脑缺血基因治疗的研究
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)03-0193-03
基因治疗作为一种新的具有很大应用潜力的治疗方法，在遗传性疾病、心血管疾病和肿瘤的治疗中取得了较好的效果，近年来在脑缺血的治疗中也积累了丰富的经验。
1 脑血管病的流行病学 [1]
随着当今社会的老龄化，脑血管病发病率不断增高，是目前公认为危害人类健康最重要的疾病之一。在联合国世界卫生组织调查的57个国家中死于脑血管病者占11.3%，其中40个国家脑血管病占死因前三位。世界平均发病率为150～200万/(10万人口·年)，患病率为500～600万/(10万人口·年)，全世界按50亿人口算，大约有2500～3000万病人。在我国死于脑血管病者多于心脏病及癌症，居三大死因首位。我国标化的发病率为120～180万/(10万人口·年)，患病率为429万/(10万人口·年)，大约有500～600万病人，而缺血性脑梗塞占全部脑血管病的60%～80%，它具有高发病率、高致残率及高复发率的特点。脑梗塞造成大量的残疾人群，带来了沉重的社会及经济负担，所以日益受到政府和医学界的重视。在神经药理学和神经病理生理学取得了很多进展，但是脑缺血的治疗效果还不理想，仍然迫切需要研究新的治疗方法。
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2 脑缺血的病理生理 [2]
缺血性脑损害的重要病理生理机制是多方面的:(1)能量耗竭:糖酵解增加，ATP生成不足。(2)酸中毒:细胞缺血、缺氧后能量耗竭，无糖酵解增加，产生大量的乳酸，pH下降。(3)兴奋性氨基酸的毒性作用:脑缺血时兴奋性氨基酸递质增多，包括谷氨酸、天门冬氨酸和其它酸性氨基酸。(4)细胞离子失衡:由于能量耗竭使细胞能量依赖性离子泵功能衰竭，加上细胞膜通透性增高使Na + /K + ，Ca 2+ /H + 交换受阻，Na + 、Ca 2+ 大量进入细胞内，细胞外K + 增多，细胞内钙超载，激活多种钙依赖性酶。(5)自由基损伤:缺血状态下自由基大量产生，体内超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，导致细胞膜脂质过氧化，膜通透性增加。(6)炎症反应:缺血再灌注时，最早的反应是缺血区白细胞聚集及炎症细胞因子释放。此外，脑内缺血的反应不仅在于激活杀伤神经元的离子通道、受体和化学反应，而且通过快速诱导基因表达和蛋白质合成等机制来抵抗导致细胞死亡的病理生理反应，为通过改变基因的表达治疗脑缺血提供了依据。
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3 基因治疗的载体
载体是基因治疗最主要的制约因素，理想的载体应该是可以将基因转移到特定的细胞或组织中，不引起免疫和炎症反应，不会引起潜在的基因突变，而且基因的表达能得到有效的控制。目前用于基因治疗的载体都达不到这种理想的要求，尤其对于中枢神经系统的基因治疗很难获得较为有效的基因转染。基因治疗常用载体特点见表1。
表1 基因治疗常用载体的特点
注:AAV，adeno-associated virus，herpes simplex virus;HVJ，hemagglutinating virus of Japan
从表1中比较了常用于基因治疗载体的特点，它们各有优缺点，在这些载体中最常用于脑缺血基因治疗的载体是HSV，AAV和腺病毒 [3] 。HSV具有嗜神经性，但复制缺陷型HSV的生产过程中容易污染野生型病毒。AAV可以将治疗基因整合到靶细胞的染色体上，表达时间较长，但有可能发生基因突变，且病毒不易生产;腺病毒转染率高，宿主范围广，突变的可能性低，易于生产，但机体容易产生免疫反应，而中枢神经系统是一个免疫获免区。因此，腺病毒在脑缺血的基因治疗中会更有发展潜力，最近日本采用一种新的病毒HVJ包装基因，经脂质体包裹后用于转染基因，在治疗中也取得了较好的效果。
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4 治疗的靶基因
4.1 神经营养因子基因 根据体内外的实验，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)对神经元有很好的保护作用。早在1995年，Pechan等 [4] 就将遗传修饰后能分泌NGF的成纤维细胞移植到大鼠海马内，可以减轻全脑缺血引起的CA1神经元损伤。后来Andsberg等[5] 把携带NGF的AAV注射到大鼠海马内，能明显增加局灶性缺血30min后神经元的存活，对缺血造成的运动功能障碍也有一定程度的改善。NGF的受体P75是一种酪氨酸激酶，脑缺血可诱导它的表达增强，与NGF结合后产生保护性的调控机制，促进过氧化氢酶表达、神经元的分化和轴突的形成。另一种对神经元有保护作用的因子是胶质细胞源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，属转化生长因子β超家族成员，它对多种原因引起的神经损害都有很好的保护作用。大鼠右侧大脑中动脉阻塞(Middle cereˉbral artery occlusion，MCAO)造成局灶性缺血90min后，皮质注射携带GDNF的AAV，可以减少大脑皮质的梗死体积 [6] ;以腺病毒为载体，GDNF也能减轻局灶性缺血引起的皮质和纹状体神经元损伤 [7～9] 。GDNF可以减少caspase-3的激活，从而抑制神经元的凋亡。此外睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF) [8] 和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF) [5] ，对缺血引起的纹状体损伤也有保护作用。
