线粒体DNA突变与肿瘤的关系(基金项目)
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中华中西医杂志 2003年12月 第4卷 第24期
基金项目:国家重大基础研究规划项目“973”计划(编号:G1998051201);
国家自然科学基金项目(No.30371593);
广东省科技计划项目(No.2003A3080202)。
【摘要】 线粒体DNA(mitochondrial DNA，mt DNA)是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质，与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。mtDNA自身的结构和功能特点决定了它是致癌物作用的重要靶点，易受致癌因素的损伤而发生突变。mtDNA的突变可削弱正常的呼吸功能，释放高水平的活性氧(ROS)，进而增加肿瘤发生的危险性，所以mtDNA被认为与肿瘤发生有密切关系。近年来，这方面的研究越来越多，本文现就mtDNA突变与消化系统肿瘤、妇科肿瘤、头颈部肿瘤、泌尿系统肿瘤等实体瘤以及血液系统恶性肿瘤之间的关系作一简单的综述。
, 百拇医药 关键词 线粒体DNA 突变 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3261-05
Relationship between mitochondrial DNA mutations and tumors
Wu Jingjing，Shao Jianyong，Wu Qiuliang
Department of Pathology，Cancer Center，Sun Yatsen University， No.651of Dongfeng East Road，Guangzhou，Guangdong510060.
【Abstract】 Mitochondrial DNA(mt DNA)is the only inheritant substance except for the nuclear DNA in a euˉkaryon cell，which is related to the oxidative phosphorylation of a cell.Mitochondrial DNA is the important target of carcinogens and is vulnerable because of its structure and function.The mutation of mtDNA could reduce the nomal respitation and release large quantities of ROS，whichincrease the danger of cancer happening.So，mtDNA has been thought to be involved in carcinogenesis and recently more and more studies in this aspect have comeout.In this paˉper，we review the researches for relationship among mtDNA mutation and tumors in digestion system，woman system，head and neck，urinary systemand blood system.
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Key words mitochondrial DNA mutation carcinoma
肿瘤的发生与多种因素有关。人们在研究肿瘤发病的过程中，不仅注意到核基因的变化，而且也注意到了核外遗传物质-线粒体DNA(mitochondrial DNA，mt DNA)的变化。在上世纪70年代以前，有关线粒体与肿瘤发病关系的研究主要集中在肿瘤细胞线粒体的形态和能量代谢等方面。80年代以后，由于mtDNA的发现，人们迅速把目光转向mtDNA 突变与肿瘤关系的研究上，有学者发现，在一些人类肿瘤和实验性肿瘤的癌细胞中，mtDNA可发生特异性改变。近年来，这方面的大量研究进一步表明了线粒体DNA突变和人类肿瘤的形成与发展之间密切相关。本文现将有关研究作一简单的综述。
1 线粒体DNA的结构特点及功能
线粒体DNA是真核细胞中唯一存在的独立于细胞核DNA之外的遗传物质，其结构非常简洁。mtDNA呈闭环双链，在只有16569bp长的基因组内包含了2种rRNA，22种tRNA和13种蛋白多肽的编码基因。这些多肽的分布为:复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶，NADH dehydogenase-uˉbiquinene oxidoreductase，ND)中7个亚基(ND 1 ，ND 2 ，ND 3 ，ND 4 ，ND 4L ，ND 5 ，ND 6 );复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原Tel/Fax86-20-87343391 酶，ubiquinone-cytodhrome c oxidoreductase)中1个亚基(Cytb);复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶，cytochrome c oxidase，CO)中3个亚基(COⅠ，COⅡ，COⅢ)和复合体V(ATP合酶，ATPsynthase)中Fo的2个亚基(ATPase6和ATPase8)。所有这13种多肽均是呼吸链的组成成分，位于线粒体内膜。在mtDNA中除D环(D-Loop)区外，相邻的基因间极少有非编码基因。因此常把D环区第16024至575位核苷酸之间的1120bp片段称为控制区(control region)，它占全部mtDNA的6%左右，负责整个分子复制和转录的调控。mtDNA可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译，具有非常活跃的自我复制能力。与核DNA不同的是，mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成表达蛋白质的变化。
