消化道肿瘤患者外周血CK-19mRNA的表达
【摘要】 目的 研究消化道恶性肿瘤患者外周血CK-19mRNA表达的临床价值。方法 采用荧光定量RT-PCR检测外周血CK-19mRNA的表达。结果 消化道恶性肿瘤患者112例外周血CK-19mRNA的表达阳性率为53.57%(60/112)，对照组29例(健康人)未见表达。原发性肿瘤、远端转移的患者外周血CK-19mRNA呈高表达，而化疗后外周血CK-19mRNA表达阳率和水平下降(P<0.05)。结论 本法对外周血CK-19mRNA的表达具有敏感性、特异性。因而，对消化道恶性肿瘤的辅助诊断、决定治疗手段、判断疗效、有否转移和预后有着重要的临床价值。
关键词 消化道肿瘤 荧光定量检测 RT-PCR CK-19mRNA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2139-02
Quantitation of CK-19mRNA gene expression in peripheral blood
, http://www.100md.com
in patients with digestive system neoplasms
Jiang Donglin，Gao Yufen，Sun Junming
Wuxi NO.3Hospital，JiangSu214041.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of CK-19mRNA in peripheral blood in patients with digestive system neoplasms.Methods Real-time transcription-PCR assay was used to detect the expression of CK-19mRNA in peripheral blood of112patients with digestive system neoplasms and29healthy individuals.Results The position rate of CK-19mRNA expression in peripheral blood of patients with gastrointestiˉnal neoplasms was53.57%(60/112)，and no expression in29healthy individuals.The copy number of CK-19mRˉNA expression was significantly enhanced in patients with metastasis，and decreased in patientsafter treated(P<0.05).Conclusion The real-time transcription-PCR is a sensitive and specific accurate assay for detecting the exˉpression of CK-19mRNA in patients with digestive system neoplasms.It may be used to predict the early metastasis of neoplasms，which possesses clinical significance in assessing the prognosis and scheme of therapy.
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Key words digestive system neoplasms fluorogenic quantitative detection RT-PCR CK-19mRNA
消化道恶性肿瘤的死亡率居于所有恶性肿瘤的首位，5年生存率较低。其死亡大多由于手术及化疗后的复发和转移，20世纪80年代以来许多学者开展了对肿瘤微转移的研究。RT-PCR已被广应用于检查外周血、淋巴结、骨等微转移病灶，作为对多种恶性肿瘤的研究，显示了较高的敏感性和特异性。CK-19是细胞角蛋白家族的一种，构成细胞骨架的中间微丝，主要分布于上皮组织内，而血液、骨髓等没有该蛋白的存在，当上皮类恶性肿瘤存在或发生转移等情况，其已被认为是检测循环癌细胞的敏感标记物 [1～4] 。我们用荧光定量RT-PCR方法探讨消化道恶性肿瘤患者外周血CK-19mRNA的表达。
1 资料和方法
1.1 研究对象 病理及影像学明确诊断的消化道恶性肿瘤患者112例(食道癌患者33例，胃癌患者54例，直/结肠癌患者25例)，其中，男67例，女45例;年龄34～74岁，平均年龄53.7岁。其中，未经治疗患者53例，经化疗一个疗程以上的患者37例，远端转移患者22例，均为我院住院病人。对照组采用我院健康体检者29例。
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1.2 标本收集 使用负压针筒抽取患者和对照组静脉血，防止表皮细胞掺入，取第二管血，提取单个核细胞RNA，-80℃保存备用。
1.3 主要试剂及仪器 CK-19mRNA核酸扩增荧光检测试剂盒由北京艾森博奥科技发展有限公司提供，应用罗氏荧光定量PCR仪(Lightcycle)检测分析。
1.4 检测方法 严格按操作说明书规范操作，其中荧光定量PCR每次试验设立5个标准品，拷贝数为10 8 、10 7 、10 4 、10 5 、10 6 (由试剂盒标准品10 9 copy/ml梯度稀释而成)，并设立空白、阴性、阳性对照。
1.5 统计学方法 荧光定量PCR检测外周血CK-19mRˉNA拷贝数以其Lg值表示。定量资料采用t检验、定性资料采用X 2 检验。
