复方昆明山海棠抗小鼠迟发型变态反应的实验研究(基金项目)
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中华中西医杂志 2003年12月 第4卷 第24期
基金项目:云南省科委自然科学基金支助项目(编号:2001FXX05)
【摘要】 目的 探讨复方昆明山海棠抗迟发型变态反应的药效学和药理学，并与昆明山海棠单剂的水提取物和醇提取物以及无复方昆明山海棠的复方合剂组相比较。方法 以二硝基氟苯(DNFB)为致敏剂，建立起Balb/c小鼠的迟发型变态反应动物模型，通过灌胃给药，测定小鼠耳部的肿胀程度差、重量差及真皮内浸润的单个核细胞数来判断各组药物的药效学;采用免疫组化测定小鼠皮损处角质形成细胞、真皮间隙及血管内皮细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达情况，以阐明复方昆明山海棠的药理作用。结果 复方昆明山海棠实验组的左耳激发前后的厚度差、激发后左右耳的厚度差及组织块的重量差、局部浸润的单个核细胞及皮损中ICAM-1均小于生理盐水对照(P<0.01)，且小于昆明山海棠单剂组及无昆明山海棠的合剂组(P<0.05)。结论 复方昆明山海棠有显著的抗迟发型变态反应的作用，其作用比单剂的水提取物和醇提取物以及无昆明山海棠的复方合剂强，作用机制部分是抑制表皮真皮内ICAM-1的表达，从而减少局部淋巴细胞的浸润，减轻变态反应。
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关键词 复方昆明山海棠 Balb/c小鼠 迟发型变态反应 胞间粘附分子-1
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3233-04
An experiment of suppresive effects of compostie tripterygium hypoglaucun hutch
on delayed allergic reaction of murine
Nong Xiang，He Li，Wan Ping，et al.
The First Affiliated Hospital，Kunming Medical College，Yunnan650032.
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【Abstract】 Objective To study medical efficacy and mechanisms of compositetriterygium hypoglaucum hutch(THH)to suppress on delayed allergic reaction(DAR)of murine and to compared with single THH that come from water and alcohol and non-THH composite.Methods The DAR’S animal model of Balb/c murine was established upon using hypersensitizer2，4-dinitroflurobenzene(DNFB).The efficacy ofeach experimental group was determined with measureing the murine’s ear swelling thickness，weight difference and quantity of infiltration monocytes by pourˉing medicine to murine’s stomach.The medical mechanisms of composite THHwere expounded with measureing ICAM-1expression on keratinocyte，dermal interstitial cell and perivascular cell by immunohistochemical technology.Reˉsults The differences of murine’s ear swelling thickness，weight，quantity of infiltration monocytes and ICAM-1exˉpression on skin that was treated with composite THHwere significantly less than the controls of single THH that come from water and alcohol and non-THH composite(P<0.05)as well as the controls of NS(P<0.01).ConclusionThe compsite THH has markedly suppressive effects to DAR reaction and is more effective than single THH that come from water and alcohol and non-THH composite.The partial mechanisms is suppressed ICAM-1expression on skin so as to reduce infiltration of monocyte and to relieve allergic reaction.
