RFDD-PCR技术用于构建证的相关基因表达谱初探 ———支气管哮喘肾虚证患者外周血mRNA差异显示研究
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中华中西医杂志 2003年11月 第4卷 第22期
【摘要】 目的 运用RFDD-PCR技术初步筛选支气管哮喘肾虚证的相关基因，以冀探讨构建中医证的相关基因表达谱的研究方法。方法 采用限制性酶切片段差异显示技术(RFDD-PCR)。收集支气管哮喘肾虚证患者治疗前后外周血，分离纯化其总RNA、合成双链cDNA、TaqI限切酶酶切、在酶切位点两端连上接头、用特异配对于接头的引物进行降落PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、回收差异条带并重扩增、反向斑点杂交、测序、生物信息学分析。结果 共找到36条差异条带，其中25条能用斑点杂交验证，选取共性差异条带3条进行测序，结果与基因库比较未发现同源序列。结论 3条基因片段可能是与支气管哮喘肾虚证相关的新基因;RFDD-PCR技术为研究与中医证相关的基因差异表达谱提供了一种可行的方法。
关键词 RFDD-PCR 基因表达谱 肾虚证 支气管哮喘 差异显示
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)22-3041-03
, http://www.100md.com
The initial exploration of application of RFDD-PCR
for constructing related genes’expression profiles of syndromes
———The differential display study in peripheral blood of patients with asthma and kidney vacuity
Hu Yueshan，Li Jiefen，Tan Yuhui，et al.
Biochemistry Institute of Guangzhou University of TCM，Guangzhou510405.
【Abstract】 Objective To explore a method of constructing related genes’expression profiles of syndromes by screening related genes of asthma and kidney vacuity using RFDD-PCR technique.Methods Collected pro-theraˉpy and post-therapypatients’peri-blood who got an asthma and kidney vacuity，we isolated the total RNA respecˉtively，treated it with DnaseI，reverse transcript it to cDNA，cutwith TaqI，connected the adaptors，amplified with primers which anneals to the adaptors specially，electrophoresis on7percent polyacrylamide gel，stained with AgNO 3 ，compared the display profile，found the differential bands and cut it，re-amplified the differential bands，dot the product of PCR on the nylon membrane，hybridized with the cDNAs which were reverse transcript from total RNA，seˉquenced the positive bands and blasted it with the data in Genbank.Results We found36differential bands from the gel，25of them could be tested by hybridization.Three of the differencial expression is the same among three paˉtients.Sequencing these three and blasting with Genbank，we haven’t found homologous consequence with it.Conˉclusion the three gene’s fragments may be new related genes of asthma and kidney vacuity，the RFDD-PCR techˉnique is a good method of constructing related genes’expression profiles of syndromes.
, 百拇医药
Key words RFDD-PCR genes’expression profiles kidney vacuity asthma differential display
