大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌病理变与呼吸链电子漏的关系
【摘要】 目的 探讨大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌病理变化与呼吸链电子漏的关系。方法 将健康Wistar大白鼠35只随机分为7组，每组5只。制作缺血模型后，分别于各组设定的条件下迅速取下骨骼肌提取线粒体，测定抗氰呼吸并在透射电镜下观察骨骼肌线粒体超微结构的变化。结果 缺血、缺血再灌注后的各组抗氰呼吸都比对照组增加(P<0.01)，应用3-硝基-N-甲基水杨酰胺(NSMA)的4、7组分别与相应的缺血、缺血再灌注组比较抗氰呼吸明显减低(P<0.01);再灌注组病理变化严重，肌纤维排列紊乱严重，糖原颗粒减少，线粒体膜断裂，并出现自溶的髓样小体，经NSMA治疗后的病理变化显示肌纤维排列紊乱有明显改善，正常清楚，大部分线粒体完整。结论 缺血、缺血再灌注、缺血给药再灌注后骨骼肌的病理变化与线粒体电漏的多少呈正相关性。
关键词 缺血/缺血再灌注 线粒体 电子漏 透射电镜 3-硝基-N-甲基水杨酰胺
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)23-3145-02
, http://www.100md.com
Relationship between pathologic change and
respiratory chain electron leak in skeletal muscle of
limb in rat after ischemia-reperfusion
Xia Shumeng，Zhang Dechen，Wu Xiaojing，et al.
Department of Anesthesiology，the466th Hospital of PLA，Beijing100089.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between pathologic change and respiratory chain electron leak in skeletal muscle of limb in rat after ischemia-reperfusion. Methods Thirty five healthy Wistar rats were randomly divided into seven groups.To make an ischemia model.KCN-insensitive respiration of mitochondria extracted from the skeletal muscles on different time and conditions were measured.The ultrastructure of mitochondria was also observed from transmission electron microscope.Results The KCN - insensitive respiration of ischemia group and ischemia-reperfusion group increased significantly compared with those of control group，P<0.01and3-nitro-N-methyl salicylamide(NSMA)group P<0.01.Pathologic change of limb were most severe after ischemia-reperfusion，muscle fibers array disordered，glycogen granule decreased，mitochondria membran broke，myeloid corpuscles of autolysis appeared but things were much better after NSMA treatment.Conclusion Pathologic change is positively correlated to mitochondria electron leak in skeletal muscle of ischemia，ischemia- reperfusion ，to reperfusion after medication on ischemia.
, 百拇医药
Key words ischemia-reperfusion mitochondria electron leak transmission electron microscoe 3-nitro-N-methyl salicylamide
活性氧代谢物是导致组织缺血再灌注损伤的主要原因之一。近年来的研究认为缺血再灌注损伤与线粒体功能改变有重要关系[1]。本研究通过观察大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌的病理变化，探讨其发生过程与呼吸链电子漏的关系，为防治缺血性组织损伤提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康Wistar大白鼠35只(由解放军第三零四医院实验动物室提供)，体重180～240g，雌雄不拘。随机分为7组，每组5只。1组(对照组):按缺血模型制备步骤行手术操作，但不阻断右髂总动脉。2组:缺血2h。3组:缺血2h后再灌注1h。4组:缺血2h后给药NSMA(3-硝基-N-甲基水杨酰胺)再灌注1h。5组:缺血6h。6组:缺血6h后再灌注1h。7组:缺血6h后给NSMA再灌注1h。