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Key words compsite tripterygium hypoglaucun hutch Balb/c murine delayed allergic reaction ICAM-1
昆明山海棠(triterygium hypoglaucum hutch，THH)与雷公藤为同属植物，继往研究结果表明:THH生药水煎液在0.2～1mg/ml浓度下，可抑制健康人PBMC IL-8、TNF-α等释放及抑制IL-8mRNA的表达;下调猴视网膜血管内皮细胞ICAM-1表达，以干预白细胞在血管内皮细胞的粘附及穿行内皮，恢复调节患者血清血栓素B2、6-酮-前列腺素F 1α、IL-8水平，减轻白细胞趋化、活化等多个环节来拮抗炎症病理反应 [1～3] 。虽然THH具有较好的抗炎、免疫调节作用，但有较强的胃肠道刺激反应，有月经减少、闭经及对人精子有致畸等副作用 [4，5] ，影响它在临床上的广泛使用。我们根据多年的临床经验和中医理论“主、辅、佐、使”的组方原则，以昆明山海棠为主药，辅以清热祛湿、消炎解毒、抗过敏的药物增强抗炎、免疫调节作用，佐以镇静、止痛、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜的药物以减轻其胃肠道反应，佐以补肾益精的药物降低其对生殖系统的毒副作用，组成了复方昆明山海棠合剂。经多年的初步临床观察发现该药对过敏性疾病、血管炎、无菌性脓疱病、银屑病及白塞病等10余种皮肤病有较好疗效，且明显降低了昆明山海棠的副作用 [6] ，因此，我们用之进行对抗小鼠迟发型变态反应的实验研究，以进一步阐明其对过敏性疾病的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物来源 Balb/c纯系雌性小鼠60只，第6周购进，第8周做实验，由昆明医学院实验动物中心提供(云动质0001475)。
1.1.2 实验分组及药物
1.1.2.1 建ACD动物模型所需药物 2，4-二硝基氟苯(DNFB)，以4:1的丙酮橄榄油为基质，配成0.25%和0.5%的两种溶液。
1.1.2.2 药理学、药效学的实验用药及分组 (1)复方昆明山海棠合剂组:昆明山海棠20g，青蒿12g，黄芩9g，白藓皮9g，丹参15g等。(2)昆明山海棠单剂组(水提取):昆明山海棠20g。(3)无昆明山海棠复方合剂组:即去除昆明山海棠的合剂(即:青蒿12g，黄芩9g，白藓皮9g，丹参15g等)以上药材均购自昆明市药材公司。(4)昆明山海棠单剂组(醇提取):昆明山海棠浸膏2.2g(提取率为11%，相当于生药量昆明山海棠20g，昆明友谊制药厂馈赠)。(5)氢化可的松注射液(扬州制药厂，苏卫药准字1982，第241701号)(阳性对照组)。(6)对照组:生理盐水(阴性对照组)。
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1.1.3 主要试剂
1.1.3.1 免疫组化试剂 ICAM-1小鼠IgG单抗(北京中山生物技术公司分装，SANTA CRUZ产品)，SP工作液试剂盒(北京中山生物技术公司)。
1.1.3.2 小鼠INF-γ试剂盒 96孔板，购自晶美公司。
1.1.4 实验仪器 (1)千分卡尺;(2)直径0.6cm的金属打孔器(湖北医疗器械一厂);(3)电子分析天平(梅特勒—托利多上海有限公司，METTLER240型);(4)低速离心机(上海手术器械厂，80-2台式);(5)带网格目镜测微尺的显微镜(Olypums)。
1.2 方法
1.2.1 实验组药物的制备 (1)复方昆明山海棠合剂组;(2)昆明山海棠单剂组(水提取);(3)无昆明山海棠复方合剂组，按上述配伍组成，在昆医附一院制剂室制成合剂备用，简述如下:先将各组药材分别用蒸馏水浸泡1h，文火煎煮两次，每次30min，1μm孔筛过滤，把两次过滤液合并，水溶法浓缩到:①复方昆明山海棠合剂组:1.01g/ml;②昆明山海棠单剂组:0.2g/ml;③无昆明山海棠复方合剂组:0.81g/ml。以上均为含生药量浓度，各组相同体积内有同等的昆明山海棠剂量。④昆明山海棠单剂组(醇提取):昆明山海棠浸膏粉，生理盐水溶解成0.022g/ml。各组药物无菌分装，-20℃保存。以上药物中昆明山海棠单剂为临床常用剂量，各组相同体积内有同等的昆明山海棠剂量，其余各药为国家药典人体用量 [7] ，浓度都经校正，按上述浓度给小鼠0.2ml/10g时，相当于人体用量的10倍。
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1.2.2 DNFB诱发皮炎 上述6组于实验前1日在小鼠腹部去毛，面积约2cm 2 。实验第1日，第2日于去毛部涂0.5%DNFB50μl各致敏1次。第6日于小鼠左耳背面涂0.25%DNFB25μl，于右耳涂基质25μl作对照。
