流式细胞术分析微量全血样品荧光间接标记的研究
【摘要】 目的 应用流式细胞术(FCM)建立用于微量全血样品的间接荧光标记染色方法。方法 通过对6种外周血染色方法的比较实验，筛选出一种用于FCM的最佳染色方法。结果 6种染色方法的FCM二维点图和全血样品阳性细胞结果测定基本一致，而微量全血样品间接荧光染色法操作简单、快速、经济实用。结论 我们建立的荧光染色法，是外周血流式细胞样品测定的理想方法，该方法为FCM在临床检验和基础研究的应用提供了实用的技术方法。
关键词 微量全血 间接荧光染色 流式细胞术
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)03-0200-02
Indirect staining of whole blood samples for flow cytometry
Cao Yunxin，Yang Angang，Zhang Xiaonan
, 百拇医药
Department of Immunology，the Fourth Military Medical University，Xi′an710032.
【Abstract】 Objective To establish a newmethod for indirect fluorescent staining and labeling of whole blood samples of small amount for flow cytometry(FCM).Methods An experimental comparison was made between/among6methods for fluorescent staining whole blood samples of small amount，from which，the best staining method for FCM analysis was selected.Results No much difference was discoveredbetween/among FCM2-dimensional scatter diaˉgrams and results of the assessmentof the positive cells of the samples by the6methods.Conclusion The method thus established of indirect fluorescent staining of whole blood samples is optimal for the assessment of the samples by FCM.It can be of great help and use in the application of FCM in clinical examination and basic medical research.
, 百拇医药
Key words microwhole blood indirect fluorescent staining flow cytometry
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)以其对荧光染色的单细胞悬液进行快速、准确的测量和分析而广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学等领域，特别是多种识别白细胞抗原的单克隆抗体的出现，使FCM在外周血白细胞分析的基础上研究和临床诊断中得到了广泛的应用 [1] 。因此寻找和探索与FCM相适应的染色外周血白细胞的经济、快速、简便的免疫荧光染色方法尤为重要。目前，用于FCM外周血白细胞的免疫荧光染色方法主要有3种 [2] :(1)用荧光单克隆抗体染外周血后溶解红细胞;(2)先溶解红细胞后再对白细胞进行染色;(3)用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，再进行荧光染色。其中每种方法根据荧光标记抗体的情况不同又分为直接荧光染色法和间接荧光染色法 [3] ，然而直接荧光标记法虽然简单快速，引入的非特异性结合干扰少，但是需要有相对应的荧光直接标记抗体(或抗原)，不仅价格较贵，而且在抗体的来源和使用上也受到极大限制。本文通过对这些方法的比较，旨在建立一种用于FCM的最佳间接荧光标记方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 EPICS Elite ESP型流式细胞仪，Q-PREP免疫学样品制备仪，抗CD3mAb-FITC、CD4mAb-FITC、CD8mAb-FITC以及MsIgG1-FITC，均为美国Coulter公司产品;CD3、CD4和CD8类抗原的间标单抗，淋巴细胞分离液，均由本校免疫教研室提供;外周血白细胞样品制备试剂 [4] ，由本室研制。红细胞溶解液(10mmol/L KHCO 3 ，164.5mmol/L NH 4 Cl，0.01mmol/L EDTA-Na 2 )，用国产分析纯试剂配制。
1.2 方法