辨证论治是中医理论的精华所在。但是迄今中医辨证尚缺乏统一的量化诊断标准。为此，广大中医、中西医结合工作者分别从细胞、蛋白质以及基因等各个层次深入探讨了中医证的实质。当代飞速发展的生物医学研究已经表明，所有疾病均存在基因表达变化。作为概括疾病发展过程中某一特定阶段所有症状、体征的中医的证，同样会有基因表达的改变。已有研究显示中医的证同某些已知基因的表达差异有关 [1～3] 。为此，有学者提出构建疾病证型的特异基因表达谱 [4] 。然而具体实验还未见报道。
差异显示(DD-PCR)技术 [5] 与基因表达芯片技术一样，是一种能全面筛选组织细胞特异性表达基因的方法，该法所需RNA量少、操作快速、能同时比较多个样品、成本及技术设备要求上较基因表达芯片技术低得多，因而在国内外得到广泛应用。国外最近报道的限制性酶切片段差异显示(RFDD-PCR) [6] 技术又进一步提高了它的重复性及降低其假阳性率。本研究按照病证结合的思路，结合临床实际，拟从支气管哮喘肾虚证入手，以治疗前(肾虚证)后(肾虚证明显改善)病人外周血细胞作靶细胞，运用RFDD-PCR技术筛选该病证的相关基因，以冀探讨构建证的特异基因表达谱的方法。
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1 材料
1.1 取材 选取支气管哮喘缓解期肾虚证病人作为研究对象，年龄须小于30岁以减少兼证出现，严格控制纳入标准和排除标准。哮喘诊断标准采用1992年全国哮喘会议标准，肾虚证标准按照1988年卫生部药政局公布的新药(中药)治疗支气管哮喘临床指导原则，肾虚证的确诊须3个以上副主任级(或以上)医师的共同诊断，只选用治疗前肾虚证典型表现者及治疗后肾虚证明显改善而且没有兼证出现的病人。最后符合要求的只有4例，其中男性2例，年龄分别是16岁和24岁;女性2例，年龄分别是14岁和28岁，在治疗前肾虚证明显存在及治疗后明显改善情况下各采血6ml，所有病例治疗均以参蛤散为主方。
1.2 主要试剂与仪器 全血总RNA提取试剂盒(北京鼎国生物)，displayPROFILE试剂盒(Qbiogene)，Dig标记及检测试剂盒(Roche)，丙烯酰胺(Promega)，AgNO 3 (Sigma)，DNAeasy柱(申能博彩)，尼龙膜(Sigma)等。高速冷冻离心机(Sigˉma)，紫外/可见光分光光度计(Amersham)，PCR仪(ABI)，电泳系统(Bio-rad)，凝胶成像系统(Syngene)，杂交仪(北京华运)等。
, 百拇医药
2 方法
2.1 总RNA的提纯 按提取试剂盒说明书提取全血中总RNA，并用DNaseⅠ处理，紫外/可见光分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2 双链cDNA的合成与纯化回收 上述RNA样品用5′TnV引物逆转录合成cDNA第一链，用RNaseH及DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第二链并纯化回收。取适量作琼脂糖电泳检测。
2.3 双链cDNA的酶切、接头的连接及预扩增 上述合成的双链cDNA经TaqI限切酶酶切，再用T 4 DNA连接酶在其两端连上接头，然后用控制引物进行PCR预扩增以检验酶切连上接头的效果。
2.4 Touch-Down PCR 如果预扩增电泳结果显示cDNA酶切和两端接头连接的情况良好，则可以用特异性引物来进行降落PCR扩增。
, 百拇医药
2.5 7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 参考《分子克隆》 [7] 上的方法，采用0.5×TBE、0.42g/mL的尿素及7%的聚丙烯酰胺(PAG)凝胶，制胶2h后25W恒功率预电泳半小时，上述PCR产物各上样10μl，再35W恒功率电泳直至溴酚兰泳出电泳槽。
2.6 银染 10%冰乙酸固定40min，超纯水洗5min2次，在加有1g/L的AgNO 3 、1.5ml/L37%的甲醛的溶液中染色50min，超纯水洗5～10s，在加有30g/L Na 2 CO 3 、1.5ml/L的37%甲醛、4mg/L硫代硫酸钠的溶液中显色15～30min，冰乙酸中止。
2.7 差异条带的回收与重扩 小心切下差异条带，灭菌水洗涤2次，捣碎至絮状，沸水煮5min，再12000rpm离心3～5min，取上清作模板，用试剂盒提供的PCR反应体系及条件扩增。
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2.8 反向斑点杂交 参照崔氏等 [8] 的经验，选用反向斑点杂交来验证。取原样品中总RNA合成的双链cDNA，地高辛标记。用试剂盒提供的标准标记物来检测标记的效果(即推测标记双链cDNA的量)。用DNAeasy柱纯化回收重新PCR扩增后的差异基因片段，点于尼龙膜上。与上面标记好的cDNA杂交。
2.9 测序及生物信息学分析 选择能用杂交验证的共性差异条带的PCR产物送至基康公司测序，所得结果与Genˉbank数据库比较。
3 结果
3.1 总RNA的提纯 经检测提取的总RNA OD260/280的比值都>1.7，说明纯度较好。产量约2～4μg。普通琼脂糖电泳图谱显示28S及18S清晰，比例约为2:1，说明完整性 较好(图1)。
3.2 双链cDNA的合成 电泳结果呈现从几十bp到几千bp的涂布状条带，28S及18S处无特征性条带，说明RNA已成功逆转录成cDNA(图2)。