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线粒体DNA与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。人体内90%以上的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体基因编码的蛋白均参与线粒体的氧化过程。在此过程中可产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，当电子传递链功能障碍或机体抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内的自由基不能被有效清除而累积，可使线粒体发生氧化性损伤，从而导致mtDNA的突变。细胞中mtDNA突变的种类可分为异质性突变(heterogenous mutation)和同质性突变(homogenous mutation)，前者指正常的和突变的mtDNA共存于同一细胞;后者指细胞内存在同一种结构的mtDNA。从mtDNA突变的类型考虑，主要有大片段缺失、错义突变，移码突变以及小片段的缺失和插入等。由于mtDNA在体内分布非常广泛，故它的损害可影响到全身多个器官、系统，所以有关它与疾病的关系受到了学者们的广泛关注。目前，越来越多的研究发现:肿瘤的发生发展过程是与线粒体DNA的突变联系在一起的。
2 不同肿瘤组织中线粒体DNA的突变
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2.1 消化系统肿瘤mtDNA突变 有关消化系统肿瘤mtDNA突变的研究已成为热点。有许多文章报道在结肠癌组织中mtDNA点突变的发生比较普遍，而大片段的缺失较少见。Polyak [1]等于1998年首次通过对10例结肠癌细胞系和原发性肿瘤中mtDNA全基因组测序，发现了7例(70%)伴有mtDNA体细胞的同质性突变。在12种体细胞的突变形式中，有11/12是单个碱基的替换，1/12是插入突变，并且发现mtDNA的突变比核DNA突变至少多10倍。在Habano [2] 等的一项研究中发现结肠癌组织中有7/45(16%)存在突变，包括3例编码区ND1和ND5的移码突变，2例错义突变，1例15bp的缺失，没有发现大片段的缺失。Hibi [3] 等亦对77例原发性结、直肠癌作了D-Loop区域的测序，确定7/77(9%)有mtDNA体细胞突变，其中1例(14%)可在血清中检测到同样的突变。另外，线粒体HV区(hypervariable region)也存在体细胞突变，主要集中在HV 1 和HV 2 区。Alonso [4] 等分析了13例结肠癌组织的HV区，结果有2例发生HV 1 区A:T/G:C的置换，1例HV 2 区发生C:G的缺失。在对胃癌组织的研究中，相关结果显示胃癌可能更倾向于发生mtDNA大片段的缺失，这与结肠癌多倾向于点突变的发生有所不同。Maximo [5] 等发现在32例原发胃癌病例中有17例(53%)存在mtDNA4977bp大片段的缺失，突变大多发生于D-Loop区和ND 1 、ND 2 区。Burˉgart [6] 等对32例胃腺癌mtDNA也进行了突变检测，发现4/32(12.5%)例D-Loop区存在50bp的缺失，并且都是在胃贲门附近癌组织中检测到的，胃远端未检测到。Habano [7] 还研究了胃癌患者的8个编码基因和D环非编码的(C)n序列，发现有ND(ND 1 、ND 5 )基因的突变。最近，Hiyama [8]等又检测了56例胃癌患者肿瘤组织中的mtDNA，结果发现有9例(16%)存在mtDNA的突变，而且在癌组织中mtDNA的突变率明显高于非癌组织(12%vs1%)，差异有显著性(P=0.008)。由此可见，胃肠道肿瘤组织中mtDNA的突变情况是不一致的。同时，值得注意的是，研究中发现D-Loop区是mtDNA复制转录的调控区，几乎所有与mtDNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区。所以，许多报道提示D-Loop区(约1.1kb)可能是mtDNA突变的热点区域。肝癌组织中mtDNA的突变也已被检测到，并且在患者血浆中可间接反映出这种改变。Nishikawa [9] 等对59例肝癌肿瘤组织及相应的癌旁组织中mtDNA进行检测，结果发现在D-Loop区的100～600bp的碱基之间突变频率最高，所有突变均为260bp处G→A，489bp处T→C的单碱基替换，以及311→312bp之间的C插入。并且发现无论是肝癌组织还是癌旁组织都存在mtDNA突变，且突变程度不同，突变程度越高，恶性度越高。Kubo [10] 等检测了肝细胞癌患者肿瘤组织和肝炎病毒C感染的患者肝组织中mtDNA的突变情况，发现在48例受检者中有33例存在3处或多处基因突变，且这33例中有10/33为肝细胞癌患者，而另外15例非癌患者肝组织中只有2处或更少的突变，二者间差 异有显著性(P=0.0201)。另外，Nomoto [11] 等检测了19例肝细胞癌患者的肿瘤组织，发现有13/19(68%)例存在mtDˉNA D-Loop区的突变。在13例突变的mtDNA中，有8个均在高变区发生了单个碱基的缺失或插入，而且在10例取血的病人中有8/10(80%)亦在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA突变。Okochi [12] 等对50例肝细胞癌病人进行了检测，结果在肿瘤组织中发现的100处基因变异中有15处是以前未报道过的新类型变异，有17/50例(34%)发现了D-Loop区的突变，并且在随后的匹配血浆检测中，有5/15例(33%)在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA突变。由此可考虑将mtDNA突变作为一种肝细胞肿瘤标志物，通过检测血浆中mtDNA的改变情况来帮助监测肿瘤，这对于肿瘤的早期诊断和基因治疗有重要意义。
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2.2 乳腺癌mtDNA突变 在乳腺癌患者的肿瘤组织和体液(如血浆)中已检测到有mtDNA突变，主要位于线粒体D环，突变的热点在高变区(HVR1，HVR2)，且HVR2比HVR1更易突变。Bendall [13] 等研究了乳腺癌组织中的mtDNA，发现16189位点T-C的置换会导致PolyC的长度不稳定，进一步的研究得出，尽管在这些细胞当中存在不同长度PolyC，但T-C的突变却是一致的(同质性)。Parrella [14] 等在对18份浸润性导管癌组织作了mtDNA全基因组测序后，发现有12个mtDNA突变存在于11例肿瘤中，突变率为61%(11/18)，其中5例突变(42%)是D-Loop区的碱基插入或缺失，其余7例(58%)是在ND 1 、ND 4 、ND 5 和Cytb编码区的单碱基替换。另有研究者 [15] 在17名乳腺癌患者中发现了不同程度的mtDNA点突变和缺失所引起的ComIV的异常变化，其中3名患者有4977bp处的缺失。同时有相关实验发现，60%的乳腺癌细胞中有非遗传性的点突变或长片段的不稳定。Tan [16] 等亦在乳腺癌组织中检测到mtDNA的体细胞突变。最近，勒斌 [17] 等采用变性高效液相色谱检测了10例乳腺癌患者的血浆mtDNA，结果发现有4/10例存在D环HVR 2 区的突变。所以，乳腺癌的发生发展与mtDNA的突变密切相关。