1.2.1 样品染色后溶解红细胞 (1)直接荧光标记法(方法1):取肝素或EDTA抗凝外周血每份100μl，置5ml专用塑料试管中，加入15μl FITC标记的mAb，阴性对照加MsIgG1-FITC，室温下避光染色15～30min后，上Q-PREP型免疫学样品制备仪，处理血样标本，流式细胞仪分析结果。(2)间接光标记法(方法2):取肝素或EDTA抗凝外周血100μl，置5ml专用塑料试管中，加入1∶20稀释的CDX单抗50μl，阴性对照加SEB(肠毒素单抗)，室温下反应30min，上Q-PREP型免疫学样品制备仪，处理血样标本，离心后弃上清，PBS洗2次后加入FITC标记的兔抗鼠IgG150μl，室温下反应30min，再加入500μl的PBS，经流式细胞仪分析。
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1.2.2 溶红细胞后对样品染色 取0.5～1ml肝素或EDTA抗凝外周血，加入15ml红细胞溶解液，混合3～5min，离心800～1000rpm×5min，并用PBS洗2次然后进行白细胞计数，用PBS调整细胞浓度到1×10 9 个细胞/L，分别取100μl单细胞悬液，置5ml专用试管中，用直接荧光标记法(方法3:荧光单抗染色15min●洗涤2次●0.5%甲醛固定)和间接荧光标记法(方法4:一抗●洗涤2次●兔抗鼠荧光二抗染色●0.5%甲醛固定)，阴性对照分别用MsIgG1-FITC染色(直接法)和无关单抗SEB(间接法)染色，方法同上。
1.2.3 分离出单个核细胞后荧光染色 取抗凝外周血用等量Hank’s或RPMI1640稀释混匀，在玻璃离心管中加入适量的淋巴细胞分离液，然后将稀释好的外周血用滴管沿管壁缓慢加入分离液液面，水平离心2000rpm×20min，收集白色云雾状层的单个核细胞，用PBS洗2次，分别取细胞浓度为1×10 9 细胞/L的细胞悬液100μl，用直接荧光标记法(方法5)和间接荧光标记法(方法6)进行染色。阴性对照操作方法同上。
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2 结果
2.1 各种方法的二维点图比较 抗凝全血样品分别用6种
方法染色后的FCM分析结果与图1-A、B、C、D的细胞分 布基本相同，而图E和F淋巴细胞位置与图1—A、B、C、D的淋巴细胞群也相同。可见6种染色方法不会影响细胞在二维点图的分布位置，有利于FCM分析相应的细胞群(图中Ⅰ为淋巴细胞群，Ⅱ为单核巨噬细胞群，Ⅲ为中性粒细胞群，Ⅳ为红细胞碎片)。 图1 六种方法染色的FCM分析二维点图A:Method1 B:Method2 C:Method3 D:Method4 E:Method5 F:Method6
2.2 6种方法对样品的测定结果 用6种方法对外周血的CD3、CD4、CD8染色后，其测定结果表明:6种方法所得CD3 + ，CD4 + ，CD8 + 细胞百分率基本一致(P>0.05)。
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表1 6种方法检测外周血T细胞阳性亚群比较
3 讨论
流式细胞仪在测定样品时，首先是依据前向散射光(FS)和侧向散射光(SS) [5] 所得到的二维点图(图1示)分析所需的细胞群，从我们的实验结果显示:6种方法的FCM二维点图基本相同，它们均能得到准确的分析结果(表1示)。在6种染色方法中，方法1是目前FCM直接染色法最常用的方法，方法3和方法4由于试剂溶血程度难以掌握，而且细胞物质活性容易受到破坏，已很少使用。方法5和方法6是目前临床和科研样品采用的常规方法 [6] ，而方法2(外周血样品FCM间接标记方法)是我们新建的FCM制样方 法，它与其它方法相比具有以下优点:(1)样品用量少:每份只需80～100μl全血，仅是其它方法的8%～10%，能较好地解决样品来源不足的问题，特别是某些动物样品采血量小，如果进行其它指标测试，则用其它染色方法很难同时达到目的。(2)自动化程度高:抗凝血用一抗染色后，用我们自制的全血白细胞样品制备试剂，在免疫学样品制备仪上，可自动进行红细胞溶解，靶细胞固定，然后进行荧光二抗染色。免去了其它方法红细胞溶解带来的不良影响，免去了分离法，细胞分离时间长，用血量大，操作繁琐等实验步骤。(3)经济、快速、准确、效率高，结果稳定。我们利用FCM建立的外周血白细胞间标方法，只需90min即可完成样品的染色和FCM结果的分析，在临床检验和基础研究的应用中具有较强的实用价值。
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参考文献
1 左连富.流式细胞术与生物医学.沈阳:辽宁科学技术出版社，1996，337-353.
2 蔡文琴，王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都:四川科学技术出版社，1994，207-210.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京:北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1992，400-402.
4 曹云新，刘智广.流式细胞仪全血白细胞样品制备试剂的研究.细胞与分子免疫学，1999，15(2):120.
5 宋根平，李素文.流式细胞术的原理和应用.北京:北京师范大学出版社，1992，10-16.
