组3倍以上(表3)。ELISA法测定三组移植区NGF蛋白表达，显示B、C组仅有少量表达，而A组则有较高水平的蛋白表达，与前者有统计学显著差异(表4)，蛋白浓度可达前者的2.5倍以上。
3 讨论
动物实验资料表明，神经系统的细胞移植能恢复及保护某些神经功能，从而使其可能发展成为治疗人类神经疾患的一种手段。经目的基因修饰的神经细胞移植是基因治疗神经系统病变的新途径。NGF是最先被发现的神经营养因子，最具感觉和运动神经元营养活性 [7] ;能参与胆碱能神经元功能，通过刺激胆碱能神经元，介导乙酰胆碱释放，从而提高感觉、运动功能。有人向脑室内注入外源性NGF，可使损伤部位存活神经元数目增多，后期神经功能恢复较好 [8] 。NGF由于在体内表达量很少，正常情况下，只有不到10%的NGF受体处于饱和状态，因此即使在病理情况下，NGF靶细胞也要竞争这为数不多的NGF，而微量的NGF浓度改变就可以产生广泛的生理效应 [9] 。有人在大鼠实验中，通过移植基因转染的纤维母细胞以产生NGF来阻止胆碱能神经元的变性，移植物所产生的NGF的作用是将同等剂量的NGF用传统脑室内灌流所产生作用的40倍 [10] 。
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成功的基因治疗取决于以下因素:携带基因的靶细胞的选择、基因转导方法、目的基因长期表达的控制因素等，腺病毒由于具备宿主细胞广泛，不整合到宿主细胞基因组，无插入突变危险，比较安全;易繁殖;基因组大;具有很高的体内外转化效率(几乎可达100%)，更易表达目的基因等诸多优点，近来尤其受到重视。
移植物在宿主体内存活是其稳定表达转基因的前提，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为星形胶质细胞的有效标记物 [11] ，其免疫组化反应的强弱可以反应细胞的活性。在脑损伤的早期，由于星形胶质细胞的反应性，也可以出现GFAP免疫阳性增强现象 [12] ，但在本研究中，我们取出血后5周之标本，进行移植组和对照组(两者脑损伤程度一致)的GFAP阳性细胞计数观察，发现两者之间的阳性细胞数目有统计学显著差异，前者为后者的数倍，因此可以认为数目的差异是由于出血5周后移植细胞在移植区依然存活并保持活性所致。而同时进行的ELISA法检测，也可以证实移植细胞在宿主体内能有效表达NGF。
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我们利用立体定向和自体血注射成功建立了大鼠内囊出血的模型，并用神经功能缺陷评分和体感诱发电位(SEP)来评价出血后的神经功能恢复。SEP是一种客观、定量、重复性好的检测感觉传导功能的方法，对感觉传导路的压迫性损害尤为敏感。我们可以观察到转基因细胞移植组的潜伏期最早恢复正常，而功能评分亦显示转基因组的神经功能恢复要明显优于另两组。以往认为脑损伤后的星形胶质细胞的胶质化反应，能阻止轴突的再生，影响神经的修复 [14] ;而近来研究发现，胶质化有助于保护周围正常组织不受继发损害，对伤后修复也有促进作用 [15] 。本研究中，单纯移植组与对照组对神经功能的恢复并无差异，因此星形胶质细胞的确切效应尚需进一步研究。 (本文图表见附页1)
参考文献
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作者单位:210029南京医科大学第一附属医院神经外科
(编辑黄 杰), 百拇医药(刘 宁 朱风仪 赵春生 蒋 健 戴如飞)
【摘要】 目的 观察转NGF基因星形胶质细胞移植对大鼠脑出血后神经功能恢复的影响。方法 制作SD大鼠脑出血模型，随机分组:A组，转基因细胞移植组;B组，纯细胞移植组;C组，对照组。3天后分别将转化NGF基因及未经转化的星形胶质细胞注入A，B组血肿区脑组织内。根据神经功能缺陷评分及SEP(体感诱发电位)观察大鼠神经功能恢复情况，应用免疫组化和ELISA法检测纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数目和NGF蛋白表达。结果 功能评分显示，出血2周后A组开始较B，C组有明显的神经功能恢复。出血后3组均出现SEP潜伏期延长，但A组短于另两组，有统计学差异，第4周A组已恢复到出血前水平。第5周取移植区脑组织做GFAP免疫组化，A组GFAP阳性细胞数目显著多于B，C组，经ELISA法检测A组NGF表达明显高于B，C两组。结论 转NGF基因星形胶质细胞可有效表达NGF，并促进脑出血大鼠神经功能恢复。
关键词 NGF 星形胶质细胞 移植 脑出血
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2128-03
Experimental study of transplantation of astrocyte genetically
transferredby NGF for treating mouse cerebral hemorrhage
Liu Ning，Zhu Fengyi，Zhao Chunsheng，et al.