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2.3 妇科肿瘤mtDNA突变 妇科肿瘤组织中mtDNA基因结构的改变为多基因、多位点的突变，常涉及到2个以上的基因，突变的热点区域在cytb基因区。Liu [18] 等曾对10组卵巢癌与对照标本的全序列进行分析，结果得到60%的肿瘤细胞有mtDNA体细胞突变，多为T→C或G→A的点突变，且分别位于16S、12SrRNA、D环区及cytb基因区域。最近，Liu [19] 等又检测了子宫内膜癌组织及正常对照组织中的mtDNA D环区和12S、16SrRNA的基因编码区，结果有28/50例(56%)发现有一处或多处的体细胞突变，这些mtDNA的改变包括片段缺失、点突变及微卫星的不稳定，主要发生在D环的HV1、HV2区和12SrRNA的编码区。另外，李红霞 [20] 等检测了32例妇科恶性肿瘤患者(包括宫颈癌5例、子宫内膜癌10例、卵巢癌17例)、8例妇科良性肿瘤患者(包括卵巢上皮性肿瘤4例、子宫肌瘤4例)的肿瘤组织和癌旁正常组织中mtDNA基因突变的情况，结果显示恶性组的mtDNA突变率为68.8%，良性组的基因突变率为2/8，两组相比较差异有显著性(P<0.05)。以上资料提示，mtDNA突变可能是妇科恶性肿瘤形成的一个早期现象，并持续存在于癌症演变的全过程。
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2.4 头颈部肿瘤mtDNA突变 在头颈部肿瘤的研究中，mtDNA突变主要集中在D-Loop控制区，其中位于D环的D310(homopolymeric C stretch)变异是主要的突变事件，已有一些文献对此做了报道。Parrella [21] 等对56例肿瘤患者的瘤组织进行了mtDNA的D310变异检测，结果发现有13/56例(23%)存在该区突变，其中颈部肿瘤的突变率最高，非瘤组织中未发现。Tong [22] 等为了解甲状腺肿瘤组织中mtDNA D环的遗传学变异情况，选择了72例甲状腺癌患者(包括35例乳头状癌，18例髓样癌，9例间变性癌，9例滤泡性癌和1例岛状癌)，结果分别在2/35(5.7%)、1/18(5.6%)、1/9(11.1%)、1/9(11.1%)例癌组织中观察到mtDNA的D310变异。整体而言，甲状腺癌组织中该种突变的频率为5/72(6.9%)。由此表明，在甲状腺癌的不同组织类型中均存在mtDNA D环的D310变异，但其突变率较低(低于报道的上皮来源肿瘤的突变率)，显示出甲状腺癌组织中mtDNA的突变与组织学分型之间无明显关系。另外，Maximo [23] 等研究了79例甲状腺良恶性肿瘤及周围正常组织，结果在34例肿瘤组织中检测到57处点突变，在59例患者中发现了253处连续变异，变异主要位于mtDNA D-Loop区，而且癌组织中还存在ComplexⅠ和ComplexⅣ基因区的体细胞突变。他们又发现ATPase-6编码基因的种系多肽性与mtDˉNA的普通缺失(common deletion，CD)有关。蔡青松 [24] 等利用PCR-SSCP技术检测mtDNA复制控制区中164bp的片段，在22例喉癌患者的血细胞中发现3例同质性突变，5例异质性突变，而在12例正常人中未发现带型改变。这个研究结果提示血细胞线粒体DNA D-Loop区的变异，可能与喉癌发生有一定的联系。由此可以看出，在头颈部肿瘤组织中存在mtDNA控制区的高频率变异，这种变异可能是头颈部肿瘤发生机制中的一个重要的核外分子遗传学的改变。
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2.5 泌尿系统肿瘤mtDNA突变 已有大量文献证实mtDNA突变与肿瘤的发生发展有密切联系，泌尿系肿瘤也不例外，而且其突变可在患者的尿沉积物中检测到。Penˉta [25] 等在13例诊断为肾细胞癌的患者中发现有8例存在编码ND 3 亚单位的mtDNA的同质性缺失，并伴其mRNA表达的降低，这在其它实体癌中未发现。又有研究 [26] 报道了在肾细胞癌组织中存在mtDNA的变异，在检测到的94处变异中有38个位于D-Loop区，40个位于多肽编码区，12个位于rRNA编码区以及4个位于tDNA编码区。这些改变提示了肾癌的发生与mtDNA突变有一定的关系。另外，Parrella [21] 等对膀胱癌患者进行了mtDNA分析，发现在癌组织中存在线粒体基因的高频变异，并且在4例膀胱癌患者的尿沉积物中检测到了相同的变异情况。Fliss和同事 [27] 也做过相关报道，他们对肿瘤组织细胞及同一患者体液中的细胞进行了80%的mtDNA序列测定和nDNA检测，结果膀胱癌的突变率为64%，突变主要集中在D环和ND4基因。同时还比较发现检测线粒体DNA突变比检测核DNA突变要简便可靠，能提高诊断的敏感性，可以考虑作为肿瘤诊断的分子标志物。
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2.6 其他肿瘤中mtDNA突变 除了对上述各系统肿瘤的研究外，有学者探讨了mtDNA突变在人肺癌发生中的作用。金雄杰 [28] 等提取58例肺癌组织及其相应病灶的远端非癌肺组织和外周血淋巴细胞的总DNA(包括核DNA和mtDNA)，经PCR扩增后测序，结果在36例(62.1%)肺癌组 织中发现66个突变，其中点突变58个，插入突变4个，缺失突变4个。这些突变分散地分布于mtDNA，以D-Loop区突变最多，在多肽编码区没有明显地热点突变，在8例非癌肺组织中亦发现了与相应肿瘤相同地突变。这个研究提示肺癌组织中mtDNA突变可能是随机发生的，且大部分突变对肿瘤的发生可能没有影响，但其有望成为一种肿瘤诊断的分子标记。Kirches [29] 等研究了脑胶质瘤组织，发现存在高频率的线粒体DNA突变，突变的主要形式为碱基替换及重复序列区域的插入和缺失。另外，mtDNA突变还发现在80%的胰腺癌中，以及前列腺癌和皮肤癌中。