6 Iwao Nishiya.(eds)Flow Cytometry and Image Analysis For Clinical Applications，Excerpt Medica.Netherlands，1991，23-28.
作者单位:710032西安第四军医大学免疫教研室(生化教研室)
(收稿日期:2003-12-11)
(编辑小 川), http://www.100md.com(曹云新 杨安钢 张晓楠)
关键词 微量全血 间接荧光染色 流式细胞术
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)03-0200-02
Indirect staining of whole blood samples for flow cytometry
Cao Yunxin，Yang Angang，Zhang Xiaonan
, 百拇医药
Department of Immunology，the Fourth Military Medical University，Xi′an710032.
【Abstract】 Objective To establish a newmethod for indirect fluorescent staining and labeling of whole blood samples of small amount for flow cytometry(FCM).Methods An experimental comparison was made between/among6methods for fluorescent staining whole blood samples of small amount，from which，the best staining method for FCM analysis was selected.Results No much difference was discoveredbetween/among FCM2-dimensional scatter diaˉgrams and results of the assessmentof the positive cells of the samples by the6methods.Conclusion The method thus established of indirect fluorescent staining of whole blood samples is optimal for the assessment of the samples by FCM.It can be of great help and use in the application of FCM in clinical examination and basic medical research.
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Key words microwhole blood indirect fluorescent staining flow cytometry
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)以其对荧光染色的单细胞悬液进行快速、准确的测量和分析而广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学等领域，特别是多种识别白细胞抗原的单克隆抗体的出现，使FCM在外周血白细胞分析的基础上研究和临床诊断中得到了广泛的应用 [1] 。因此寻找和探索与FCM相适应的染色外周血白细胞的经济、快速、简便的免疫荧光染色方法尤为重要。目前，用于FCM外周血白细胞的免疫荧光染色方法主要有3种 [2] :(1)用荧光单克隆抗体染外周血后溶解红细胞;(2)先溶解红细胞后再对白细胞进行染色;(3)用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，再进行荧光染色。其中每种方法根据荧光标记抗体的情况不同又分为直接荧光染色法和间接荧光染色法 [3] ，然而直接荧光标记法虽然简单快速，引入的非特异性结合干扰少，但是需要有相对应的荧光直接标记抗体(或抗原)，不仅价格较贵，而且在抗体的来源和使用上也受到极大限制。本文通过对这些方法的比较，旨在建立一种用于FCM的最佳间接荧光标记方法。
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1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 EPICS Elite ESP型流式细胞仪，Q-PREP免疫学样品制备仪，抗CD3mAb-FITC、CD4mAb-FITC、CD8mAb-FITC以及MsIgG1-FITC，均为美国Coulter公司产品;CD3、CD4和CD8类抗原的间标单抗，淋巴细胞分离液，均由本校免疫教研室提供;外周血白细胞样品制备试剂 [4] ，由本室研制。红细胞溶解液(10mmol/L KHCO 3 ，164.5mmol/L NH 4 Cl，0.01mmol/L EDTA-Na 2 )，用国产分析纯试剂配制。
1.2 方法