1.2.3 灌药 用灌饲器灌胃给药，剂量按上述煎制的量给0.2ml/10g;阳性对照组:氢化可的松(剂量为24mg·kg -1 ·d -1 ，按0.2ml/10g给小鼠，相当于人体用量的10倍);阴性 对照组:生理盐水，按0.2ml/10g给小鼠。致敏期用药自第一天涂药前2h灌药开始，连续用药3天(第1、2、3天)，激发期(第6天)灌药时间为激发前2h及激发后6h。
1.2.4 观察指标
1.2.4.1 耳厚度差 于致敏前及激发48h后，用千分卡尺单盲法测量小鼠耳中部的厚度差，计算诱发前后左耳厚度差，激发后左右耳厚度差。
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1.2.4.2 耳重量差 于激发后48h，测量小鼠耳厚度之后，剪下整个小鼠耳，用直径0.6cm的金属打孔器在耳中部打孔，取下相同大小的耳部组织块。用分析天平称得每个组织块重量，计算激发后左右耳组织块重量之差。
1.2.4.3 活体取材 剪下的小鼠耳打孔取材称重后，立即用中性甲醛固定，并在48h内制成石蜡块备用，部分做常规染色，部分做ICAM-1免疫组化染色。
1.2.4.4 HE染色及观察 将石蜡块切为4μm厚的片，部分做HE染色，在光镜下用网格目镜测微尺单盲计数每mm 2 单一核细胞数，并计算小鼠左右耳组织单一核细胞数差值。
1.2.4.5免疫组化及观察 (1)免疫组化方法:用SP法，简述如下:将石蜡块切为4μm厚的片，粘附于多聚赖氨酸处理后的玻片上，常规脱蜡，3%H 2 O 2 室温孵育，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡后放入0.01M枸橼酸盐抗原修复液(pH6.6)中，用高压修复抗原后，5%的正常山羊血清封闭，加ICAM-1小鼠单抗，效价1:150，37℃孵育2h以后，按SP试剂盒说明加生物素标记的二抗，辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，复染，封片。以上各步骤间均用PBS(pH7.4)浸洗3次。其中，设置PBS代替一抗为阴性对照。(2)判断标准:随机选取每张切片染色区域的4个高倍视野(400×)的染色细胞数，半定量评分。染色强度用0～3级评分:0级为无染色，1级为轻度染色，2级为中度染色，3级为强度染色。染色范围采用表皮角质形成细胞、真皮间质细胞及血管内皮细胞阳性细胞的百分数，分0～4级:0级为无染色，1级为<25%的细胞染色，2级为25%～50%的细胞染色，3级为>50%～75%的细胞染色，4级为>75%的细胞染色。染色总评分为:染色强度+染色范围。
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1.2.5 统计学方法 用SPSS10.0版进行配对t检验，方差分析及组间两两比较q检验。
2 结果
2.1 各实验组及对照组抗迟发型变态反应的影响
2.1.1 对小鼠耳厚度及重量差的影响 见表1。中药各方与生理盐水相比较差异有非常显著性(P<0.01)，其中以复方昆明山海棠合剂作用最强。复方昆明山海棠合剂与昆明山海棠单剂和无昆明山海棠的合剂比较，差异有显著性(P<0.05)，与氢化可的松及羟基氯喹比较差异无显著性(P>0.05)。
2.1.2 对激发后各组小鼠单个核细胞浸润和ICAM-1表达的影响 见表2。各给药组和生理盐水组相比差异有非常显著性(P<0.01)，实验组中复方昆明山海棠效果最好，与其它三组相比，差异均有显著性(P<0.05)。且单个核细胞浸润和ICAM-1表达呈正相关，见图1。
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表1各组药物对小鼠耳厚度及重量差的影响
注:S1致敏前及激发后48h左耳厚度差，单位10μm。S2激发后48h左右耳厚度差，单位10μm。S3激发后48h左右耳重量差，单位mg。与阴性对照组(生理盐水组)相比: P<0.05， P<0.01;与复方昆明山海棠相比: △ P<0.05， △△ P<0.01
表2 各组激发后小鼠左右耳单个核细胞差值及左耳ICAM-1表达值的比较
注: 示与阴性对照组(生理盐水组)相比， P<0.05， P<0.01; △ 示与复方昆明山海棠相比， △ P<0.05
图1 小鼠耳单个核细胞浸润与ICAM-1 表达的相关性分析(γ=0.785，P<0.01)
3 讨论
