中国原发性胆汁性肝硬化患者的免疫遗传易感性研究
【摘要】 目的 探讨中国原发性胆汁性肝硬化的易感性与人类白细胞抗原HLA-DRB1、DQB1位点基因多态的相关性。方法 本实验应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术，分析52例PBC患者与43例健康对照HLA-DRB1、DQB1位点的基因频率分布，以相对危险度(RR)代表相关程度。结果 HLA-DRBˇ8基因频率在PBC患者中较健康对照显著增加(18.27%对4.65%，RR=5.61，χ 2 =9.52，P<0.01)，其他等位基因在两组间差异无显著性。进一步对HLA-DR8等位基因亚型的分析表明，PBC患者DRB1.0804的基因频率较健康对照显著增高，但并未发现基因序列与疾病临床表现间的关系。结论 HLA-DRBˇ10804位点可能与PBC的易感性相关。
关键词 肝硬化 胆汁性 HLA-DRB1 HLA-DQB1 多聚酶链反应 序列特异性引物 遗传易感性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3237-02
, 百拇医药
Immunogenetic susceptibility of Chinese patients with primary billary cirrhosis
Jiang Xiaohua，Zhong Renqian，Fang Xiaoyun，et al.
Department of Laboratory Medicine，85th Military Hospital，Shanghai200052.
【Abstract】 Objective To investigate the relation between the susceptibility to primary biliary cirrhosis(PBC)and the polymorphism of HLA-DRB1，DQB1.genes in Chinese.Methods HLA-DRB1，DQB1.gene polymirphism were tested in52PBC patients and43healthy controls using polymerase chain reaction of sequence specific primers(PCR-SSP).Results HLA-DRB1typing by PCR-SSP showed that DR8had a significantly increased frequency among patients with PBC versus healthy control(18.27%versus4.65%;relative risk=5.61， 2 =9.52，P<0.01).No other alleles differed significantly between the two groups.In subtypes of DRB1.08，there was a trend foran inˉcrease in gene frequency of DRB1.0804in patients with PBC versus healthycontrols(10.47%versus5.81%;relaˉtive risk=12.96， 2 =3.29，P<0.01).However，this association is not restricted to any particular，clinically defined subgroups of patients.Conclusion HLA-DRB1.0804may be the susceptible genes of Chinese PBC patients.
, 百拇医药
Key words liver cirrhosis biliary HLA-DRB1 HLA-DQB1 Polymerase chain reaction sequence-specific-primer genetic predisposing to disease
原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病，其病因和发病机理尚不完全清楚，目前多认为它是典型的自身免疫性疾病。PBC患者的一级亲属发生PBC的概率是一般人群的100倍，说明PBC象类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等一样，遗传因素在PBC发病中起重要作用。据文献报道，在高加索人群中，HLA-DRB1ˇ08、DQA1ˇ0401、DQB1ˇ0402是发生PBC的危险因素，并与病情进展相关。因此HLAⅡ类基因可能在PBC易感性中起作用 [1] 。本研究应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术对HLAⅡ类HLA-DRB1、DQB1等位基因进行特异性个体扩增，首次分析了中国PBC患者基因的多态性分布情况。
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1 资料与方法