以上所说的均为实体性肿瘤，在血液系统肿瘤中也发现了很多异常。Ivanova [30] 等通过比较人白血病细胞和正常人体细胞mtDNA核苷酸序列，发现人白血病细胞mtDNA非编码区存在明显差异，而编码区核苷酸序列无变化。Clayton [31] 等人在白血病病人的白细胞mtDNA中发现了一些特殊结构，如由两个闭合环状mtDNA分子组成的环状二聚体，这种结构被认为在白血病的发病中起一定的作用。通过大量的研究分析，我们可以看出，不同部位肿瘤中mtDNA的突变不很一致，整体分析它们之间的关系还不太成熟。胃癌组织细胞中mtDNA倾向于较大片段的缺失，肠癌则多为点突变，对于乳腺癌、肝癌以及肾癌等比较有意义的是它们片段的缺失。另外，由于D-Loop环区在mtDNA的转录和复制中起重要作用，已有许多相关报道表明mtDNA的突变主要发生于此区域内，并将D-Loop区认为是mtDNA突变的热点区域。但亦有研究发现在非肿瘤性疾病和正常组织中，该区域也是mtDNA突变的热点区域，说明肿瘤中D-Loop区的高突变率可能并不是肿瘤特异性的变化。所以对于这方面的问题还有待进一步研究。但可以肯定的是，肿瘤的生物学特性不仅取决于核内遗传物质，而且与核外的mtDNA改变有着一定联系。
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3 线粒体DNA突变与肿瘤关系的讨论
mtDNA作为核外重要遗传物质，其结构和功能特点决定了它是致癌物作用的重要靶点，易受致癌因素的损伤而发生突变。原因主要由于以下几点:(1)mtDNA几乎不受DNA结合蛋白(组蛋白)的保护，即是裸露的，所以致癌物容易与之结合。(2)mtDNA的损伤修复机制相对缺乏，损伤后的完全修复率低于核DNA。(3)线粒体内的高氧含量及高脂含量:由于线粒体内氧浓度很高，易产生氧自由基及过氧化氢等物质，且不能有效清除，因而线粒体易受氧化物损伤，可造成核酸片段丢失，碱基修饰及插入突变等。线粒体内的高脂含量使具有嗜脂性的致癌物能优先在mtDNA上集聚。众多研究结果表明，各种化学致癌物与mtDNA的结合远比核DNA有效，结合率更高。Wunderlich [32] 等用14C标记的N-甲基亚硝基脲体外处理培养细胞，结果发现标记致癌剂优先与mtDNA结合，且与mtDNA的结合量是核DNA的5倍。Niranjan [33] 等亦发现，生物致癌剂黄曲霉素B1与肝细胞mtDNA的结合量高出核DNA的3～4倍，且这些结合物不易被清除，可在线粒体内较长时间存在。(4)mtDNA在整个细胞周期中处于不断的合成状态，易受外界因素的干扰，稳定性差。(5)mtDNA的D环区是单链启动复制，易使tRNA基因部位出现发夹样结构，从而增加了mtDˉNA多聚酶r的错配机会，容易导致mtDNA基因突变 [34] 。
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由此可见，mtDNA是较易受攻击的靶分子，常发生损伤与突变。肿瘤是多因素多步骤发展的产物，各种致癌剂作用于mtDNA，使其发生与肿瘤相关的遗传结构改变，这种改变的累积增加了肿瘤发生的危险性。已知mtDNA与细胞氧化磷酸化功能密切相关，线粒体是细胞能量生成和储存的重要场所，在该处经氧化磷酸化的方式将能量转化为ATP高能键，所以mtDNA的缺失和变异可能损害氧的利用，导致细胞的氧化和减少代谢能量的产生。已有实验证实，mtDNA的突变可削弱正常呼吸功能，释放高水平的ROS(活性氧族)，而ROS的增多又会加剧突变效应，二者间形成恶性循环，从而加剧ROS超氧化物和过氧化物的氧化损伤作用，影响线粒体基因组的生物发生并激活核基因组，促进了肿瘤的发生与发展 [35] 。
另外，mtDNA还可能通过其分子及片段在核基因组中的整合来实现诱发细胞癌变。mtDNA在各种损伤因子作用下可产生大量游离于线粒体外的mtDNA片段，它们在一定条件下可穿过核孔，随机整合到核基因组中。已有发现，在一定条件下，核DNA序列以及mtDNA序列可以在胞内游走，而且Liang [36] 等在早期神经胶质瘤细胞的核DNA中发现了mtDNA的整合。这种整合可能会激活原癌基因或抑制抑癌基因，使细胞增殖分化失控，导致癌变。还有一种假说认为损伤的mtDNA具有复制优势并在子代中累积，逐渐形成突变细胞克隆，进而可导致肿瘤的发生 [1] 。
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所以，探讨mtDNA突变与肿瘤的关系，对阐明细胞的癌变机制具有重要的意义。通过以上的分析我们可以认为，检测mtDNA突变对于研究肿瘤的发生发展有重大意义。而且mtDNA在细胞中的拷贝数多，体液中mtDNA的改变又可以间接反映肿瘤DNA的变异情况，所以mtDNA有可能是一种比核DNA更好的研究肿瘤发生发展的分子标记。
4 展望
综上所述，mtDNA参与肿瘤的发生是毫无疑问的。但有关mtDNA与肿瘤关系的研究才刚刚起步，在肿瘤发生发展过程中mtDNA变异的确切机制尚不十分清楚，对于它们之间是怎样联系、如何相互作用仍未得到明确的解释。而且由于mtDNA含有的基因数量少，并不含有原癌基因或抑癌基因，因而mtDNA的基因改变可能不具有独立致癌的能力，它应该是和核DNA相互作用导致肿瘤发生的。所以今后对mtDNA突变的更深入的研究可以考虑其与nDNA之间信号传导的细节，这将有助于理解mtDNA在实体瘤和恶性血液病的研究以及肿瘤细胞中mtDNA的复制机制，这对寻找新的肿瘤基因诊断的标志物和监测肿瘤发生的遗传易感性是有意义的。
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作者单位:510060广东广州中山大学肿瘤防治中心病理科
通讯作者:Email jyshao@gzsums.edu.cn
(编辑李 木), 百拇医药(吴晶晶)
国家自然科学基金项目(No.30371593);
广东省科技计划项目(No.2003A3080202)。
【摘要】 线粒体DNA(mitochondrial DNA，mt DNA)是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质，与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。mtDNA自身的结构和功能特点决定了它是致癌物作用的重要靶点，易受致癌因素的损伤而发生突变。mtDNA的突变可削弱正常的呼吸功能，释放高水平的活性氧(ROS)，进而增加肿瘤发生的危险性，所以mtDNA被认为与肿瘤发生有密切关系。近年来，这方面的研究越来越多，本文现就mtDNA突变与消化系统肿瘤、妇科肿瘤、头颈部肿瘤、泌尿系统肿瘤等实体瘤以及血液系统恶性肿瘤之间的关系作一简单的综述。
, 百拇医药 关键词 线粒体DNA 突变 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3261-05
Relationship between mitochondrial DNA mutations and tumors
Wu Jingjing，Shao Jianyong，Wu Qiuliang
Department of Pathology，Cancer Center，Sun Yatsen University， No.651of Dongfeng East Road，Guangzhou，Guangdong510060.