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2 结果
外周血CK-19mRNA阳性率与拷贝数比较以拷贝数≥1.000E+03copies/ml为阳性，拷贝数<1.000E+03copise/ml为阴性。食道癌组、胃癌组、直/结肠癌组各组之间阳性率及CK-19mRNA拷贝数均无统计学差异(P>0.05)，对照组未见表达，见表1。原发肿瘤组、化疗组和远端转移组之间阳性率、拷贝数差异均有显著性(P<0.05)见表2。
表1 消化道肿瘤患者外周血CK-19mRNA表达
注:P值为食道癌组、胃癌组、直/结肠癌组各组间的比较
表2 原发肿瘤、化疗和远端转移患者外周血CK-19mRNA表达
3 讨论
消化道恶性肿瘤的早期发现、早期诊断是治疗成功的关键，而一般影像学方法发现一个实体瘤的灵敏度较低，常为10 9 的细胞数;寻找高敏感性、特异性的生物学标志物是分子生物学研究早期诊断恶性肿瘤及微转移的主要内容之一。CK-19来自于上皮类肿瘤细胞，其具有组织特异性而无细胞特异性，在正常人造血细胞及外周循环血中无CK-19mRNA的表达，故早期检测出外周血中CK-19mRNA的表达，有助于判断恶性肿瘤细胞异位存在的可能性 [5]。目前早期检出血中循环癌细胞成为肿瘤诊断及治疗的热点，荧光定量RT-PCR作为一种能快速扩增恶性肿瘤细胞特异性基因的技术正日益受到重视 [6] 。
, 百拇医药
本研究结果显示，患者外周血CK-19mRNA的表达阳性率为53.57%(60/112)，且CK-19mRNA水平呈较高表达。不同的消化道恶性肿瘤之间CK-19mRNA的表达阳性率和表达水平差异无显著性(P>0.05)，健康者未见表达。临床无明显转移征象的53例原发消化道恶性肿瘤患者，阳性率52.83%(28/53)，阳性拷贝数较高(5.19±1.11)，说明消化道恶性肿瘤从一开始就表现为全身性疾病，提示这部分病人已有恶性肿瘤细胞血源性微转移的可能;化疗组其阳性率和表达水平显著下降，而当肿瘤发生远处转移， 外周血CK-19mRNA的表达阳性率为90.91%，其表达水平也随之升高，均高于原发肿瘤组和化疗组，说明CK-19mRNA的表达与远处转移关系密切。故在对其进行手术治疗前，建议还应适当加用围术期化疗。
一些研究表明，恶性肿瘤患者免疫功能低下，组织癌细胞易逃避机体的免疫监视，造成了远端转移。在人为因素中，手术创伤也能引起癌细胞一次性侵入外周血循环 [7，8] 。肿瘤的远端转移，常在于外周循环血、淋巴等存在有癌细胞，但循环癌细胞的存在，其受机体免疫及其它因素的调控，不一定代表着有显著性转移灶的发生。从我们的跟踪监测，CK-19mRNA的拷贝数与病情发展有密切关系，能很好的反映治疗效果。通过监测外周血CK-19mRNA表达的变化，可对化疗病人进行疗效监测，调整化疗方案，及时掌握肿瘤的微转移动态。
, 百拇医药
荧光定量RT-PCR技术的高度敏感性、特异性(可以明确肿瘤是恶性的)是肿瘤微转移的早期诊断成为可能，判断疗效、决定治疗手段和预后有着重要的临床价值。
参考文献
1 Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of cirulating cancer cells in the peripheral blood lung cancer patients.Cancer Res，1998，58:2761.
2 Bustin SA，Gyselman VG，Williams NS，et al.Detection of cytokeratins19/20and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients.Br J Cancer，1999，78:1813.
, 百拇医药
3 Aihara T，Noguchi S，Isikawa O，et al.Detection of pancreatic and gasˉtric cancer cells in peripheral and portal blood by amplification of kerˉatin19mRNAwith reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Int J Caner，1997，72:408.
4 Burchill SA，Bradbury MF，Putman K，et al.Detection fo epithelial canˉcercells in peripheral blood by reverse ranscriptase polymerase chain reˉaction.Br J Cancer，1995，71:278.
, http://www.100md.com
5 Mattaoo L A，Moss T J，Emerson S G.Sensitive detection of race circuˉlating reuroblastoma cells by the reverse tanscriptase-ploymerase chain reaction.Cancer Res，1992，52:4701-4711.
6 Martell M，Gomez J，et al.High-throughput real-time reverse tranˉscription-PCR quantitation of hepatitis C virus RNA.J Clin Microbiol，1997，37(2):372.
7 Noh YH，Im G，Ku JH，et al.Detection of tumor cell contamination in peripheral blood by RT-PCR in gastrointestinal cancer patients.J Koˉrean Med Sci，1999，14(6):623-625.