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昆明山海棠(THH)为卫矛科雷公藤属植物的根或去皮部木心，又名六方藤，与雷公藤为同属植物，所含化学成份复杂，有生物碱、萜类、色素剂类及雷藤素甲、昆明山海棠碱A等 [9] 。有较好的抗炎、免疫调节作用，在抗炎有效剂量下，并不引起幼年小鼠胸腺萎缩，因此，所具有的抗炎活性可能与垂体—肾上腺皮质系统功能关系不大，所以具有激素样作用，而无明显的激素样副作用 [10] 。在治疗结缔组织病、无菌性脓疱病、血管炎、类风湿性关节炎等与免疫异常有关的疾病有较好疗效，但其有胃脘不适、胃痛、食欲减退、恶心、呕吐腹泻等消化道症状及月经减少、闭经、抗生育和致异倍体等副作用 [4，9] 。我们根据多年的临床经验和中医 理论“主、辅、佐、使”的组方原则，以昆明山海棠为主药，辅以清热祛湿、消炎解毒、抗过敏的青蒿、黄芩、白藓皮增强抗炎、免疫调节作用，佐以镇静、止痛、抑制胃酸分泌的元胡、法夏及活血、保护胃粘膜的丹参以减轻其胃肠道反应，佐以补肾益精的菟丝子降低其对生殖系统的毒副作用，以甘草为使药，益气和中，调合诸药组成了复方昆明山海棠合剂。其用于临床的中药水煎剂在治疗10余种与免疫功能异常有关的皮肤病有明显疗效，无明显的副作用 [6] 。
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经我们的复方昆明山海棠抗小鼠迟发型变态反应的实验研究结果得出:四方中药在左耳激发前后的厚度差、激发后左右耳的厚度差及组织块的重量差、局部浸润的单个核细胞等多个观察指标均有显著效果，从皮损的组织病理可见，生理盐水组角化过度，表皮海绵样水肿，细胞内水肿，少数坏死KC细胞，真皮纤维组织间隙增宽，明显水肿，内有液体潴留，小血管扩张，大量以淋巴细胞为主的单个核细胞及少许多形核细胞浸润，各中药组的病理改变明显减轻，其中复方昆明山海棠合剂组无论在四个客观指标上还是在组织病理改变上都明显优于昆明山海棠单剂组(水提取和醇提取)及无昆明山海棠的合剂组，与具有抗过敏、免疫抑制的氢化可的松阳性对照组相比差异无显著性。说明复方昆明山海棠合剂中的青蒿、黄芩、白藓皮起协同作用，确实增强了昆明山海棠的抗炎、免疫调节作用，从而使之具有更强的抗ACD作用。
通过免疫组化检测，我们的实验得出给药组皮损处角质形成细胞、真皮间隙细胞、血管内皮细胞的胞浆及胞膜中各给药组ICAM-1的表达和生理盐水组相比明显下调，且复方昆明山海棠ICAM-1的表达低于昆明山海棠单剂组和无昆明山海棠的合剂组，这与小鼠耳肿胀结果和单个核细胞浸润结果相一致，且通过相关性分析，皮损处单个核细胞浸润与ICAM-1表达呈正相关。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，表达较广泛，正常情况下ICAM-1可在静止的内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞上少量表达，在正常角质形成细胞上不表达 [11]。淋巴细胞及单核细胞膜上有ICAM-1的配体淋巴细胞功能相关抗原-1(lymˉphocyte function associated antigen-1，LFA-1)，ICAM-1/LFA/1相互作用是使淋巴细胞及单核细胞局部浸润的主要原因之一 [12] 。所以，抑制ICAM-1在皮损处角质形成细胞及血管内皮细胞上的表达是减轻皮肤炎症、治疗这类型皮肤病的关键之一。参照既往的研究:THH生药水煎液可抑制健康人PBMC IL-8，TNF-α等释放及抑制IL-8mRNA的表达;下调猴视网膜血管内皮细胞ICAM-1表达以干预白细胞在血管内皮细胞的粘附及穿行内皮 [1～3] 。我们认为复方昆明山海棠抗ACD的作用机制之一是下调ICAM-1的表达，抑制T淋巴细胞的活化趋化，减少局部炎症细胞的浸润而起到抗炎、免疫调节的作用，且比昆明山海棠单剂的作用强。
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参考文献
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11 余传霖，叶天星，陆德源，等.现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社，1998，158-167.
12 DustinML，Singer KH，Tuck DT.Adhesion ofT lymphoblasts to epiderˉmal keratinocytes is regulated by interferon gamma and is mediated by intercellular adhesion molecule1(ICAM-1).J Exp Med，1988，167(4):1323-1340.