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3.3 双链cDNA的酶切、接头的连接及预扩增 控制引物(二对)扩增后的电泳结果显示二条清晰的亮带，提示酶切及连上接头操作情况良好(图3)。
3.4 降落PCR 由于PAG电泳及银染操作较为复杂，为初步估计降落PCR的扩增效果，先用琼脂糖凝胶电泳观察。电泳可见明显的从几十bp到几千bp的涂布状条带，提示cDNA酶切片段得到扩增，可进行下一步PAG电泳(图4)。
3.5 降落PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染 银染图谱中共找到36条差异条带。其中4个病人都相同的差异条带为零，3个病人都相同的差异条带有3条(均为治疗前高表达)，2个病人都相同的差异条带有6条(其中5条为治疗前高表达，1条为治疗后高表达)，其余差异条带为同一病人治疗前后比较所得(其中20条为治疗前高表达，7条为治疗后高表达)(图5)。
3.6 差异条带的回收及PCR重扩增 回收条带经PCR重扩增后琼脂糖电泳结果可见单一的PCR条带，大小约为200～500多bp(图6)。
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3.7 反向斑点杂交结果 把治疗前血样中得到的差异条带与同一血样的地高辛标记cDNA杂交，治疗后血样中得到的差异条带与同一治疗后血样的地高辛标记cDNA杂交。结果共有25条差异条带能用斑点杂交验证，其中治疗前19条，治疗后6条(图7)。
3.8 测序的结果 选取经杂交验证的3个病人都相同的差异基因片段测序，测序结果与基因库数据进行比较，结果未发现高度同源的基因序列。
4 讨论
近十几年来，DD法被广泛应用于疾病相关基因的筛选。与早期DD法相比，RFDD技术由于使用特殊设计的cDNA配对接头和一系列特殊设计的引物、能重点放大和展示编码区，故具有高度的重复性，且无产物的近3′端扩增现象，被称为第二代差异显示技术。在本实验过程中，我们对RNA提取、cDNA合成、酶切连上接头、降落PCR等各个步骤进行了步步验证，均得到较好的结果。最后实验结果亦显示，杂交验证假阳性较低，经测序的3条差异片段亦无聚T现象。由此看来RFDD-PCR的确具有更多优点。
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在RFDD-PCR技术操作过程中，经反复摸索，我们发现，选用银染的方法作差异条带的观察和回收重扩时，宜将试剂盒说明书的25个循环改为30次以保证足够的PCR产量。如操作不慎导致试剂不足时，RFDD-PCR试剂盒中专利逆转录酶、聚合酶可用其它公司的同类产品替代，亦可得到良好的扩增效果(图6)。
本实验结果显示，同一病人治疗前后的差异条带多，而两个以上的病人具有的相同差异条带则不多，甚至找不到4人相同的差异条带。证所包含的功能状态信息可能包括了特异基因差异表达的几种组合方式，同一证的病人有些出现此组合，有些出现彼组合，换言之，并非100%共性的差异才是证的相关基因，当然共性越大是证的相关基因的可能性就越大。另一原因，可能是差异表达的特异基因在其他组织中，而本研究为了诊断取样的方便只是对比了外周血细胞的基因差异表达，故找不到4人相同的差异条带可能是正常现象。另外，由于本研究的样本量不够大，我们不能肯定只在一个病人治疗前后出现的基因差异表达，只是与治疗前后(一个多月)细胞的发育、分化差异有关，而与肾虚证的变化无关。因此杂交证明的25条差异表达基因都有可能是该病证的相关基因。因此，我们宜先将这些差异条带测序后把资料存进电脑，今后再进一步扩大样本量，并采用上述的方法建立支气管哮喘肾虚证外周血基因差异表达数据库，为支气管哮喘肾虚证的诊断提供客观参考指标;再扩大到其他相关组织，找出支气管哮喘肾虚证所有相关组织细胞的共性差异表达基因，经与其他支气管哮喘肾虚证病人验证后编制出支气管哮喘肾虚证相关基因表达谱，可作为筛选治疗该病证新药的分子模型。再扩大到其他疾病的肾虚证，寻找共性差异表达基因，可望建立肾虚证相关的特异基因表达谱。另外，基因表达谱是从mRNA水平反映细胞或组织特异表型和表达模式，还要借助蛋白质组学的研究成果，建立证型相关蛋白质谱，才有可能探讨肾虚证的客观实质。这是一个工作量相当巨大而又复杂的工程，不仅与基因表达检测有关，还与生物信息学有关，本研究只不过是一初步试探性的工作。
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随着基因组学研究的飞速发展，基因表达芯片这种高通量的快速基因表达检测技术 [9] 有可能降低成本而取代RFDD-PCR法，今后还可能发展出其他更新、更快速、高通量的基因表达检测新技术，但就目前而言，RFDD-PCR法 仍具优势。
参考文献
1 沈自尹.基因科学和21世纪中医药学的走向.上海中医药杂志2000，(10):7-9.
2 宋春风，尹桂山，孙素菊，等.右归饮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调素mRNA表达的影响.中国中医基础医学杂志，2001，7(3):20-22.
3 徐晓阳，冯炜权，冯美云，等.大鼠运动性低血睾酮与肾阳虚模型骨骼肌α-actin基因表达的比较研究.中国运动医学杂志，2000，19(2):142-144.
, 百拇医药
4 孙德利，舒琦瑾.基因表达谱———中医药功能基因组学研究的思考.浙江中医学院学报，2002，2(26):5-9.