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1.2 骨骼肌线粒体的提取 制作缺血模型[2]后，分别于各组设定的条件下迅速取下右腓肠肌1g在水浴中剪碎。加分离介质(mmol/L)(甘露醇42、蔗糖14、EDTA0.2、HEPES1、0.5%BSA1g)研磨制成骨骼肌匀浆并于4℃下600g和1000g两次10min离心后，获得棕色沉淀即为骨骼肌线粒体。将沉淀悬浮于0.5ml分离介质中。蛋白含量用考马斯亮兰测定。
1.3 骨骼肌线粒体抗氰呼吸的测定 反应槽内加入所需测定介质(mmol/L)(甘露醇60、氯化钾2、TrB-HCl2、KH 2 PO 4 0.001、EDTA0.04)。加入0.5mol/L琥珀酸10μl，出现4态呼吸，再加入0.5mol/L ADP10μl出现3态呼吸，待ADP完全消耗又恢复4态呼吸时立即加入0.3%氰化钾3μl，此时测得的呼吸称为抗氰呼吸。
1.4 骨骼肌线粒体超微结构观察 随机抽取部分实验组骨骼肌，按透射电镜技术制备超薄切片，电镜下(50k、60k放大倍数)观察并对含线粒体的骨骼肌摄片。
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1.5 统计学处理 所得数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，经t检验进行处理。
2 结果
2.1 线粒体抗氰呼吸 缺血、缺血再灌注后的各组抗氰呼吸都比1组增加，而且NSMA的4、7组的抗氰呼吸明显减低，4、7组分别与相应的缺血、缺血再灌注组比较P<0.01，其中4组对氰化钾敏感，使呼吸几乎完全被抑制。详见表1。
表1 不同条件下的抗氰呼吸(略)
2.2 骨骼肌线粒体超微结构的变化 与对照组比较:缺血组随着时间延长到6h，大部分肌纤维排列紊乱，见糖原颗粒减少，可见线粒体膜断裂，嵴消失;再灌注组随缺血时间延长，肌纤维排列紊乱严重，糖原颗粒减少，线粒体膜断裂，并出现自溶的髓样小体;经NSMA治疗后的肌纤维排列紊乱有明显改善，正常清楚，大部分线粒体完整，可见中等量的糖原颗粒。
, 百拇医药
3 讨论
大多数的学者在研究中，发现缺血再灌注时过量生成的氧自由基导致膜结构脂质过氧化和膜通透性增高等原因造成组织损伤进一步加重。本研究结果表明，肢体缺血再灌注损伤的机制之一是线粒体结构紊乱导致其功能障碍。
线粒体作为能量代谢的主要场所，合成ATP为细胞活动提供能量，对细胞生命活动起着重要作用。在生理条件下，从脱氢酶反应中，电子由氢裂解出来，通过呼吸链传递到O2的途中，并非全部电子都能沿呼吸链传递，最终在细胞色素C氧化酶上以4电子还原O2生成两分子水，而若在途中“漏出”部分单电子，直接与氧形成O2- —这一现象称电子漏(electron leak)。呼吸链的电子漏是生物体中氧自由基(O2·- )的恒定的主要来源[3]。
徐建兴[4]根据实验指出:呼吸链酶系上还原态的细胞 色素C可与H2O2反应生成无损伤作用的H2O，起到生理上清除O2·- 和H2O2 的作用。蓝旭[5]和汤守营[6]等在研究中发现，缺血再灌注后，影响骨骼肌能量代谢及线粒体结构的完整性。因此，在缺血、缺血再灌注后，保护线粒体活性尤为重要。
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NSMA为专一抑制泛醌反应的呼吸链抑制剂，它对呼吸链中催化泛醌反应的三个酶SQR(琥珀酸-泛醌还原酶)，QCR(泛醌-细胞色素C还原酶)和NQR(NADH-泛醌还原酶)均有抑制作用。徐建兴[7]等发现NSMA对提取的呼吸链酶系有明显的抑制作用，用人工电子受体2，6-二氯酚吲哚酚钠(CDPIP)、吩嗪钾硫酸盐(PMS)的实验观察，推论NSMA抑制位点在呼吸链中PMS和DCPIP的电子给体之间，这恰恰是复合物Ⅱ和Ⅲ相交接的地方。
由于缺血供氧不足，线粒体内呼吸链的电子传递紊乱，使电子传递链酶氧化状态转变为还原状态，并引起还原当量积聚，当氧气再次进入组织时(再灌注期间)，积聚的还原当量释放电子与O2结合生成O2·- ，O2·- 经SOD歧化生成H2O2。氧自由基又反过来引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损伤线粒体膜的通透性，引起电子传递链酶活性的进一步下降，形成恶性循环，从而使氧自由基生成进一步增加，最终造成细胞的坏死或凋亡。在本实验研究中观察到缺血再灌注后病理改变最为严重，缺血再灌注后比缺血后电子漏有增加
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趋势。而电子漏的增加必要影响呼吸链正常电子传递，使ATP产生减少，能量不足，从而导致抗氧化保护机制对氧自由基的清除作用减弱。在缺血后预先应用NSMA再灌注其病理改变显示大部分线粒体完整。NSMA能影响呼吸链电子传递，使氧自由基减少，进而维持线粒体结构的完整性和线粒体的功能活性，使细胞进行正常的氧化磷酸化，从而减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。