作者单位:650032昆明医学院第一附属医院皮肤性病科
云南省红十字会医院
(编辑李 木), http://www.100md.com(农祥 何黎 万屏 邹勇莉)
【摘要】 目的 探讨复方昆明山海棠抗迟发型变态反应的药效学和药理学，并与昆明山海棠单剂的水提取物和醇提取物以及无复方昆明山海棠的复方合剂组相比较。方法 以二硝基氟苯(DNFB)为致敏剂，建立起Balb/c小鼠的迟发型变态反应动物模型，通过灌胃给药，测定小鼠耳部的肿胀程度差、重量差及真皮内浸润的单个核细胞数来判断各组药物的药效学;采用免疫组化测定小鼠皮损处角质形成细胞、真皮间隙及血管内皮细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达情况，以阐明复方昆明山海棠的药理作用。结果 复方昆明山海棠实验组的左耳激发前后的厚度差、激发后左右耳的厚度差及组织块的重量差、局部浸润的单个核细胞及皮损中ICAM-1均小于生理盐水对照(P<0.01)，且小于昆明山海棠单剂组及无昆明山海棠的合剂组(P<0.05)。结论 复方昆明山海棠有显著的抗迟发型变态反应的作用，其作用比单剂的水提取物和醇提取物以及无昆明山海棠的复方合剂强，作用机制部分是抑制表皮真皮内ICAM-1的表达，从而减少局部淋巴细胞的浸润，减轻变态反应。
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关键词 复方昆明山海棠 Balb/c小鼠 迟发型变态反应 胞间粘附分子-1
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3233-04
An experiment of suppresive effects of compostie tripterygium hypoglaucun hutch
on delayed allergic reaction of murine
Nong Xiang，He Li，Wan Ping，et al.
The First Affiliated Hospital，Kunming Medical College，Yunnan650032.
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【Abstract】 Objective To study medical efficacy and mechanisms of compositetriterygium hypoglaucum hutch(THH)to suppress on delayed allergic reaction(DAR)of murine and to compared with single THH that come from water and alcohol and non-THH composite.Methods The DAR’S animal model of Balb/c murine was established upon using hypersensitizer2，4-dinitroflurobenzene(DNFB).The efficacy ofeach experimental group was determined with measureing the murine’s ear swelling thickness，weight difference and quantity of infiltration monocytes by pourˉing medicine to murine’s stomach.The medical mechanisms of composite THHwere expounded with measureing ICAM-1expression on keratinocyte，dermal interstitial cell and perivascular cell by immunohistochemical technology.Reˉsults The differences of murine’s ear swelling thickness，weight，quantity of infiltration monocytes and ICAM-1exˉpression on skin that was treated with composite THHwere significantly less than the controls of single THH that come from water and alcohol and non-THH composite(P<0.05)as well as the controls of NS(P<0.01).ConclusionThe compsite THH has markedly suppressive effects to DAR reaction and is more effective than single THH that come from water and alcohol and non-THH composite.The partial mechanisms is suppressed ICAM-1expression on skin so as to reduce infiltration of monocyte and to relieve allergic reaction.