【Abstract】 Mitochondrial DNA(mt DNA)is the only inheritant substance except for the nuclear DNA in a euˉkaryon cell，which is related to the oxidative phosphorylation of a cell.Mitochondrial DNA is the important target of carcinogens and is vulnerable because of its structure and function.The mutation of mtDNA could reduce the nomal respitation and release large quantities of ROS，whichincrease the danger of cancer happening.So，mtDNA has been thought to be involved in carcinogenesis and recently more and more studies in this aspect have comeout.In this paˉper，we review the researches for relationship among mtDNA mutation and tumors in digestion system，woman system，head and neck，urinary systemand blood system.
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Key words mitochondrial DNA mutation carcinoma
肿瘤的发生与多种因素有关。人们在研究肿瘤发病的过程中，不仅注意到核基因的变化，而且也注意到了核外遗传物质-线粒体DNA(mitochondrial DNA，mt DNA)的变化。在上世纪70年代以前，有关线粒体与肿瘤发病关系的研究主要集中在肿瘤细胞线粒体的形态和能量代谢等方面。80年代以后，由于mtDNA的发现，人们迅速把目光转向mtDNA 突变与肿瘤关系的研究上，有学者发现，在一些人类肿瘤和实验性肿瘤的癌细胞中，mtDNA可发生特异性改变。近年来，这方面的大量研究进一步表明了线粒体DNA突变和人类肿瘤的形成与发展之间密切相关。本文现将有关研究作一简单的综述。
1 线粒体DNA的结构特点及功能
线粒体DNA是真核细胞中唯一存在的独立于细胞核DNA之外的遗传物质，其结构非常简洁。mtDNA呈闭环双链，在只有16569bp长的基因组内包含了2种rRNA，22种tRNA和13种蛋白多肽的编码基因。这些多肽的分布为:复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶，NADH dehydogenase-uˉbiquinene oxidoreductase，ND)中7个亚基(ND 1 ，ND 2 ，ND 3 ，ND 4 ，ND 4L ，ND 5 ，ND 6 );复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原Tel/Fax86-20-87343391 酶，ubiquinone-cytodhrome c oxidoreductase)中1个亚基(Cytb);复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶，cytochrome c oxidase，CO)中3个亚基(COⅠ，COⅡ，COⅢ)和复合体V(ATP合酶，ATPsynthase)中Fo的2个亚基(ATPase6和ATPase8)。所有这13种多肽均是呼吸链的组成成分，位于线粒体内膜。在mtDNA中除D环(D-Loop)区外，相邻的基因间极少有非编码基因。因此常把D环区第16024至575位核苷酸之间的1120bp片段称为控制区(control region)，它占全部mtDNA的6%左右，负责整个分子复制和转录的调控。mtDNA可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译，具有非常活跃的自我复制能力。与核DNA不同的是，mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成表达蛋白质的变化。
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线粒体DNA与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。人体内90%以上的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体基因编码的蛋白均参与线粒体的氧化过程。在此过程中可产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，当电子传递链功能障碍或机体抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内的自由基不能被有效清除而累积，可使线粒体发生氧化性损伤，从而导致mtDNA的突变。细胞中mtDNA突变的种类可分为异质性突变(heterogenous mutation)和同质性突变(homogenous mutation)，前者指正常的和突变的mtDNA共存于同一细胞;后者指细胞内存在同一种结构的mtDNA。从mtDNA突变的类型考虑，主要有大片段缺失、错义突变，移码突变以及小片段的缺失和插入等。由于mtDNA在体内分布非常广泛，故它的损害可影响到全身多个器官、系统，所以有关它与疾病的关系受到了学者们的广泛关注。目前，越来越多的研究发现:肿瘤的发生发展过程是与线粒体DNA的突变联系在一起的。