5 liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science，1992，(257):967-971.
6 Anne G，Peter W，Susanne K，et al.Restriction fragment differential display of pediocin-resistant Listeria monocytogenes412mutants shows consistent overexpression of a putativeβ-glucoside-specific PTS sysˉtem.Microbiology，2000，(146):1381-1389.
7 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1996，631-640.
8 崔振中.用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因.北京医科大学学报，1999，(3):216-219.
9 陈华友，崔振玲，吴自荣.基因芯片技术及其在药学研究领域中的应用.中国药学杂志，2002，3(37):3167-169.
作者单位:510405广州中医药大学生化教研室
(编辑李 木), 百拇医药(胡岳山 李杰芬 谭宇蕙 王剑 高丽)
关键词 RFDD-PCR 基因表达谱 肾虚证 支气管哮喘 差异显示
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)22-3041-03
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The initial exploration of application of RFDD-PCR
for constructing related genes’expression profiles of syndromes
———The differential display study in peripheral blood of patients with asthma and kidney vacuity
Hu Yueshan，Li Jiefen，Tan Yuhui，et al.
Biochemistry Institute of Guangzhou University of TCM，Guangzhou510405.
【Abstract】 Objective To explore a method of constructing related genes’expression profiles of syndromes by screening related genes of asthma and kidney vacuity using RFDD-PCR technique.Methods Collected pro-theraˉpy and post-therapypatients’peri-blood who got an asthma and kidney vacuity，we isolated the total RNA respecˉtively，treated it with DnaseI，reverse transcript it to cDNA，cutwith TaqI，connected the adaptors，amplified with primers which anneals to the adaptors specially，electrophoresis on7percent polyacrylamide gel，stained with AgNO 3 ，compared the display profile，found the differential bands and cut it，re-amplified the differential bands，dot the product of PCR on the nylon membrane，hybridized with the cDNAs which were reverse transcript from total RNA，seˉquenced the positive bands and blasted it with the data in Genbank.Results We found36differential bands from the gel，25of them could be tested by hybridization.Three of the differencial expression is the same among three paˉtients.Sequencing these three and blasting with Genbank，we haven’t found homologous consequence with it.Conˉclusion the three gene’s fragments may be new related genes of asthma and kidney vacuity，the RFDD-PCR techˉnique is a good method of constructing related genes’expression profiles of syndromes.