综上所述，缺血、缺血再灌注、缺血给药再灌注后骨骼肌的病理变化与线粒体电子漏的多少呈正相关性。
参考文献
1 Be K，Hayashi N，Terada H.Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat heart mithochondria during ischemia and reperfusion.Free Radic Biol Med，1999，26:379- 387.
, http://www.100md.com
2 Yokota J，Minei JP，Fantini GA，et al.Role of leukocytes in reperfusion injury of skeletal muscle after partial ischmia.Am J Physiol，1989，257(4):1068-1075.
3 Cross AR，Jones CTG.Enzymic mechanism of superoxide production.Biochem Biophys Acta， 1991，1057(3):281-298.
4 徐建兴.线粒体参与氧自由基代谢的功能.生物化学与生物物理进展，1995，22(2):179-180.
5 蓝旭，刘雪梅，葛宝丰.银杏叶提取液对缺血再灌注骨骼肌线粒体的保护作用.中国骨伤，2002，15 (6):347-348.
6 汤守营，王晓军.缺血预处理减轻骨骼肌缺血再灌注损伤.临床骨科杂志，1999，2:85-87.
7 徐建兴.3-硝基-N-甲基水杨酰胺对琥珀酸细胞色素C还原酶有抑制作用.生物化学杂志，1987，3:139- 145.
作者单位:100089北京解放军第466医院麻醉科
(编辑 曲 全), http://www.100md.com(夏舒萌 张德琛 吴小晶 于卫江 史辛波 陈立芳 郑戈)
关键词 缺血/缺血再灌注 线粒体 电子漏 透射电镜 3-硝基-N-甲基水杨酰胺
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)23-3145-02
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Relationship between pathologic change and
respiratory chain electron leak in skeletal muscle of
limb in rat after ischemia-reperfusion
Xia Shumeng，Zhang Dechen，Wu Xiaojing，et al.
Department of Anesthesiology，the466th Hospital of PLA，Beijing100089.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between pathologic change and respiratory chain electron leak in skeletal muscle of limb in rat after ischemia-reperfusion. Methods Thirty five healthy Wistar rats were randomly divided into seven groups.To make an ischemia model.KCN-insensitive respiration of mitochondria extracted from the skeletal muscles on different time and conditions were measured.The ultrastructure of mitochondria was also observed from transmission electron microscope.Results The KCN - insensitive respiration of ischemia group and ischemia-reperfusion group increased significantly compared with those of control group，P<0.01and3-nitro-N-methyl salicylamide(NSMA)group P<0.01.Pathologic change of limb were most severe after ischemia-reperfusion，muscle fibers array disordered，glycogen granule decreased，mitochondria membran broke，myeloid corpuscles of autolysis appeared but things were much better after NSMA treatment.Conclusion Pathologic change is positively correlated to mitochondria electron leak in skeletal muscle of ischemia，ischemia- reperfusion ，to reperfusion after medication on ischemia.