1.1 研究对象 PBC患者52例均为本研究小组自1998年以来诊断的患者，上海患者18例，外地患者34例。PBC的诊断标准:(1)排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎;(2)肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变(主要是指碱性磷酸酶、谷氨酸转肽酶升高)，且无其它解释(B超检查胆道系统正常)。(3)血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性。(4)肝活检组织学符合PBC表现 [2～4] 。对照组为体检健康者43例，其中男13例，女30例，年龄(32±6.2)岁，家族一、二级亲属中无肝病或自身免疫病史。
1.2 材料 白细胞DNA由本实验室制备。蛋白酶K，TaqDNA多聚酶，SSPDRB1、SSPDQB1分型试剂盒，微量SSP特异等位基因DRB1ˇ08试剂盒购自美国One Lamda公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 基因DNA提取 取血5ml，加入3倍体积的红细胞裂解液(含10mmol/L Tris，5mmol/LMgCl 2 ，10mmol/L NaCl，pH7.6～8.0)，2000×g离心10min，重复1次，向沉淀物中加入4ml白细胞裂解液(含50mmol/L Tris，20mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5%SDS，pH7.4)，20%SDS100μl，蛋白酶K200μg/ml，70℃10min，酚抽提2次，酚/氯仿抽提2次，加入氯化钠至0.3mol/L，2倍体积乙醇沉淀DNA，-20℃保存备用。
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1.4 PCR-SSP 采用高精密度序列特异性引物多聚酶链式反应(PCR-SSP)对样品的DRB1和DQB1多态性进行分析。采用微量SSP特异等位基因PCR-SSP分析DRB1ˇ08的亚型。PCR反应体系:50μl PCR反应缓冲液(含50mmol/L Tris/HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，50mmol/L MgCl 2 )，含4种200μmol/L的dNTP，一对引物各为1μmol/L，1μg待扩增DNA，混合后于94℃5min进行变性。而后加入TaqDNA酶1.5U，混匀后加入50μl液体石蜡油以防止水分蒸发，扩增反应进行30～35个循环。反应条件:94℃1min，55℃1min，72℃2min，最后一次循环，72℃10min以保证延伸反应充分完成。将上述PCR反应产物取10μl于2%琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳后将凝胶置于溴乙啶溶液(0.5μg/ml)中染色20min，然后于紫外灯下观察结果。
1.5 统计学方法 基因频率采用基因计数法计算;组间等位基因频率比较采用χ 2 检验，相对危险度(relative risk，RR)用以评价关联的强度。
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2 结果
2.1 HLA-DRBˇ1、DQB1的等位基因分析 HLA-DRB1、DQB1的等位基因频率见表1。以PCR-SSP进行的基因分型表明DRBˇ1.08的基因频率在PBC患者中较健康对照组显著增高(18.27%与4.65%;RR=5.61，χ 2 =9.52，P<0.01)。未见其他等位基因与PBC有显著相关性。进而采用微量SSP特异等位基因DRB1ˇ08试剂盒对HLA-DRB1.08进行亚型分析。DRB1ˇ08亚型中，PBC患者中的DRB1ˇ0804较正常对照组有显著增加趋势(10.47%与5.81%;RR=3.29，χ 2 =12.96，P<0.01)(表2)。提示DRB1.08、DRB1ˇ0804与PBC易感性高度相关。
2.2 DRB1ˇ08与PBC患者临床表现相关性分析 综合PBC患者的临床资料，未发现基因频率与疾病进程、复发和治疗之间的关系。
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表1 HLA-DRB1/DQB1等位基因频率
注: ˇ RR=5.61，χ 2 =9.52，P<0.01
表2 HLA-DR8等位基因亚型的基因频率
注: ˇ RR=3.29，χ 2 =12.96，P<0.01
3 讨论
人类白细胞抗原(HLA)系统由功能有别的多基因座及共显性复等位基因组成，在抗原识别与递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面起着重要的作用。HLA与多数自身免疫性疾病如类风湿、胰岛素依赖性糖尿病、系统性红斑狼疮等相关，构成重要的易感性。PBC在一般人群中流行率为10～200/100万，而PBC患者第一代亲属PBC发生率为4%～6%，因此PBC患者在第一代亲属PBC发病率比一般人群几乎高100倍，比其他任何自身免疫疾病要高，显示遗传在PBC发病上的重要性。近年来国外报道与PBC易感性相关的分子有DR W 3、DR2、C4B2、DR W 8、DQ W 3、C4AQ0、DR3、DQ3、DQB1、DRB3等 [5，6] 。以前一直认为PBC在中国罕见，2001年以前仅有零星的个案报道，未见中国PBC患者HLA遗传易感基因相关研究报道。我们四年来的研究与2002年国内有关报道提示:PBC在中国可能并不少见 [4] 。