2 不同肿瘤组织中线粒体DNA的突变
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2.1 消化系统肿瘤mtDNA突变 有关消化系统肿瘤mtDNA突变的研究已成为热点。有许多文章报道在结肠癌组织中mtDNA点突变的发生比较普遍，而大片段的缺失较少见。Polyak [1]等于1998年首次通过对10例结肠癌细胞系和原发性肿瘤中mtDNA全基因组测序，发现了7例(70%)伴有mtDNA体细胞的同质性突变。在12种体细胞的突变形式中，有11/12是单个碱基的替换，1/12是插入突变，并且发现mtDNA的突变比核DNA突变至少多10倍。在Habano [2] 等的一项研究中发现结肠癌组织中有7/45(16%)存在突变，包括3例编码区ND1和ND5的移码突变，2例错义突变，1例15bp的缺失，没有发现大片段的缺失。Hibi [3] 等亦对77例原发性结、直肠癌作了D-Loop区域的测序，确定7/77(9%)有mtDNA体细胞突变，其中1例(14%)可在血清中检测到同样的突变。另外，线粒体HV区(hypervariable region)也存在体细胞突变，主要集中在HV 1 和HV 2 区。Alonso [4] 等分析了13例结肠癌组织的HV区，结果有2例发生HV 1 区A:T/G:C的置换，1例HV 2 区发生C:G的缺失。在对胃癌组织的研究中，相关结果显示胃癌可能更倾向于发生mtDNA大片段的缺失，这与结肠癌多倾向于点突变的发生有所不同。Maximo [5] 等发现在32例原发胃癌病例中有17例(53%)存在mtDNA4977bp大片段的缺失，突变大多发生于D-Loop区和ND 1 、ND 2 区。Burˉgart [6] 等对32例胃腺癌mtDNA也进行了突变检测，发现4/32(12.5%)例D-Loop区存在50bp的缺失，并且都是在胃贲门附近癌组织中检测到的，胃远端未检测到。Habano [7] 还研究了胃癌患者的8个编码基因和D环非编码的(C)n序列，发现有ND(ND 1 、ND 5 )基因的突变。最近，Hiyama [8]等又检测了56例胃癌患者肿瘤组织中的mtDNA，结果发现有9例(16%)存在mtDNA的突变，而且在癌组织中mtDNA的突变率明显高于非癌组织(12%vs1%)，差异有显著性(P=0.008)。由此可见，胃肠道肿瘤组织中mtDNA的突变情况是不一致的。同时，值得注意的是，研究中发现D-Loop区是mtDNA复制转录的调控区，几乎所有与mtDNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区。所以，许多报道提示D-Loop区(约1.1kb)可能是mtDNA突变的热点区域。肝癌组织中mtDNA的突变也已被检测到，并且在患者血浆中可间接反映出这种改变。Nishikawa [9] 等对59例肝癌肿瘤组织及相应的癌旁组织中mtDNA进行检测，结果发现在D-Loop区的100～600bp的碱基之间突变频率最高，所有突变均为260bp处G→A，489bp处T→C的单碱基替换，以及311→312bp之间的C插入。并且发现无论是肝癌组织还是癌旁组织都存在mtDNA突变，且突变程度不同，突变程度越高，恶性度越高。Kubo [10] 等检测了肝细胞癌患者肿瘤组织和肝炎病毒C感染的患者肝组织中mtDNA的突变情况，发现在48例受检者中有33例存在3处或多处基因突变，且这33例中有10/33为肝细胞癌患者，而另外15例非癌患者肝组织中只有2处或更少的突变，二者间差 异有显著性(P=0.0201)。另外，Nomoto [11] 等检测了19例肝细胞癌患者的肿瘤组织，发现有13/19(68%)例存在mtDˉNA D-Loop区的突变。在13例突变的mtDNA中，有8个均在高变区发生了单个碱基的缺失或插入，而且在10例取血的病人中有8/10(80%)亦在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA突变。Okochi [12] 等对50例肝细胞癌病人进行了检测，结果在肿瘤组织中发现的100处基因变异中有15处是以前未报道过的新类型变异，有17/50例(34%)发现了D-Loop区的突变，并且在随后的匹配血浆检测中，有5/15例(33%)在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA突变。由此可考虑将mtDNA突变作为一种肝细胞肿瘤标志物，通过检测血浆中mtDNA的改变情况来帮助监测肿瘤，这对于肿瘤的早期诊断和基因治疗有重要意义。
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2.2 乳腺癌mtDNA突变 在乳腺癌患者的肿瘤组织和体液(如血浆)中已检测到有mtDNA突变，主要位于线粒体D环，突变的热点在高变区(HVR1，HVR2)，且HVR2比HVR1更易突变。Bendall [13] 等研究了乳腺癌组织中的mtDNA，发现16189位点T-C的置换会导致PolyC的长度不稳定，进一步的研究得出，尽管在这些细胞当中存在不同长度PolyC，但T-C的突变却是一致的(同质性)。Parrella [14] 等在对18份浸润性导管癌组织作了mtDNA全基因组测序后，发现有12个mtDNA突变存在于11例肿瘤中，突变率为61%(11/18)，其中5例突变(42%)是D-Loop区的碱基插入或缺失，其余7例(58%)是在ND 1 、ND 4 、ND 5 和Cytb编码区的单碱基替换。另有研究者 [15] 在17名乳腺癌患者中发现了不同程度的mtDNA点突变和缺失所引起的ComIV的异常变化，其中3名患者有4977bp处的缺失。同时有相关实验发现，60%的乳腺癌细胞中有非遗传性的点突变或长片段的不稳定。Tan [16] 等亦在乳腺癌组织中检测到mtDNA的体细胞突变。最近，勒斌 [17] 等采用变性高效液相色谱检测了10例乳腺癌患者的血浆mtDNA，结果发现有4/10例存在D环HVR 2 区的突变。所以，乳腺癌的发生发展与mtDNA的突变密切相关。