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Key words compsite tripterygium hypoglaucun hutch Balb/c murine delayed allergic reaction ICAM-1
昆明山海棠(triterygium hypoglaucum hutch，THH)与雷公藤为同属植物，继往研究结果表明:THH生药水煎液在0.2～1mg/ml浓度下，可抑制健康人PBMC IL-8、TNF-α等释放及抑制IL-8mRNA的表达;下调猴视网膜血管内皮细胞ICAM-1表达，以干预白细胞在血管内皮细胞的粘附及穿行内皮，恢复调节患者血清血栓素B2、6-酮-前列腺素F 1α、IL-8水平，减轻白细胞趋化、活化等多个环节来拮抗炎症病理反应 [1～3] 。虽然THH具有较好的抗炎、免疫调节作用，但有较强的胃肠道刺激反应，有月经减少、闭经及对人精子有致畸等副作用 [4，5] ，影响它在临床上的广泛使用。我们根据多年的临床经验和中医理论“主、辅、佐、使”的组方原则，以昆明山海棠为主药，辅以清热祛湿、消炎解毒、抗过敏的药物增强抗炎、免疫调节作用，佐以镇静、止痛、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜的药物以减轻其胃肠道反应，佐以补肾益精的药物降低其对生殖系统的毒副作用，组成了复方昆明山海棠合剂。经多年的初步临床观察发现该药对过敏性疾病、血管炎、无菌性脓疱病、银屑病及白塞病等10余种皮肤病有较好疗效，且明显降低了昆明山海棠的副作用 [6] ，因此，我们用之进行对抗小鼠迟发型变态反应的实验研究，以进一步阐明其对过敏性疾病的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物来源 Balb/c纯系雌性小鼠60只，第6周购进，第8周做实验，由昆明医学院实验动物中心提供(云动质0001475)。
1.1.2 实验分组及药物
1.1.2.1 建ACD动物模型所需药物 2，4-二硝基氟苯(DNFB)，以4:1的丙酮橄榄油为基质，配成0.25%和0.5%的两种溶液。
1.1.2.2 药理学、药效学的实验用药及分组 (1)复方昆明山海棠合剂组:昆明山海棠20g，青蒿12g，黄芩9g，白藓皮9g，丹参15g等。(2)昆明山海棠单剂组(水提取):昆明山海棠20g。(3)无昆明山海棠复方合剂组:即去除昆明山海棠的合剂(即:青蒿12g，黄芩9g，白藓皮9g，丹参15g等)以上药材均购自昆明市药材公司。(4)昆明山海棠单剂组(醇提取):昆明山海棠浸膏2.2g(提取率为11%，相当于生药量昆明山海棠20g，昆明友谊制药厂馈赠)。(5)氢化可的松注射液(扬州制药厂，苏卫药准字1982，第241701号)(阳性对照组)。(6)对照组:生理盐水(阴性对照组)。
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1.1.3 主要试剂
1.1.3.1 免疫组化试剂 ICAM-1小鼠IgG单抗(北京中山生物技术公司分装，SANTA CRUZ产品)，SP工作液试剂盒(北京中山生物技术公司)。
1.1.3.2 小鼠INF-γ试剂盒 96孔板，购自晶美公司。
1.1.4 实验仪器 (1)千分卡尺;(2)直径0.6cm的金属打孔器(湖北医疗器械一厂);(3)电子分析天平(梅特勒—托利多上海有限公司，METTLER240型);(4)低速离心机(上海手术器械厂，80-2台式);(5)带网格目镜测微尺的显微镜(Olypums)。
1.2 方法
1.2.1 实验组药物的制备 (1)复方昆明山海棠合剂组;(2)昆明山海棠单剂组(水提取);(3)无昆明山海棠复方合剂组，按上述配伍组成，在昆医附一院制剂室制成合剂备用，简述如下:先将各组药材分别用蒸馏水浸泡1h，文火煎煮两次，每次30min，1μm孔筛过滤，把两次过滤液合并，水溶法浓缩到:①复方昆明山海棠合剂组:1.01g/ml;②昆明山海棠单剂组:0.2g/ml;③无昆明山海棠复方合剂组:0.81g/ml。以上均为含生药量浓度，各组相同体积内有同等的昆明山海棠剂量。④昆明山海棠单剂组(醇提取):昆明山海棠浸膏粉，生理盐水溶解成0.022g/ml。各组药物无菌分装，-20℃保存。以上药物中昆明山海棠单剂为临床常用剂量，各组相同体积内有同等的昆明山海棠剂量，其余各药为国家药典人体用量 [7] ，浓度都经校正，按上述浓度给小鼠0.2ml/10g时，相当于人体用量的10倍。