Department of Neurosuegery，The First Affiliated Hospital，NanJing Medical University，
Nang Jing，JiangSu Province，210029.
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【Abstract】 Objective To observe the affection to neurological functionalrecovery of transplantation of astroˉcyte transferred by NGF gene to treat cerebral hemorrhage.Methods The cerebral hemorrhage mouse models were made and randomly divided into3Groups:NGF/astrocyte group(A)，astrocyte group(B)and control group(C).Astroˉcyte with NGF gene and astrocyte without NGF gene were respectively implanted in the lesion of animals in group A and B72hours after hemorrhage.Meanwhile，animals in group C were injected by NS in the same volume.Three groups were compared in behavioral tests through neurological deficit score and SEP was used to observe the function recovery.Animals were killed5weeks after hemorrhage and the immunohistochemical staining to GFAP was performed for counting the positive cells.ELISA method was employed to detect the express of NGF.ResultsAssessed by neuˉrological deficit scores，functional recovery was found in group A was significantly superior to B and C2weeks after hemorrhage.The latency time of SEP in three groups was prolonged after hemorrhage，but it was shorter in group A than that in group B and C and the time had reached the normal level in the4th week in group A.Significantly inˉcreased numbers of GFAP positive cells could be detected in group A compared to B and C.ELISA method confirmed that the local concerntration of NGF in groupA was significantly higher than the other twogroups.From all the data，difference between group B and C could not be confirmed.Conclusion Astrocyte transferred by NGF gene could surˉvived in host body and express objective gene after transplantation efficiently.It’s transplantationto treat cerebral hemˉorrhage could effectively improve the recovery of neurological function.
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Key words NGF astrocyte transplantation cerebral hemorrhage
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对交感和感觉神经元的生长、发育、分化、存活和功能特性的表达具有重要的调节作用，并能促进损伤后神经元的再生与修复 [1] 。外源性NGF同样对脑损伤后神经元变性、坏死具有保护和修复作用 [2] 。本研究选用SD大鼠制作脑出血模型，将转NGF基因星形胶质细胞移植入出血区，观察其对大鼠脑出血性损伤的治疗作用。