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Key words ischemia-reperfusion mitochondria electron leak transmission electron microscoe 3-nitro-N-methyl salicylamide
活性氧代谢物是导致组织缺血再灌注损伤的主要原因之一。近年来的研究认为缺血再灌注损伤与线粒体功能改变有重要关系[1]。本研究通过观察大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌的病理变化，探讨其发生过程与呼吸链电子漏的关系，为防治缺血性组织损伤提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康Wistar大白鼠35只(由解放军第三零四医院实验动物室提供)，体重180～240g，雌雄不拘。随机分为7组，每组5只。1组(对照组):按缺血模型制备步骤行手术操作，但不阻断右髂总动脉。2组:缺血2h。3组:缺血2h后再灌注1h。4组:缺血2h后给药NSMA(3-硝基-N-甲基水杨酰胺)再灌注1h。5组:缺血6h。6组:缺血6h后再灌注1h。7组:缺血6h后给NSMA再灌注1h。
, http://www.100md.com
1.2 骨骼肌线粒体的提取 制作缺血模型[2]后，分别于各组设定的条件下迅速取下右腓肠肌1g在水浴中剪碎。加分离介质(mmol/L)(甘露醇42、蔗糖14、EDTA0.2、HEPES1、0.5%BSA1g)研磨制成骨骼肌匀浆并于4℃下600g和1000g两次10min离心后，获得棕色沉淀即为骨骼肌线粒体。将沉淀悬浮于0.5ml分离介质中。蛋白含量用考马斯亮兰测定。
1.3 骨骼肌线粒体抗氰呼吸的测定 反应槽内加入所需测定介质(mmol/L)(甘露醇60、氯化钾2、TrB-HCl2、KH 2 PO 4 0.001、EDTA0.04)。加入0.5mol/L琥珀酸10μl，出现4态呼吸，再加入0.5mol/L ADP10μl出现3态呼吸，待ADP完全消耗又恢复4态呼吸时立即加入0.3%氰化钾3μl，此时测得的呼吸称为抗氰呼吸。
1.4 骨骼肌线粒体超微结构观察 随机抽取部分实验组骨骼肌，按透射电镜技术制备超薄切片，电镜下(50k、60k放大倍数)观察并对含线粒体的骨骼肌摄片。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 所得数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，经t检验进行处理。
2 结果
2.1 线粒体抗氰呼吸 缺血、缺血再灌注后的各组抗氰呼吸都比1组增加，而且NSMA的4、7组的抗氰呼吸明显减低，4、7组分别与相应的缺血、缺血再灌注组比较P<0.01，其中4组对氰化钾敏感，使呼吸几乎完全被抑制。详见表1。
表1 不同条件下的抗氰呼吸(略)
2.2 骨骼肌线粒体超微结构的变化 与对照组比较:缺血组随着时间延长到6h，大部分肌纤维排列紊乱，见糖原颗粒减少，可见线粒体膜断裂，嵴消失;再灌注组随缺血时间延长，肌纤维排列紊乱严重，糖原颗粒减少，线粒体膜断裂，并出现自溶的髓样小体;经NSMA治疗后的肌纤维排列紊乱有明显改善，正常清楚，大部分线粒体完整，可见中等量的糖原颗粒。
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3 讨论
大多数的学者在研究中，发现缺血再灌注时过量生成的氧自由基导致膜结构脂质过氧化和膜通透性增高等原因造成组织损伤进一步加重。本研究结果表明，肢体缺血再灌注损伤的机制之一是线粒体结构紊乱导致其功能障碍。
线粒体作为能量代谢的主要场所，合成ATP为细胞活动提供能量，对细胞生命活动起着重要作用。在生理条件下，从脱氢酶反应中，电子由氢裂解出来，通过呼吸链传递到O2的途中，并非全部电子都能沿呼吸链传递，最终在细胞色素C氧化酶上以4电子还原O2生成两分子水，而若在途中“漏出”部分单电子，直接与氧形成O2- —这一现象称电子漏(electron leak)。呼吸链的电子漏是生物体中氧自由基(O2·- )的恒定的主要来源[3]。