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Key words RFDD-PCR genes’expression profiles kidney vacuity asthma differential display
辨证论治是中医理论的精华所在。但是迄今中医辨证尚缺乏统一的量化诊断标准。为此，广大中医、中西医结合工作者分别从细胞、蛋白质以及基因等各个层次深入探讨了中医证的实质。当代飞速发展的生物医学研究已经表明，所有疾病均存在基因表达变化。作为概括疾病发展过程中某一特定阶段所有症状、体征的中医的证，同样会有基因表达的改变。已有研究显示中医的证同某些已知基因的表达差异有关 [1～3] 。为此，有学者提出构建疾病证型的特异基因表达谱 [4] 。然而具体实验还未见报道。
差异显示(DD-PCR)技术 [5] 与基因表达芯片技术一样，是一种能全面筛选组织细胞特异性表达基因的方法，该法所需RNA量少、操作快速、能同时比较多个样品、成本及技术设备要求上较基因表达芯片技术低得多，因而在国内外得到广泛应用。国外最近报道的限制性酶切片段差异显示(RFDD-PCR) [6] 技术又进一步提高了它的重复性及降低其假阳性率。本研究按照病证结合的思路，结合临床实际，拟从支气管哮喘肾虚证入手，以治疗前(肾虚证)后(肾虚证明显改善)病人外周血细胞作靶细胞，运用RFDD-PCR技术筛选该病证的相关基因，以冀探讨构建证的特异基因表达谱的方法。
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1 材料
1.1 取材 选取支气管哮喘缓解期肾虚证病人作为研究对象，年龄须小于30岁以减少兼证出现，严格控制纳入标准和排除标准。哮喘诊断标准采用1992年全国哮喘会议标准，肾虚证标准按照1988年卫生部药政局公布的新药(中药)治疗支气管哮喘临床指导原则，肾虚证的确诊须3个以上副主任级(或以上)医师的共同诊断，只选用治疗前肾虚证典型表现者及治疗后肾虚证明显改善而且没有兼证出现的病人。最后符合要求的只有4例，其中男性2例，年龄分别是16岁和24岁;女性2例，年龄分别是14岁和28岁，在治疗前肾虚证明显存在及治疗后明显改善情况下各采血6ml，所有病例治疗均以参蛤散为主方。
1.2 主要试剂与仪器 全血总RNA提取试剂盒(北京鼎国生物)，displayPROFILE试剂盒(Qbiogene)，Dig标记及检测试剂盒(Roche)，丙烯酰胺(Promega)，AgNO 3 (Sigma)，DNAeasy柱(申能博彩)，尼龙膜(Sigma)等。高速冷冻离心机(Sigˉma)，紫外/可见光分光光度计(Amersham)，PCR仪(ABI)，电泳系统(Bio-rad)，凝胶成像系统(Syngene)，杂交仪(北京华运)等。
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2 方法
2.1 总RNA的提纯 按提取试剂盒说明书提取全血中总RNA，并用DNaseⅠ处理，紫外/可见光分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2 双链cDNA的合成与纯化回收 上述RNA样品用5′TnV引物逆转录合成cDNA第一链，用RNaseH及DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第二链并纯化回收。取适量作琼脂糖电泳检测。
2.3 双链cDNA的酶切、接头的连接及预扩增 上述合成的双链cDNA经TaqI限切酶酶切，再用T 4 DNA连接酶在其两端连上接头，然后用控制引物进行PCR预扩增以检验酶切连上接头的效果。
2.4 Touch-Down PCR 如果预扩增电泳结果显示cDNA酶切和两端接头连接的情况良好，则可以用特异性引物来进行降落PCR扩增。
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2.5 7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 参考《分子克隆》 [7] 上的方法，采用0.5×TBE、0.42g/mL的尿素及7%的聚丙烯酰胺(PAG)凝胶，制胶2h后25W恒功率预电泳半小时，上述PCR产物各上样10μl，再35W恒功率电泳直至溴酚兰泳出电泳槽。