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1.2.2 DNFB诱发皮炎 上述6组于实验前1日在小鼠腹部去毛，面积约2cm 2 。实验第1日，第2日于去毛部涂0.5%DNFB50μl各致敏1次。第6日于小鼠左耳背面涂0.25%DNFB25μl，于右耳涂基质25μl作对照。
1.2.3 灌药 用灌饲器灌胃给药，剂量按上述煎制的量给0.2ml/10g;阳性对照组:氢化可的松(剂量为24mg·kg -1 ·d -1 ，按0.2ml/10g给小鼠，相当于人体用量的10倍);阴性 对照组:生理盐水，按0.2ml/10g给小鼠。致敏期用药自第一天涂药前2h灌药开始，连续用药3天(第1、2、3天)，激发期(第6天)灌药时间为激发前2h及激发后6h。
1.2.4 观察指标
1.2.4.1 耳厚度差 于致敏前及激发48h后，用千分卡尺单盲法测量小鼠耳中部的厚度差，计算诱发前后左耳厚度差，激发后左右耳厚度差。
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1.2.4.2 耳重量差 于激发后48h，测量小鼠耳厚度之后，剪下整个小鼠耳，用直径0.6cm的金属打孔器在耳中部打孔，取下相同大小的耳部组织块。用分析天平称得每个组织块重量，计算激发后左右耳组织块重量之差。
1.2.4.3 活体取材 剪下的小鼠耳打孔取材称重后，立即用中性甲醛固定，并在48h内制成石蜡块备用，部分做常规染色，部分做ICAM-1免疫组化染色。
1.2.4.4 HE染色及观察 将石蜡块切为4μm厚的片，部分做HE染色，在光镜下用网格目镜测微尺单盲计数每mm 2 单一核细胞数，并计算小鼠左右耳组织单一核细胞数差值。
1.2.4.5免疫组化及观察 (1)免疫组化方法:用SP法，简述如下:将石蜡块切为4μm厚的片，粘附于多聚赖氨酸处理后的玻片上，常规脱蜡，3%H 2 O 2 室温孵育，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡后放入0.01M枸橼酸盐抗原修复液(pH6.6)中，用高压修复抗原后，5%的正常山羊血清封闭，加ICAM-1小鼠单抗，效价1:150，37℃孵育2h以后，按SP试剂盒说明加生物素标记的二抗，辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，复染，封片。以上各步骤间均用PBS(pH7.4)浸洗3次。其中，设置PBS代替一抗为阴性对照。(2)判断标准:随机选取每张切片染色区域的4个高倍视野(400×)的染色细胞数，半定量评分。染色强度用0～3级评分:0级为无染色，1级为轻度染色，2级为中度染色，3级为强度染色。染色范围采用表皮角质形成细胞、真皮间质细胞及血管内皮细胞阳性细胞的百分数，分0～4级:0级为无染色，1级为<25%的细胞染色，2级为25%～50%的细胞染色，3级为>50%～75%的细胞染色，4级为>75%的细胞染色。染色总评分为:染色强度+染色范围。
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1.2.5 统计学方法 用SPSS10.0版进行配对t检验，方差分析及组间两两比较q检验。
2 结果
2.1 各实验组及对照组抗迟发型变态反应的影响
2.1.1 对小鼠耳厚度及重量差的影响 见表1。中药各方与生理盐水相比较差异有非常显著性(P<0.01)，其中以复方昆明山海棠合剂作用最强。复方昆明山海棠合剂与昆明山海棠单剂和无昆明山海棠的合剂比较，差异有显著性(P<0.05)，与氢化可的松及羟基氯喹比较差异无显著性(P>0.05)。
2.1.2 对激发后各组小鼠单个核细胞浸润和ICAM-1表达的影响 见表2。各给药组和生理盐水组相比差异有非常显著性(P<0.01)，实验组中复方昆明山海棠效果最好，与其它三组相比，差异均有显著性(P<0.05)。且单个核细胞浸润和ICAM-1表达呈正相关，见图1。
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表1各组药物对小鼠耳厚度及重量差的影响
注:S1致敏前及激发后48h左耳厚度差，单位10μm。S2激发后48h左右耳厚度差，单位10μm。S3激发后48h左右耳重量差，单位mg。与阴性对照组(生理盐水组)相比: P<0.05， P<0.01;与复方昆明山海棠相比: △ P<0.05， △△ P<0.01
表2 各组激发后小鼠左右耳单个核细胞差值及左耳ICAM-1表达值的比较
注: 示与阴性对照组(生理盐水组)相比， P<0.05， P<0.01; △ 示与复方昆明山海棠相比， △ P<0.05
图1 小鼠耳单个核细胞浸润与ICAM-1 表达的相关性分析(γ=0.785，P<0.01)
3 讨论