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2.3 妇科肿瘤mtDNA突变 妇科肿瘤组织中mtDNA基因结构的改变为多基因、多位点的突变，常涉及到2个以上的基因，突变的热点区域在cytb基因区。Liu [18] 等曾对10组卵巢癌与对照标本的全序列进行分析，结果得到60%的肿瘤细胞有mtDNA体细胞突变，多为T→C或G→A的点突变，且分别位于16S、12SrRNA、D环区及cytb基因区域。最近，Liu [19] 等又检测了子宫内膜癌组织及正常对照组织中的mtDNA D环区和12S、16SrRNA的基因编码区，结果有28/50例(56%)发现有一处或多处的体细胞突变，这些mtDNA的改变包括片段缺失、点突变及微卫星的不稳定，主要发生在D环的HV1、HV2区和12SrRNA的编码区。另外，李红霞 [20] 等检测了32例妇科恶性肿瘤患者(包括宫颈癌5例、子宫内膜癌10例、卵巢癌17例)、8例妇科良性肿瘤患者(包括卵巢上皮性肿瘤4例、子宫肌瘤4例)的肿瘤组织和癌旁正常组织中mtDNA基因突变的情况，结果显示恶性组的mtDNA突变率为68.8%，良性组的基因突变率为2/8，两组相比较差异有显著性(P<0.05)。以上资料提示，mtDNA突变可能是妇科恶性肿瘤形成的一个早期现象，并持续存在于癌症演变的全过程。
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2.4 头颈部肿瘤mtDNA突变 在头颈部肿瘤的研究中，mtDNA突变主要集中在D-Loop控制区，其中位于D环的D310(homopolymeric C stretch)变异是主要的突变事件，已有一些文献对此做了报道。Parrella [21] 等对56例肿瘤患者的瘤组织进行了mtDNA的D310变异检测，结果发现有13/56例(23%)存在该区突变，其中颈部肿瘤的突变率最高，非瘤组织中未发现。Tong [22] 等为了解甲状腺肿瘤组织中mtDNA D环的遗传学变异情况，选择了72例甲状腺癌患者(包括35例乳头状癌，18例髓样癌，9例间变性癌，9例滤泡性癌和1例岛状癌)，结果分别在2/35(5.7%)、1/18(5.6%)、1/9(11.1%)、1/9(11.1%)例癌组织中观察到mtDNA的D310变异。整体而言，甲状腺癌组织中该种突变的频率为5/72(6.9%)。由此表明，在甲状腺癌的不同组织类型中均存在mtDNA D环的D310变异，但其突变率较低(低于报道的上皮来源肿瘤的突变率)，显示出甲状腺癌组织中mtDNA的突变与组织学分型之间无明显关系。另外，Maximo [23] 等研究了79例甲状腺良恶性肿瘤及周围正常组织，结果在34例肿瘤组织中检测到57处点突变，在59例患者中发现了253处连续变异，变异主要位于mtDNA D-Loop区，而且癌组织中还存在ComplexⅠ和ComplexⅣ基因区的体细胞突变。他们又发现ATPase-6编码基因的种系多肽性与mtDˉNA的普通缺失(common deletion，CD)有关。蔡青松 [24] 等利用PCR-SSCP技术检测mtDNA复制控制区中164bp的片段，在22例喉癌患者的血细胞中发现3例同质性突变，5例异质性突变，而在12例正常人中未发现带型改变。这个研究结果提示血细胞线粒体DNA D-Loop区的变异，可能与喉癌发生有一定的联系。由此可以看出，在头颈部肿瘤组织中存在mtDNA控制区的高频率变异，这种变异可能是头颈部肿瘤发生机制中的一个重要的核外分子遗传学的改变。
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2.5 泌尿系统肿瘤mtDNA突变 已有大量文献证实mtDNA突变与肿瘤的发生发展有密切联系，泌尿系肿瘤也不例外，而且其突变可在患者的尿沉积物中检测到。Penˉta [25] 等在13例诊断为肾细胞癌的患者中发现有8例存在编码ND 3 亚单位的mtDNA的同质性缺失，并伴其mRNA表达的降低，这在其它实体癌中未发现。又有研究 [26] 报道了在肾细胞癌组织中存在mtDNA的变异，在检测到的94处变异中有38个位于D-Loop区，40个位于多肽编码区，12个位于rRNA编码区以及4个位于tDNA编码区。这些改变提示了肾癌的发生与mtDNA突变有一定的关系。另外，Parrella [21] 等对膀胱癌患者进行了mtDNA分析，发现在癌组织中存在线粒体基因的高频变异，并且在4例膀胱癌患者的尿沉积物中检测到了相同的变异情况。Fliss和同事 [27] 也做过相关报道，他们对肿瘤组织细胞及同一患者体液中的细胞进行了80%的mtDNA序列测定和nDNA检测，结果膀胱癌的突变率为64%，突变主要集中在D环和ND4基因。同时还比较发现检测线粒体DNA突变比检测核DNA突变要简便可靠，能提高诊断的敏感性，可以考虑作为肿瘤诊断的分子标志物。
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2.6 其他肿瘤中mtDNA突变 除了对上述各系统肿瘤的研究外，有学者探讨了mtDNA突变在人肺癌发生中的作用。金雄杰 [28] 等提取58例肺癌组织及其相应病灶的远端非癌肺组织和外周血淋巴细胞的总DNA(包括核DNA和mtDNA)，经PCR扩增后测序，结果在36例(62.1%)肺癌组 织中发现66个突变，其中点突变58个，插入突变4个，缺失突变4个。这些突变分散地分布于mtDNA，以D-Loop区突变最多，在多肽编码区没有明显地热点突变，在8例非癌肺组织中亦发现了与相应肿瘤相同地突变。这个研究提示肺癌组织中mtDNA突变可能是随机发生的，且大部分突变对肿瘤的发生可能没有影响，但其有望成为一种肿瘤诊断的分子标记。Kirches [29] 等研究了脑胶质瘤组织，发现存在高频率的线粒体DNA突变，突变的主要形式为碱基替换及重复序列区域的插入和缺失。另外，mtDNA突变还发现在80%的胰腺癌中，以及前列腺癌和皮肤癌中。