徐建兴[4]根据实验指出:呼吸链酶系上还原态的细胞 色素C可与H2O2反应生成无损伤作用的H2O，起到生理上清除O2·- 和H2O2 的作用。蓝旭[5]和汤守营[6]等在研究中发现，缺血再灌注后，影响骨骼肌能量代谢及线粒体结构的完整性。因此，在缺血、缺血再灌注后，保护线粒体活性尤为重要。
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NSMA为专一抑制泛醌反应的呼吸链抑制剂，它对呼吸链中催化泛醌反应的三个酶SQR(琥珀酸-泛醌还原酶)，QCR(泛醌-细胞色素C还原酶)和NQR(NADH-泛醌还原酶)均有抑制作用。徐建兴[7]等发现NSMA对提取的呼吸链酶系有明显的抑制作用，用人工电子受体2，6-二氯酚吲哚酚钠(CDPIP)、吩嗪钾硫酸盐(PMS)的实验观察，推论NSMA抑制位点在呼吸链中PMS和DCPIP的电子给体之间，这恰恰是复合物Ⅱ和Ⅲ相交接的地方。
由于缺血供氧不足，线粒体内呼吸链的电子传递紊乱，使电子传递链酶氧化状态转变为还原状态，并引起还原当量积聚，当氧气再次进入组织时(再灌注期间)，积聚的还原当量释放电子与O2结合生成O2·- ，O2·- 经SOD歧化生成H2O2。氧自由基又反过来引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损伤线粒体膜的通透性，引起电子传递链酶活性的进一步下降，形成恶性循环，从而使氧自由基生成进一步增加，最终造成细胞的坏死或凋亡。在本实验研究中观察到缺血再灌注后病理改变最为严重，缺血再灌注后比缺血后电子漏有增加
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趋势。而电子漏的增加必要影响呼吸链正常电子传递，使ATP产生减少，能量不足，从而导致抗氧化保护机制对氧自由基的清除作用减弱。在缺血后预先应用NSMA再灌注其病理改变显示大部分线粒体完整。NSMA能影响呼吸链电子传递，使氧自由基减少，进而维持线粒体结构的完整性和线粒体的功能活性，使细胞进行正常的氧化磷酸化，从而减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。
综上所述，缺血、缺血再灌注、缺血给药再灌注后骨骼肌的病理变化与线粒体电子漏的多少呈正相关性。
参考文献
1 Be K，Hayashi N，Terada H.Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat heart mithochondria during ischemia and reperfusion.Free Radic Biol Med，1999，26:379- 387.
, http://www.100md.com
2 Yokota J，Minei JP，Fantini GA，et al.Role of leukocytes in reperfusion injury of skeletal muscle after partial ischmia.Am J Physiol，1989，257(4):1068-1075.
3 Cross AR，Jones CTG.Enzymic mechanism of superoxide production.Biochem Biophys Acta， 1991，1057(3):281-298.
4 徐建兴.线粒体参与氧自由基代谢的功能.生物化学与生物物理进展，1995，22(2):179-180.
5 蓝旭，刘雪梅，葛宝丰.银杏叶提取液对缺血再灌注骨骼肌线粒体的保护作用.中国骨伤，2002，15 (6):347-348.
6 汤守营，王晓军.缺血预处理减轻骨骼肌缺血再灌注损伤.临床骨科杂志，1999，2:85-87.
7 徐建兴.3-硝基-N-甲基水杨酰胺对琥珀酸细胞色素C还原酶有抑制作用.生物化学杂志，1987，3:139- 145.
作者单位:100089北京解放军第466医院麻醉科
(编辑 曲 全), http://www.100md.com(夏舒萌 张德琛 吴小晶 于卫江 史辛波 陈立芳 郑戈)