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昆明山海棠(THH)为卫矛科雷公藤属植物的根或去皮部木心，又名六方藤，与雷公藤为同属植物，所含化学成份复杂，有生物碱、萜类、色素剂类及雷藤素甲、昆明山海棠碱A等 [9] 。有较好的抗炎、免疫调节作用，在抗炎有效剂量下，并不引起幼年小鼠胸腺萎缩，因此，所具有的抗炎活性可能与垂体—肾上腺皮质系统功能关系不大，所以具有激素样作用，而无明显的激素样副作用 [10] 。在治疗结缔组织病、无菌性脓疱病、血管炎、类风湿性关节炎等与免疫异常有关的疾病有较好疗效，但其有胃脘不适、胃痛、食欲减退、恶心、呕吐腹泻等消化道症状及月经减少、闭经、抗生育和致异倍体等副作用 [4，9] 。我们根据多年的临床经验和中医 理论“主、辅、佐、使”的组方原则，以昆明山海棠为主药，辅以清热祛湿、消炎解毒、抗过敏的青蒿、黄芩、白藓皮增强抗炎、免疫调节作用，佐以镇静、止痛、抑制胃酸分泌的元胡、法夏及活血、保护胃粘膜的丹参以减轻其胃肠道反应，佐以补肾益精的菟丝子降低其对生殖系统的毒副作用，以甘草为使药，益气和中，调合诸药组成了复方昆明山海棠合剂。其用于临床的中药水煎剂在治疗10余种与免疫功能异常有关的皮肤病有明显疗效，无明显的副作用 [6] 。
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经我们的复方昆明山海棠抗小鼠迟发型变态反应的实验研究结果得出:四方中药在左耳激发前后的厚度差、激发后左右耳的厚度差及组织块的重量差、局部浸润的单个核细胞等多个观察指标均有显著效果，从皮损的组织病理可见，生理盐水组角化过度，表皮海绵样水肿，细胞内水肿，少数坏死KC细胞，真皮纤维组织间隙增宽，明显水肿，内有液体潴留，小血管扩张，大量以淋巴细胞为主的单个核细胞及少许多形核细胞浸润，各中药组的病理改变明显减轻，其中复方昆明山海棠合剂组无论在四个客观指标上还是在组织病理改变上都明显优于昆明山海棠单剂组(水提取和醇提取)及无昆明山海棠的合剂组，与具有抗过敏、免疫抑制的氢化可的松阳性对照组相比差异无显著性。说明复方昆明山海棠合剂中的青蒿、黄芩、白藓皮起协同作用，确实增强了昆明山海棠的抗炎、免疫调节作用，从而使之具有更强的抗ACD作用。
通过免疫组化检测，我们的实验得出给药组皮损处角质形成细胞、真皮间隙细胞、血管内皮细胞的胞浆及胞膜中各给药组ICAM-1的表达和生理盐水组相比明显下调，且复方昆明山海棠ICAM-1的表达低于昆明山海棠单剂组和无昆明山海棠的合剂组，这与小鼠耳肿胀结果和单个核细胞浸润结果相一致，且通过相关性分析，皮损处单个核细胞浸润与ICAM-1表达呈正相关。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，表达较广泛，正常情况下ICAM-1可在静止的内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞上少量表达，在正常角质形成细胞上不表达 [11]。淋巴细胞及单核细胞膜上有ICAM-1的配体淋巴细胞功能相关抗原-1(lymˉphocyte function associated antigen-1，LFA-1)，ICAM-1/LFA/1相互作用是使淋巴细胞及单核细胞局部浸润的主要原因之一 [12] 。所以，抑制ICAM-1在皮损处角质形成细胞及血管内皮细胞上的表达是减轻皮肤炎症、治疗这类型皮肤病的关键之一。参照既往的研究:THH生药水煎液可抑制健康人PBMC IL-8，TNF-α等释放及抑制IL-8mRNA的表达;下调猴视网膜血管内皮细胞ICAM-1表达以干预白细胞在血管内皮细胞的粘附及穿行内皮 [1～3] 。我们认为复方昆明山海棠抗ACD的作用机制之一是下调ICAM-1的表达，抑制T淋巴细胞的活化趋化，减少局部炎症细胞的浸润而起到抗炎、免疫调节的作用，且比昆明山海棠单剂的作用强。
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参考文献
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11 余传霖，叶天星，陆德源，等.现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社，1998，158-167.
12 DustinML，Singer KH，Tuck DT.Adhesion ofT lymphoblasts to epiderˉmal keratinocytes is regulated by interferon gamma and is mediated by intercellular adhesion molecule1(ICAM-1).J Exp Med，1988，167(4):1323-1340.
作者单位:650032昆明医学院第一附属医院皮肤性病科
云南省红十字会医院
(编辑李 木), http://www.100md.com(农祥 何黎 万屏 邹勇莉)