以上所说的均为实体性肿瘤，在血液系统肿瘤中也发现了很多异常。Ivanova [30] 等通过比较人白血病细胞和正常人体细胞mtDNA核苷酸序列，发现人白血病细胞mtDNA非编码区存在明显差异，而编码区核苷酸序列无变化。Clayton [31] 等人在白血病病人的白细胞mtDNA中发现了一些特殊结构，如由两个闭合环状mtDNA分子组成的环状二聚体，这种结构被认为在白血病的发病中起一定的作用。通过大量的研究分析，我们可以看出，不同部位肿瘤中mtDNA的突变不很一致，整体分析它们之间的关系还不太成熟。胃癌组织细胞中mtDNA倾向于较大片段的缺失，肠癌则多为点突变，对于乳腺癌、肝癌以及肾癌等比较有意义的是它们片段的缺失。另外，由于D-Loop环区在mtDNA的转录和复制中起重要作用，已有许多相关报道表明mtDNA的突变主要发生于此区域内，并将D-Loop区认为是mtDNA突变的热点区域。但亦有研究发现在非肿瘤性疾病和正常组织中，该区域也是mtDNA突变的热点区域，说明肿瘤中D-Loop区的高突变率可能并不是肿瘤特异性的变化。所以对于这方面的问题还有待进一步研究。但可以肯定的是，肿瘤的生物学特性不仅取决于核内遗传物质，而且与核外的mtDNA改变有着一定联系。
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3 线粒体DNA突变与肿瘤关系的讨论
mtDNA作为核外重要遗传物质，其结构和功能特点决定了它是致癌物作用的重要靶点，易受致癌因素的损伤而发生突变。原因主要由于以下几点:(1)mtDNA几乎不受DNA结合蛋白(组蛋白)的保护，即是裸露的，所以致癌物容易与之结合。(2)mtDNA的损伤修复机制相对缺乏，损伤后的完全修复率低于核DNA。(3)线粒体内的高氧含量及高脂含量:由于线粒体内氧浓度很高，易产生氧自由基及过氧化氢等物质，且不能有效清除，因而线粒体易受氧化物损伤，可造成核酸片段丢失，碱基修饰及插入突变等。线粒体内的高脂含量使具有嗜脂性的致癌物能优先在mtDNA上集聚。众多研究结果表明，各种化学致癌物与mtDNA的结合远比核DNA有效，结合率更高。Wunderlich [32] 等用14C标记的N-甲基亚硝基脲体外处理培养细胞，结果发现标记致癌剂优先与mtDNA结合，且与mtDNA的结合量是核DNA的5倍。Niranjan [33] 等亦发现，生物致癌剂黄曲霉素B1与肝细胞mtDNA的结合量高出核DNA的3～4倍，且这些结合物不易被清除，可在线粒体内较长时间存在。(4)mtDNA在整个细胞周期中处于不断的合成状态，易受外界因素的干扰，稳定性差。(5)mtDNA的D环区是单链启动复制，易使tRNA基因部位出现发夹样结构，从而增加了mtDˉNA多聚酶r的错配机会，容易导致mtDNA基因突变 [34] 。
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由此可见，mtDNA是较易受攻击的靶分子，常发生损伤与突变。肿瘤是多因素多步骤发展的产物，各种致癌剂作用于mtDNA，使其发生与肿瘤相关的遗传结构改变，这种改变的累积增加了肿瘤发生的危险性。已知mtDNA与细胞氧化磷酸化功能密切相关，线粒体是细胞能量生成和储存的重要场所，在该处经氧化磷酸化的方式将能量转化为ATP高能键，所以mtDNA的缺失和变异可能损害氧的利用，导致细胞的氧化和减少代谢能量的产生。已有实验证实，mtDNA的突变可削弱正常呼吸功能，释放高水平的ROS(活性氧族)，而ROS的增多又会加剧突变效应，二者间形成恶性循环，从而加剧ROS超氧化物和过氧化物的氧化损伤作用，影响线粒体基因组的生物发生并激活核基因组，促进了肿瘤的发生与发展 [35] 。
另外，mtDNA还可能通过其分子及片段在核基因组中的整合来实现诱发细胞癌变。mtDNA在各种损伤因子作用下可产生大量游离于线粒体外的mtDNA片段，它们在一定条件下可穿过核孔，随机整合到核基因组中。已有发现，在一定条件下，核DNA序列以及mtDNA序列可以在胞内游走，而且Liang [36] 等在早期神经胶质瘤细胞的核DNA中发现了mtDNA的整合。这种整合可能会激活原癌基因或抑制抑癌基因，使细胞增殖分化失控，导致癌变。还有一种假说认为损伤的mtDNA具有复制优势并在子代中累积，逐渐形成突变细胞克隆，进而可导致肿瘤的发生 [1] 。
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所以，探讨mtDNA突变与肿瘤的关系，对阐明细胞的癌变机制具有重要的意义。通过以上的分析我们可以认为，检测mtDNA突变对于研究肿瘤的发生发展有重大意义。而且mtDNA在细胞中的拷贝数多，体液中mtDNA的改变又可以间接反映肿瘤DNA的变异情况，所以mtDNA有可能是一种比核DNA更好的研究肿瘤发生发展的分子标记。
4 展望
综上所述，mtDNA参与肿瘤的发生是毫无疑问的。但有关mtDNA与肿瘤关系的研究才刚刚起步，在肿瘤发生发展过程中mtDNA变异的确切机制尚不十分清楚，对于它们之间是怎样联系、如何相互作用仍未得到明确的解释。而且由于mtDNA含有的基因数量少，并不含有原癌基因或抑癌基因，因而mtDNA的基因改变可能不具有独立致癌的能力，它应该是和核DNA相互作用导致肿瘤发生的。所以今后对mtDNA突变的更深入的研究可以考虑其与nDNA之间信号传导的细节，这将有助于理解mtDNA在实体瘤和恶性血液病的研究以及肿瘤细胞中mtDNA的复制机制，这对寻找新的肿瘤基因诊断的标志物和监测肿瘤发生的遗传易感性是有意义的。
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作者单位:510060广东广州中山大学肿瘤防治中心病理科
通讯作者:Email jyshao@gzsums.edu.cn
(编辑李 木), 百拇医药(吴晶晶)