, 百拇医药
本研究选择4年来我们研究小组陆续诊断的52例PBC患者，首次对中国PBC患者的HLA基因进行了分析，结果显示PBC患者中DRB1.08，DRB1.0804的频率分别18.27%、10.47%，经χ 2 分析，与正常对照组相比差异有显著性，提示中国人群中DRB1.08、DRB1.0804与PBC易感性高度相关。关于HLA基因位点与PBC相关性的研究尚未得到一致的结果，部分原因可能是方法、选择病例等方面存在差异，也有可能是人种、地域、民族等引起的实质差异。我们也认识到DRB1、DQB1基因对疾病的易感性并非绝对，本研究仅分析了HLA-DRB1、DQB1基因两个位点，只有对其大多数位点的多态性及有关单倍型进行全面分析，才能较客观地确定HLA-Ⅱ类基因与PBC的相关性。
参考文献
1 姜小华，仲人前，孔宪涛.原发性胆汁性肝硬化发病机制研究进展.中国免疫学杂志，2002，18:586-589.
, http://www.100md.com
2 姜小华，仲人前，孔宪涛，等.利用重组M2三联体抗原建立PBC特异性免疫学检测方法.中华检验医学杂志，2002，26:93-97.
3 姜小华，仲人前，范列英，等.M2自身抗原及其三联体的克隆表达与初步鉴定.中华消化杂志，2001，21:530-533.
4 姜小华，仲人前，孔宪涛，等.用人源M2三联体靶抗原检测抗体诊断原发性胆汁性肝硬化价值探讨.中华肝脏病杂志，2002，10:341-343.
5 Donaldson P，Agarwal K，Craggs A，et al.HLA and interleukin1gene polymorphsims in primary biliary cirrhosis:associations with disease proˉgression and disease suseptibility.Gut，2000，48:397-402.
, http://www.100md.com
6 Czaja AJ，Santrah PJ，Breanndan MS.Shared genetic risk factors in auˉtoimmune liver disease.Dig Dis Sci，2001，46:140-147.
作者单位:200052上海解放军第85医院检验科
上海第二军医大学长征医院全军临床免疫中心
广州中山医科大学法医病理教研室
上海工程技术大学基础部
(编辑李 木), http://www.100md.com(姜小华 仲人前 方晓云 安 峰 胡 寅 孙建文 孔)
关键词 肝硬化 胆汁性 HLA-DRB1 HLA-DQB1 多聚酶链反应 序列特异性引物 遗传易感性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)24-3237-02
, 百拇医药
Immunogenetic susceptibility of Chinese patients with primary billary cirrhosis
Jiang Xiaohua，Zhong Renqian，Fang Xiaoyun，et al.
Department of Laboratory Medicine，85th Military Hospital，Shanghai200052.
【Abstract】 Objective To investigate the relation between the susceptibility to primary biliary cirrhosis(PBC)and the polymorphism of HLA-DRB1，DQB1.genes in Chinese.Methods HLA-DRB1，DQB1.gene polymirphism were tested in52PBC patients and43healthy controls using polymerase chain reaction of sequence specific primers(PCR-SSP).Results HLA-DRB1typing by PCR-SSP showed that DR8had a significantly increased frequency among patients with PBC versus healthy control(18.27%versus4.65%;relative risk=5.61， 2 =9.52，P<0.01).No other alleles differed significantly between the two groups.In subtypes of DRB1.08，there was a trend foran inˉcrease in gene frequency of DRB1.0804in patients with PBC versus healthycontrols(10.47%versus5.81%;relaˉtive risk=12.96， 2 =3.29，P<0.01).However，this association is not restricted to any particular，clinically defined subgroups of patients.Conclusion HLA-DRB1.0804may be the susceptible genes of Chinese PBC patients.