2.6 银染 10%冰乙酸固定40min，超纯水洗5min2次，在加有1g/L的AgNO 3 、1.5ml/L37%的甲醛的溶液中染色50min，超纯水洗5～10s，在加有30g/L Na 2 CO 3 、1.5ml/L的37%甲醛、4mg/L硫代硫酸钠的溶液中显色15～30min，冰乙酸中止。
2.7 差异条带的回收与重扩 小心切下差异条带，灭菌水洗涤2次，捣碎至絮状，沸水煮5min，再12000rpm离心3～5min，取上清作模板，用试剂盒提供的PCR反应体系及条件扩增。
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2.8 反向斑点杂交 参照崔氏等 [8] 的经验，选用反向斑点杂交来验证。取原样品中总RNA合成的双链cDNA，地高辛标记。用试剂盒提供的标准标记物来检测标记的效果(即推测标记双链cDNA的量)。用DNAeasy柱纯化回收重新PCR扩增后的差异基因片段，点于尼龙膜上。与上面标记好的cDNA杂交。
2.9 测序及生物信息学分析 选择能用杂交验证的共性差异条带的PCR产物送至基康公司测序，所得结果与Genˉbank数据库比较。
3 结果
3.1 总RNA的提纯 经检测提取的总RNA OD260/280的比值都>1.7，说明纯度较好。产量约2～4μg。普通琼脂糖电泳图谱显示28S及18S清晰，比例约为2:1，说明完整性 较好(图1)。
3.2 双链cDNA的合成 电泳结果呈现从几十bp到几千bp的涂布状条带，28S及18S处无特征性条带，说明RNA已成功逆转录成cDNA(图2)。
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3.3 双链cDNA的酶切、接头的连接及预扩增 控制引物(二对)扩增后的电泳结果显示二条清晰的亮带，提示酶切及连上接头操作情况良好(图3)。
3.4 降落PCR 由于PAG电泳及银染操作较为复杂，为初步估计降落PCR的扩增效果，先用琼脂糖凝胶电泳观察。电泳可见明显的从几十bp到几千bp的涂布状条带，提示cDNA酶切片段得到扩增，可进行下一步PAG电泳(图4)。
3.5 降落PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染 银染图谱中共找到36条差异条带。其中4个病人都相同的差异条带为零，3个病人都相同的差异条带有3条(均为治疗前高表达)，2个病人都相同的差异条带有6条(其中5条为治疗前高表达，1条为治疗后高表达)，其余差异条带为同一病人治疗前后比较所得(其中20条为治疗前高表达，7条为治疗后高表达)(图5)。
3.6 差异条带的回收及PCR重扩增 回收条带经PCR重扩增后琼脂糖电泳结果可见单一的PCR条带，大小约为200～500多bp(图6)。
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3.7 反向斑点杂交结果 把治疗前血样中得到的差异条带与同一血样的地高辛标记cDNA杂交，治疗后血样中得到的差异条带与同一治疗后血样的地高辛标记cDNA杂交。结果共有25条差异条带能用斑点杂交验证，其中治疗前19条，治疗后6条(图7)。
3.8 测序的结果 选取经杂交验证的3个病人都相同的差异基因片段测序，测序结果与基因库数据进行比较，结果未发现高度同源的基因序列。
4 讨论
近十几年来，DD法被广泛应用于疾病相关基因的筛选。与早期DD法相比，RFDD技术由于使用特殊设计的cDNA配对接头和一系列特殊设计的引物、能重点放大和展示编码区，故具有高度的重复性，且无产物的近3′端扩增现象，被称为第二代差异显示技术。在本实验过程中，我们对RNA提取、cDNA合成、酶切连上接头、降落PCR等各个步骤进行了步步验证，均得到较好的结果。最后实验结果亦显示，杂交验证假阳性较低，经测序的3条差异片段亦无聚T现象。由此看来RFDD-PCR的确具有更多优点。
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在RFDD-PCR技术操作过程中，经反复摸索，我们发现，选用银染的方法作差异条带的观察和回收重扩时，宜将试剂盒说明书的25个循环改为30次以保证足够的PCR产量。如操作不慎导致试剂不足时，RFDD-PCR试剂盒中专利逆转录酶、聚合酶可用其它公司的同类产品替代，亦可得到良好的扩增效果(图6)。