8 Brown DC，Purushotham AD，Birnie GD，et al.Detection of intraoperaˉtive tumor cell dissemination in patients with breast cancer by use of reˉverse transcription and polymerase chain reaction.Surgery，1995，117(1):96-98.
作者单位:214041江苏省无锡市第三人民医院
(编辑晓勇), 百拇医药(姜东林 高玉芬 孙钧铭)
关键词 消化道肿瘤 荧光定量检测 RT-PCR CK-19mRNA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2139-02
Quantitation of CK-19mRNA gene expression in peripheral blood
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in patients with digestive system neoplasms
Jiang Donglin，Gao Yufen，Sun Junming
Wuxi NO.3Hospital，JiangSu214041.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of CK-19mRNA in peripheral blood in patients with digestive system neoplasms.Methods Real-time transcription-PCR assay was used to detect the expression of CK-19mRNA in peripheral blood of112patients with digestive system neoplasms and29healthy individuals.Results The position rate of CK-19mRNA expression in peripheral blood of patients with gastrointestiˉnal neoplasms was53.57%(60/112)，and no expression in29healthy individuals.The copy number of CK-19mRˉNA expression was significantly enhanced in patients with metastasis，and decreased in patientsafter treated(P<0.05).Conclusion The real-time transcription-PCR is a sensitive and specific accurate assay for detecting the exˉpression of CK-19mRNA in patients with digestive system neoplasms.It may be used to predict the early metastasis of neoplasms，which possesses clinical significance in assessing the prognosis and scheme of therapy.
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Key words digestive system neoplasms fluorogenic quantitative detection RT-PCR CK-19mRNA
消化道恶性肿瘤的死亡率居于所有恶性肿瘤的首位，5年生存率较低。其死亡大多由于手术及化疗后的复发和转移，20世纪80年代以来许多学者开展了对肿瘤微转移的研究。RT-PCR已被广应用于检查外周血、淋巴结、骨等微转移病灶，作为对多种恶性肿瘤的研究，显示了较高的敏感性和特异性。CK-19是细胞角蛋白家族的一种，构成细胞骨架的中间微丝，主要分布于上皮组织内，而血液、骨髓等没有该蛋白的存在，当上皮类恶性肿瘤存在或发生转移等情况，其已被认为是检测循环癌细胞的敏感标记物 [1～4] 。我们用荧光定量RT-PCR方法探讨消化道恶性肿瘤患者外周血CK-19mRNA的表达。
1 资料和方法
1.1 研究对象 病理及影像学明确诊断的消化道恶性肿瘤患者112例(食道癌患者33例，胃癌患者54例，直/结肠癌患者25例)，其中，男67例，女45例;年龄34～74岁，平均年龄53.7岁。其中，未经治疗患者53例，经化疗一个疗程以上的患者37例，远端转移患者22例，均为我院住院病人。对照组采用我院健康体检者29例。
, http://www.100md.com
1.2 标本收集 使用负压针筒抽取患者和对照组静脉血，防止表皮细胞掺入，取第二管血，提取单个核细胞RNA，-80℃保存备用。
1.3 主要试剂及仪器 CK-19mRNA核酸扩增荧光检测试剂盒由北京艾森博奥科技发展有限公司提供，应用罗氏荧光定量PCR仪(Lightcycle)检测分析。
1.4 检测方法 严格按操作说明书规范操作，其中荧光定量PCR每次试验设立5个标准品，拷贝数为10 8 、10 7 、10 4 、10 5 、10 6 (由试剂盒标准品10 9 copy/ml梯度稀释而成)，并设立空白、阴性、阳性对照。
1.5 统计学方法 荧光定量PCR检测外周血CK-19mRˉNA拷贝数以其Lg值表示。定量资料采用t检验、定性资料采用X 2 检验。
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2 结果
外周血CK-19mRNA阳性率与拷贝数比较以拷贝数≥1.000E+03copies/ml为阳性，拷贝数<1.000E+03copise/ml为阴性。食道癌组、胃癌组、直/结肠癌组各组之间阳性率及CK-19mRNA拷贝数均无统计学差异(P>0.05)，对照组未见表达，见表1。原发肿瘤组、化疗组和远端转移组之间阳性率、拷贝数差异均有显著性(P<0.05)见表2。