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Key words liver cirrhosis biliary HLA-DRB1 HLA-DQB1 Polymerase chain reaction sequence-specific-primer genetic predisposing to disease
原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病，其病因和发病机理尚不完全清楚，目前多认为它是典型的自身免疫性疾病。PBC患者的一级亲属发生PBC的概率是一般人群的100倍，说明PBC象类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等一样，遗传因素在PBC发病中起重要作用。据文献报道，在高加索人群中，HLA-DRB1ˇ08、DQA1ˇ0401、DQB1ˇ0402是发生PBC的危险因素，并与病情进展相关。因此HLAⅡ类基因可能在PBC易感性中起作用 [1] 。本研究应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术对HLAⅡ类HLA-DRB1、DQB1等位基因进行特异性个体扩增，首次分析了中国PBC患者基因的多态性分布情况。
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1 资料与方法
1.1 研究对象 PBC患者52例均为本研究小组自1998年以来诊断的患者，上海患者18例，外地患者34例。PBC的诊断标准:(1)排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎;(2)肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变(主要是指碱性磷酸酶、谷氨酸转肽酶升高)，且无其它解释(B超检查胆道系统正常)。(3)血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性。(4)肝活检组织学符合PBC表现 [2～4] 。对照组为体检健康者43例，其中男13例，女30例，年龄(32±6.2)岁，家族一、二级亲属中无肝病或自身免疫病史。
1.2 材料 白细胞DNA由本实验室制备。蛋白酶K，TaqDNA多聚酶，SSPDRB1、SSPDQB1分型试剂盒，微量SSP特异等位基因DRB1ˇ08试剂盒购自美国One Lamda公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 基因DNA提取 取血5ml，加入3倍体积的红细胞裂解液(含10mmol/L Tris，5mmol/LMgCl 2 ，10mmol/L NaCl，pH7.6～8.0)，2000×g离心10min，重复1次，向沉淀物中加入4ml白细胞裂解液(含50mmol/L Tris，20mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5%SDS，pH7.4)，20%SDS100μl，蛋白酶K200μg/ml，70℃10min，酚抽提2次，酚/氯仿抽提2次，加入氯化钠至0.3mol/L，2倍体积乙醇沉淀DNA，-20℃保存备用。
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1.4 PCR-SSP 采用高精密度序列特异性引物多聚酶链式反应(PCR-SSP)对样品的DRB1和DQB1多态性进行分析。采用微量SSP特异等位基因PCR-SSP分析DRB1ˇ08的亚型。PCR反应体系:50μl PCR反应缓冲液(含50mmol/L Tris/HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，50mmol/L MgCl 2 )，含4种200μmol/L的dNTP，一对引物各为1μmol/L，1μg待扩增DNA，混合后于94℃5min进行变性。而后加入TaqDNA酶1.5U，混匀后加入50μl液体石蜡油以防止水分蒸发，扩增反应进行30～35个循环。反应条件:94℃1min，55℃1min，72℃2min，最后一次循环，72℃10min以保证延伸反应充分完成。将上述PCR反应产物取10μl于2%琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳后将凝胶置于溴乙啶溶液(0.5μg/ml)中染色20min，然后于紫外灯下观察结果。
1.5 统计学方法 基因频率采用基因计数法计算;组间等位基因频率比较采用χ 2 检验，相对危险度(relative risk，RR)用以评价关联的强度。
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2 结果