本实验结果显示，同一病人治疗前后的差异条带多，而两个以上的病人具有的相同差异条带则不多，甚至找不到4人相同的差异条带。证所包含的功能状态信息可能包括了特异基因差异表达的几种组合方式，同一证的病人有些出现此组合，有些出现彼组合，换言之，并非100%共性的差异才是证的相关基因，当然共性越大是证的相关基因的可能性就越大。另一原因，可能是差异表达的特异基因在其他组织中，而本研究为了诊断取样的方便只是对比了外周血细胞的基因差异表达，故找不到4人相同的差异条带可能是正常现象。另外，由于本研究的样本量不够大，我们不能肯定只在一个病人治疗前后出现的基因差异表达，只是与治疗前后(一个多月)细胞的发育、分化差异有关，而与肾虚证的变化无关。因此杂交证明的25条差异表达基因都有可能是该病证的相关基因。因此，我们宜先将这些差异条带测序后把资料存进电脑，今后再进一步扩大样本量，并采用上述的方法建立支气管哮喘肾虚证外周血基因差异表达数据库，为支气管哮喘肾虚证的诊断提供客观参考指标;再扩大到其他相关组织，找出支气管哮喘肾虚证所有相关组织细胞的共性差异表达基因，经与其他支气管哮喘肾虚证病人验证后编制出支气管哮喘肾虚证相关基因表达谱，可作为筛选治疗该病证新药的分子模型。再扩大到其他疾病的肾虚证，寻找共性差异表达基因，可望建立肾虚证相关的特异基因表达谱。另外，基因表达谱是从mRNA水平反映细胞或组织特异表型和表达模式，还要借助蛋白质组学的研究成果，建立证型相关蛋白质谱，才有可能探讨肾虚证的客观实质。这是一个工作量相当巨大而又复杂的工程，不仅与基因表达检测有关，还与生物信息学有关，本研究只不过是一初步试探性的工作。
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随着基因组学研究的飞速发展，基因表达芯片这种高通量的快速基因表达检测技术 [9] 有可能降低成本而取代RFDD-PCR法，今后还可能发展出其他更新、更快速、高通量的基因表达检测新技术，但就目前而言，RFDD-PCR法 仍具优势。
参考文献
1 沈自尹.基因科学和21世纪中医药学的走向.上海中医药杂志2000，(10):7-9.
2 宋春风，尹桂山，孙素菊，等.右归饮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调素mRNA表达的影响.中国中医基础医学杂志，2001，7(3):20-22.
3 徐晓阳，冯炜权，冯美云，等.大鼠运动性低血睾酮与肾阳虚模型骨骼肌α-actin基因表达的比较研究.中国运动医学杂志，2000，19(2):142-144.
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4 孙德利，舒琦瑾.基因表达谱———中医药功能基因组学研究的思考.浙江中医学院学报，2002，2(26):5-9.
5 liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science，1992，(257):967-971.
6 Anne G，Peter W，Susanne K，et al.Restriction fragment differential display of pediocin-resistant Listeria monocytogenes412mutants shows consistent overexpression of a putativeβ-glucoside-specific PTS sysˉtem.Microbiology，2000，(146):1381-1389.
7 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1996，631-640.
8 崔振中.用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因.北京医科大学学报，1999，(3):216-219.
9 陈华友，崔振玲，吴自荣.基因芯片技术及其在药学研究领域中的应用.中国药学杂志，2002，3(37):3167-169.
作者单位:510405广州中医药大学生化教研室
(编辑李 木), 百拇医药(胡岳山 李杰芬 谭宇蕙 王剑 高丽)