1.2.1 样品染色后溶解红细胞 (1)直接荧光标记法(方法1):取肝素或EDTA抗凝外周血每份100μl，置5ml专用塑料试管中，加入15μl FITC标记的mAb，阴性对照加MsIgG1-FITC，室温下避光染色15～30min后，上Q-PREP型免疫学样品制备仪，处理血样标本，流式细胞仪分析结果。(2)间接光标记法(方法2):取肝素或EDTA抗凝外周血100μl，置5ml专用塑料试管中，加入1∶20稀释的CDX单抗50μl，阴性对照加SEB(肠毒素单抗)，室温下反应30min，上Q-PREP型免疫学样品制备仪，处理血样标本，离心后弃上清，PBS洗2次后加入FITC标记的兔抗鼠IgG150μl，室温下反应30min，再加入500μl的PBS，经流式细胞仪分析。
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1.2.2 溶红细胞后对样品染色 取0.5～1ml肝素或EDTA抗凝外周血，加入15ml红细胞溶解液，混合3～5min，离心800～1000rpm×5min，并用PBS洗2次然后进行白细胞计数，用PBS调整细胞浓度到1×10 9 个细胞/L，分别取100μl单细胞悬液，置5ml专用试管中，用直接荧光标记法(方法3:荧光单抗染色15min●洗涤2次●0.5%甲醛固定)和间接荧光标记法(方法4:一抗●洗涤2次●兔抗鼠荧光二抗染色●0.5%甲醛固定)，阴性对照分别用MsIgG1-FITC染色(直接法)和无关单抗SEB(间接法)染色，方法同上。
1.2.3 分离出单个核细胞后荧光染色 取抗凝外周血用等量Hank’s或RPMI1640稀释混匀，在玻璃离心管中加入适量的淋巴细胞分离液，然后将稀释好的外周血用滴管沿管壁缓慢加入分离液液面，水平离心2000rpm×20min，收集白色云雾状层的单个核细胞，用PBS洗2次，分别取细胞浓度为1×10 9 细胞/L的细胞悬液100μl，用直接荧光标记法(方法5)和间接荧光标记法(方法6)进行染色。阴性对照操作方法同上。
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2 结果
2.1 各种方法的二维点图比较 抗凝全血样品分别用6种
方法染色后的FCM分析结果与图1-A、B、C、D的细胞分 布基本相同，而图E和F淋巴细胞位置与图1—A、B、C、D的淋巴细胞群也相同。可见6种染色方法不会影响细胞在二维点图的分布位置，有利于FCM分析相应的细胞群(图中Ⅰ为淋巴细胞群，Ⅱ为单核巨噬细胞群，Ⅲ为中性粒细胞群，Ⅳ为红细胞碎片)。 图1 六种方法染色的FCM分析二维点图A:Method1 B:Method2 C:Method3 D:Method4 E:Method5 F:Method6
2.2 6种方法对样品的测定结果 用6种方法对外周血的CD3、CD4、CD8染色后，其测定结果表明:6种方法所得CD3 + ，CD4 + ，CD8 + 细胞百分率基本一致(P>0.05)。
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表1 6种方法检测外周血T细胞阳性亚群比较
3 讨论
流式细胞仪在测定样品时，首先是依据前向散射光(FS)和侧向散射光(SS) [5] 所得到的二维点图(图1示)分析所需的细胞群，从我们的实验结果显示:6种方法的FCM二维点图基本相同，它们均能得到准确的分析结果(表1示)。在6种染色方法中，方法1是目前FCM直接染色法最常用的方法，方法3和方法4由于试剂溶血程度难以掌握，而且细胞物质活性容易受到破坏，已很少使用。方法5和方法6是目前临床和科研样品采用的常规方法 [6] ，而方法2(外周血样品FCM间接标记方法)是我们新建的FCM制样方 法，它与其它方法相比具有以下优点:(1)样品用量少:每份只需80～100μl全血，仅是其它方法的8%～10%，能较好地解决样品来源不足的问题，特别是某些动物样品采血量小，如果进行其它指标测试，则用其它染色方法很难同时达到目的。(2)自动化程度高:抗凝血用一抗染色后，用我们自制的全血白细胞样品制备试剂，在免疫学样品制备仪上，可自动进行红细胞溶解，靶细胞固定，然后进行荧光二抗染色。免去了其它方法红细胞溶解带来的不良影响，免去了分离法，细胞分离时间长，用血量大，操作繁琐等实验步骤。(3)经济、快速、准确、效率高，结果稳定。我们利用FCM建立的外周血白细胞间标方法，只需90min即可完成样品的染色和FCM结果的分析，在临床检验和基础研究的应用中具有较强的实用价值。
, http://www.100md.com
参考文献
1 左连富.流式细胞术与生物医学.沈阳:辽宁科学技术出版社，1996，337-353.
2 蔡文琴，王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都:四川科学技术出版社，1994，207-210.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京:北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1992，400-402.
4 曹云新，刘智广.流式细胞仪全血白细胞样品制备试剂的研究.细胞与分子免疫学，1999，15(2):120.
5 宋根平，李素文.流式细胞术的原理和应用.北京:北京师范大学出版社，1992，10-16.
6 Iwao Nishiya.(eds)Flow Cytometry and Image Analysis For Clinical Applications，Excerpt Medica.Netherlands，1991，23-28.
作者单位:710032西安第四军医大学免疫教研室(生化教研室)
(收稿日期:2003-12-11)
(编辑小 川), http://www.100md.com(曹云新 杨安钢 张晓楠)