表1 消化道肿瘤患者外周血CK-19mRNA表达
注:P值为食道癌组、胃癌组、直/结肠癌组各组间的比较
表2 原发肿瘤、化疗和远端转移患者外周血CK-19mRNA表达
3 讨论
消化道恶性肿瘤的早期发现、早期诊断是治疗成功的关键，而一般影像学方法发现一个实体瘤的灵敏度较低，常为10 9 的细胞数;寻找高敏感性、特异性的生物学标志物是分子生物学研究早期诊断恶性肿瘤及微转移的主要内容之一。CK-19来自于上皮类肿瘤细胞，其具有组织特异性而无细胞特异性，在正常人造血细胞及外周循环血中无CK-19mRNA的表达，故早期检测出外周血中CK-19mRNA的表达，有助于判断恶性肿瘤细胞异位存在的可能性 [5]。目前早期检出血中循环癌细胞成为肿瘤诊断及治疗的热点，荧光定量RT-PCR作为一种能快速扩增恶性肿瘤细胞特异性基因的技术正日益受到重视 [6] 。
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本研究结果显示，患者外周血CK-19mRNA的表达阳性率为53.57%(60/112)，且CK-19mRNA水平呈较高表达。不同的消化道恶性肿瘤之间CK-19mRNA的表达阳性率和表达水平差异无显著性(P>0.05)，健康者未见表达。临床无明显转移征象的53例原发消化道恶性肿瘤患者，阳性率52.83%(28/53)，阳性拷贝数较高(5.19±1.11)，说明消化道恶性肿瘤从一开始就表现为全身性疾病，提示这部分病人已有恶性肿瘤细胞血源性微转移的可能;化疗组其阳性率和表达水平显著下降，而当肿瘤发生远处转移， 外周血CK-19mRNA的表达阳性率为90.91%，其表达水平也随之升高，均高于原发肿瘤组和化疗组，说明CK-19mRNA的表达与远处转移关系密切。故在对其进行手术治疗前，建议还应适当加用围术期化疗。
一些研究表明，恶性肿瘤患者免疫功能低下，组织癌细胞易逃避机体的免疫监视，造成了远端转移。在人为因素中，手术创伤也能引起癌细胞一次性侵入外周血循环 [7，8] 。肿瘤的远端转移，常在于外周循环血、淋巴等存在有癌细胞，但循环癌细胞的存在，其受机体免疫及其它因素的调控，不一定代表着有显著性转移灶的发生。从我们的跟踪监测，CK-19mRNA的拷贝数与病情发展有密切关系，能很好的反映治疗效果。通过监测外周血CK-19mRNA表达的变化，可对化疗病人进行疗效监测，调整化疗方案，及时掌握肿瘤的微转移动态。
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荧光定量RT-PCR技术的高度敏感性、特异性(可以明确肿瘤是恶性的)是肿瘤微转移的早期诊断成为可能，判断疗效、决定治疗手段和预后有着重要的临床价值。
参考文献
1 Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of cirulating cancer cells in the peripheral blood lung cancer patients.Cancer Res，1998，58:2761.
2 Bustin SA，Gyselman VG，Williams NS，et al.Detection of cytokeratins19/20and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients.Br J Cancer，1999，78:1813.
, 百拇医药
3 Aihara T，Noguchi S，Isikawa O，et al.Detection of pancreatic and gasˉtric cancer cells in peripheral and portal blood by amplification of kerˉatin19mRNAwith reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Int J Caner，1997，72:408.
4 Burchill SA，Bradbury MF，Putman K，et al.Detection fo epithelial canˉcercells in peripheral blood by reverse ranscriptase polymerase chain reˉaction.Br J Cancer，1995，71:278.
, http://www.100md.com
5 Mattaoo L A，Moss T J，Emerson S G.Sensitive detection of race circuˉlating reuroblastoma cells by the reverse tanscriptase-ploymerase chain reaction.Cancer Res，1992，52:4701-4711.
6 Martell M，Gomez J，et al.High-throughput real-time reverse tranˉscription-PCR quantitation of hepatitis C virus RNA.J Clin Microbiol，1997，37(2):372.
7 Noh YH，Im G，Ku JH，et al.Detection of tumor cell contamination in peripheral blood by RT-PCR in gastrointestinal cancer patients.J Koˉrean Med Sci，1999，14(6):623-625.
8 Brown DC，Purushotham AD，Birnie GD，et al.Detection of intraoperaˉtive tumor cell dissemination in patients with breast cancer by use of reˉverse transcription and polymerase chain reaction.Surgery，1995，117(1):96-98.
作者单位:214041江苏省无锡市第三人民医院
(编辑晓勇), 百拇医药(姜东林 高玉芬 孙钧铭)