1 材料和方法
1.1 动物及主要试剂 健康SD大鼠由南京医科大学动物实验中心提供。转大鼠β-NGF基因及正常纯化培养的星形胶质细胞均由本课题的前期工作完成。生物素标记的羊抗兔IgG和ABC复合物均为Sigma公司产品，兔抗大鼠GFAP购自Zymed公司。大鼠NGF ELISA试剂盒购自Promega公司。
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1.2 大鼠脑出血模型的制作 随机选取220～250g雄性SD大鼠35只，以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(35mg/kg体重)，备皮后固定在江湾C型立体定向仪上，调整定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前囟和后囟基本上在同一平面上;局部皮肤消毒，在前囟前0.2mm，中线右旁3mm处做一长度为2mm左右的纵行切口，暴露颅骨，用牙科钻钻一直径约1mm的圆孔。用40℃温水浸泡鼠尾数分钟，消毒后用微量注射器抽取鼠尾血50μl，沿钻孔方向垂直进针，深约6mm，接着缓慢均速推注入脑，注血后留针10min后缓慢退出，缝合头皮，送动物房饲养。术后3天内2只死亡，淘汰另3只无明显偏瘫症状者，余30只供脑内移植使用。
1.3 动物分组与脑内移植 将脑出血大鼠模型随机分为3 组，转NGF基因星形胶质细胞移植组(A组)，星形胶质细胞移植组(B组)，对照组(C组)各10只。模型制备3天后将大鼠麻醉，取事先贮备计数培养的细胞悬液浓度均调整为1×10 7 细胞/100μl。取15μl上述细胞悬液，进行分组移植，沿原骨孔处垂直进针，进入5mm、6mm和7mm处各缓慢注入细胞悬液5μl，留针10min后缓慢拔针。对照组以同样方法注入同量生理盐水。
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1.4 大鼠行为能力观察 参照Del Bigio [5] 等方法，从以下四方面进行大鼠神经功能缺陷评分:(1)自发对侧转圈，不转为0分，连续转圈为4分;(2)对侧后肢给以2～3cm的牵拉，即刻回缩为0分，不回缩4分;(3)通过70cm长，2.4cm木桥:能通过为0分，不能通过或掉落为4分;(4)抓握2mm直径钢环的能力:能正常用前爪抓持为0分，不能为4分。这四方面总计分即为功能缺陷评分，最高16分，分值越大，提示神经功能受损越重。
1.5 体感诱发电位观察 分别检测各组体感诱发电位(SEPs)。方法是:将大鼠固定，经皮肤电刺激左后肢踝部胫后神经，刺激参数为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在左后肢近端以皮下针头接地。记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下。引得的信号经滤波放大后，输入微机操作系统进行平均叠加，叠加次数1000次，分析时间为80ms，最后显示和打印SEP图形，以施加刺激开始到N 2 波波峰的潜伏时限为测量指标。
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1.6 GFAP免疫组化检测 脑出血5周后每组处死大鼠5只，取大脑后用冰冻切片机将移植区脑组织切成30μm厚的连续冠状切片，进行GFAP免疫组织化学反应:切片在0.01mmol/L PBS中漂洗后，经二甲苯脱水，以3%H 2 O 2 阻断内源性过氧化酶5min后，用10%羊血清室温下作用1h，以阻断非特异性抗原结合，然后在含0.5%tritonX-100的PBS中与1∶500多克隆兔抗大鼠GFAP于4℃反应24h，加入二抗:生物素化的1∶200羊抗兔IgG，4℃反应24h，与1∶200ABC复合物室温反应3h。以上各步骤间均用PBS液充分漂洗3次，每次10min。最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法呈色。常规脱水、透明、封片，光镜观察。PBS代替一抗作对照。
1.7 ELISA法测定NGF表达 鼠脑出血5周后每组另处死5只大鼠，取移植区及对侧相应部位脑组织迅速放入干冰内-80℃保存，按1∶10比例(1g组织/10ml液体)加入Hank’s液，超声匀化组织，4℃、15000r/min、离心30min后取上清。用大鼠NGF ELISA试剂盒，按盒内操作说明，加测定稀释液后，加入标准品和待测标本，室温下孵化2h，洗涤3次，加HRP-抗体结合物，室温下孵化2h，洗涤3次，加底物显色25min，终止显色，用酶联免疫检测仪测OD450nm值， 按标准曲线计算上清NGF含量，单位换算为pg/mg脑组织。