2.1 HLA-DRBˇ1、DQB1的等位基因分析 HLA-DRB1、DQB1的等位基因频率见表1。以PCR-SSP进行的基因分型表明DRBˇ1.08的基因频率在PBC患者中较健康对照组显著增高(18.27%与4.65%;RR=5.61，χ 2 =9.52，P<0.01)。未见其他等位基因与PBC有显著相关性。进而采用微量SSP特异等位基因DRB1ˇ08试剂盒对HLA-DRB1.08进行亚型分析。DRB1ˇ08亚型中，PBC患者中的DRB1ˇ0804较正常对照组有显著增加趋势(10.47%与5.81%;RR=3.29，χ 2 =12.96，P<0.01)(表2)。提示DRB1.08、DRB1ˇ0804与PBC易感性高度相关。
2.2 DRB1ˇ08与PBC患者临床表现相关性分析 综合PBC患者的临床资料，未发现基因频率与疾病进程、复发和治疗之间的关系。
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表1 HLA-DRB1/DQB1等位基因频率
注: ˇ RR=5.61，χ 2 =9.52，P<0.01
表2 HLA-DR8等位基因亚型的基因频率
注: ˇ RR=3.29，χ 2 =12.96，P<0.01
3 讨论
人类白细胞抗原(HLA)系统由功能有别的多基因座及共显性复等位基因组成，在抗原识别与递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面起着重要的作用。HLA与多数自身免疫性疾病如类风湿、胰岛素依赖性糖尿病、系统性红斑狼疮等相关，构成重要的易感性。PBC在一般人群中流行率为10～200/100万，而PBC患者第一代亲属PBC发生率为4%～6%，因此PBC患者在第一代亲属PBC发病率比一般人群几乎高100倍，比其他任何自身免疫疾病要高，显示遗传在PBC发病上的重要性。近年来国外报道与PBC易感性相关的分子有DR W 3、DR2、C4B2、DR W 8、DQ W 3、C4AQ0、DR3、DQ3、DQB1、DRB3等 [5，6] 。以前一直认为PBC在中国罕见，2001年以前仅有零星的个案报道，未见中国PBC患者HLA遗传易感基因相关研究报道。我们四年来的研究与2002年国内有关报道提示:PBC在中国可能并不少见 [4] 。
, 百拇医药
本研究选择4年来我们研究小组陆续诊断的52例PBC患者，首次对中国PBC患者的HLA基因进行了分析，结果显示PBC患者中DRB1.08，DRB1.0804的频率分别18.27%、10.47%，经χ 2 分析，与正常对照组相比差异有显著性，提示中国人群中DRB1.08、DRB1.0804与PBC易感性高度相关。关于HLA基因位点与PBC相关性的研究尚未得到一致的结果，部分原因可能是方法、选择病例等方面存在差异，也有可能是人种、地域、民族等引起的实质差异。我们也认识到DRB1、DQB1基因对疾病的易感性并非绝对，本研究仅分析了HLA-DRB1、DQB1基因两个位点，只有对其大多数位点的多态性及有关单倍型进行全面分析，才能较客观地确定HLA-Ⅱ类基因与PBC的相关性。
参考文献
1 姜小华，仲人前，孔宪涛.原发性胆汁性肝硬化发病机制研究进展.中国免疫学杂志，2002，18:586-589.
, http://www.100md.com
2 姜小华，仲人前，孔宪涛，等.利用重组M2三联体抗原建立PBC特异性免疫学检测方法.中华检验医学杂志，2002，26:93-97.
3 姜小华，仲人前，范列英，等.M2自身抗原及其三联体的克隆表达与初步鉴定.中华消化杂志，2001，21:530-533.
4 姜小华，仲人前，孔宪涛，等.用人源M2三联体靶抗原检测抗体诊断原发性胆汁性肝硬化价值探讨.中华肝脏病杂志，2002，10:341-343.
5 Donaldson P，Agarwal K，Craggs A，et al.HLA and interleukin1gene polymorphsims in primary biliary cirrhosis:associations with disease proˉgression and disease suseptibility.Gut，2000，48:397-402.
, http://www.100md.com
6 Czaja AJ，Santrah PJ，Breanndan MS.Shared genetic risk factors in auˉtoimmune liver disease.Dig Dis Sci，2001，46:140-147.
作者单位:200052上海解放军第85医院检验科
上海第二军医大学长征医院全军临床免疫中心
广州中山医科大学法医病理教研室
上海工程技术大学基础部
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