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1.8 统计学方法 单因素成组设计方差分析、多重比较q检验用SPSS11.0统计软件分析，Sigmaplot2000软件作图。
2 结果
2.1 移植后各组神经功能缺陷评分比较 分别记录各组动物脑出血后3、5、7、14、21、28、35天的神经功能缺陷评分，显示三组的评分随时间进展而递减，说明脑出血后神经功能具有自然恢复过程;对照组(C组)与单纯细胞移植组(B组)评分始终无统计学差异(P>0.05);在出血后2周内，三组间的评分无明显差异;但后3周内移植转基因组(A组)的评分则较另两组有显著下降(P<0.01)(表1)。
2.2 移植后体感诱发电位的改变 1、2、4周测SEPs，B、C两组潜伏期均较出血前明显延长(P<0.01)，A组在1、2周亦有延长，但4周已经与出血前无明显差异(P>0.05)，且2、4周所测结果较另两组潜伏期下降明显，组间比较P<0.01(表2)。
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2.3 GFAP免疫组化观察及NGF表达 每一标本均取移植区部位5张不同断面切片，3组所选断面一致。400×光镜下记录每张切片10个随机高倍视野中的阳性细胞数，不论染色程度，凡胞浆显棕褐色者为阳性，取算术平均数作为计数结果，5张切片计数结果再取算术平均数代表该区的星形胶质细胞数目。镜下可见移植组(A，B)GFAP阳性细胞数目明显多于对照组(图1，2)，其均值均达对照组3倍以上(表3)。ELISA法测定三组移植区NGF蛋白表达，显示B、C组仅有少量表达，而A组则有较高水平的蛋白表达，与前者有统计学显著差异(表4)，蛋白浓度可达前者的2.5倍以上。
3 讨论
动物实验资料表明，神经系统的细胞移植能恢复及保护某些神经功能，从而使其可能发展成为治疗人类神经疾患的一种手段。经目的基因修饰的神经细胞移植是基因治疗神经系统病变的新途径。NGF是最先被发现的神经营养因子，最具感觉和运动神经元营养活性 [7] ;能参与胆碱能神经元功能，通过刺激胆碱能神经元，介导乙酰胆碱释放，从而提高感觉、运动功能。有人向脑室内注入外源性NGF，可使损伤部位存活神经元数目增多，后期神经功能恢复较好 [8] 。NGF由于在体内表达量很少，正常情况下，只有不到10%的NGF受体处于饱和状态，因此即使在病理情况下，NGF靶细胞也要竞争这为数不多的NGF，而微量的NGF浓度改变就可以产生广泛的生理效应 [9] 。有人在大鼠实验中，通过移植基因转染的纤维母细胞以产生NGF来阻止胆碱能神经元的变性，移植物所产生的NGF的作用是将同等剂量的NGF用传统脑室内灌流所产生作用的40倍 [10] 。
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成功的基因治疗取决于以下因素:携带基因的靶细胞的选择、基因转导方法、目的基因长期表达的控制因素等，腺病毒由于具备宿主细胞广泛，不整合到宿主细胞基因组，无插入突变危险，比较安全;易繁殖;基因组大;具有很高的体内外转化效率(几乎可达100%)，更易表达目的基因等诸多优点，近来尤其受到重视。
移植物在宿主体内存活是其稳定表达转基因的前提，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为星形胶质细胞的有效标记物 [11] ，其免疫组化反应的强弱可以反应细胞的活性。在脑损伤的早期，由于星形胶质细胞的反应性，也可以出现GFAP免疫阳性增强现象 [12] ，但在本研究中，我们取出血后5周之标本，进行移植组和对照组(两者脑损伤程度一致)的GFAP阳性细胞计数观察，发现两者之间的阳性细胞数目有统计学显著差异，前者为后者的数倍，因此可以认为数目的差异是由于出血5周后移植细胞在移植区依然存活并保持活性所致。而同时进行的ELISA法检测，也可以证实移植细胞在宿主体内能有效表达NGF。
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我们利用立体定向和自体血注射成功建立了大鼠内囊出血的模型，并用神经功能缺陷评分和体感诱发电位(SEP)来评价出血后的神经功能恢复。SEP是一种客观、定量、重复性好的检测感觉传导功能的方法，对感觉传导路的压迫性损害尤为敏感。我们可以观察到转基因细胞移植组的潜伏期最早恢复正常，而功能评分亦显示转基因组的神经功能恢复要明显优于另两组。以往认为脑损伤后的星形胶质细胞的胶质化反应，能阻止轴突的再生，影响神经的修复 [14] ;而近来研究发现，胶质化有助于保护周围正常组织不受继发损害，对伤后修复也有促进作用 [15] 。本研究中，单纯移植组与对照组对神经功能的恢复并无差异，因此星形胶质细胞的确切效应尚需进一步研究。 (本文图表见附页1)
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作者单位:210029南京医科大学第一附属医院神经外科
(编辑黄 杰), 百拇医药(刘 宁 朱风仪 赵春生 蒋 健 戴如飞)