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4.2 抗凋亡基因 迟发性凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，抗凋亡基因bcl-2是该基因家族中的代表，1995年Linnik等 [10] 用HSV作为载体将它注入MCAO大鼠脑皮质，24h后，观察到注射部位神经细胞凋亡明显减少。Lawrence MS等 [11] 在大鼠局灶性缺血1h，再灌注0.5h后，纹状体给予携带bcl-2的HSV，仍然可以起到保护作用。该家族成员的bcl-x(1)和bcl-w对局灶性缺血引起的纹状体和皮质的损伤也有较好的预防作用 [12，13] ，能减少神经元的凋亡和梗死面积。短暂脑缺血能上调神经凋亡抑制蛋白(Neuronal apoptosis inhibitory protein，NATP)的表达，Xu等 [14] 将其构建到腺病毒载体中，注射到大鼠海马内，能对抗脑缺血性损害，提高存活神经元的数量。
4.3 血管生成基因 脑缺血同其它组织缺血一样，机体会产生保护性代偿机制，诱导促血管生成相关基因的高表达，以促进侧支血管的发生和生长。血管内皮生长因子(Vasˉcularendothelial growth factor，VEGF)在肢体缺血和心肌缺血的基因治疗中，取得了较好的效果。肝细胞生长因子(Hepˉatocyte growth factor，HGF)是另一种促血管生长的细胞因子。Yoshimura等 [15] 把这两种细胞因子构建到HVJ载体中，经脂质体包裹后注射到大鼠蛛网膜下腔，可以增加脑血管阻塞后新生血管的数量和缺血脑区的血流量。此外HVJ-HGF用脂质体包裹后注射到蛛网膜下腔还能抑制缺血引起的沙土鼠海马CA1神经元的迟发性凋亡 [16] 。
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4.4 抗炎基因 缺血再灌注后，在缺血区会发生白细胞聚集及炎症细胞因子释放，而引起脑水肿，进一步加重缺血性损害，神经细胞死亡。MCAO能引起IL-1β表达升高，它对于激活炎症反应起着重要的作用。携带IL-1β受体拮抗蛋白基因的重组腺病毒，注射到小鼠脑室内，可以明显减轻缺血引起的脑水肿，减少梗死面积 [17～19] 。
4.5 其它保护性蛋白基因 机体遭受侵害时产生一系列的应激反应，上调表达一些应激反应蛋白，热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)就是其中之一。HSPs作为分子伴侣，协助蛋白质的正确折叠及转运，并能清除未成熟的蛋白。同样脑缺血时也能诱导HSPs的表达，但是否在脑缺血时有神经保护作用，曾存在着争议。Yenari等 [20] 将表达HSP72的HSV注射到大鼠纹状体，能显著提高MCAO1h神经元的存活率，证明HSP对脑缺血引起的神经细胞损害有保护作用。Hoehn等 [21] 在大鼠MCAO1h再灌注后0.5h和2h，将表达HSP72的HSV注射到纹状体，依然可以使神经元的存活率分别提高23%和15%。脑缺血后细胞内钙超载，而激活许多钙调蛋白也是引起细胞损害的一个重要因素，因此通过降低细胞内的钙水平也能起到减轻神经损害的效果。Yenari等 [22] 把一种细胞内钙结合蛋白(Calbindin D28K，CaBP)构建到HSV载体中，注射到大鼠纹状体，能明显提高动物MCAO1h后神经元的存活率。能量代谢障碍也是造成神经元死亡的重要原因，葡萄糖是神经元最主要和直接的能源物质，Lavrence等[23] 用携带葡萄糖转运蛋白的HSV注射到大鼠纹状体，可以减少MCAO1h造成的神经细胞死亡。花生四烯酸的代谢产物血栓素A 2 、前列腺素E 2 和白三烯能减少缺血后脑血管的血流量、引起脑水肿、炎性反应及神经损害，而另一种代谢产物前列环素却能通过舒 张血管、抑制血小板聚集、白细胞激活以及白细胞与内皮细胞间的相互作用，而保护缺血后的脑损伤。前列环素的环氧合酶-1和前列环素合成酶是合成前列腺素的关键酶，可以抑制花生四烯酸其它代谢产物的生成，Lin等 [24] 将其构建到重组腺病毒载体中，通过大脑侧室给药观察对大鼠MACO60min再灌注后的治疗效果，可以明显增加内前列环素含量，减少白三烯等其它代谢产物，并且明显减少缺血梗死体积。
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5 基因转移的途径及时间性选择
用于脑缺血治疗所采取的基因转染途径主要是脑内注射、脑室注射或血管内给药，脑内注射治疗载体，基因表达的范围局限，仅仅限于注射部位，并且必需在缺血早期给治疗载体，否则神经细胞蛋白合成功能严重受损，或细胞处于濒死时，目的基因就很难表达，也就很难达到较好的治疗效果 [25] ;脑室给药只能转染软脑膜细胞，而很难通过血脑屏障转染脑细胞，但表达的目的蛋白可通过脑脊液扩散到缺血部位，达到治疗目的 [26，27] ;由于血脑屏障的存在，血管内给药，通常很难有效转染血管内皮细胞或脑细胞，除非采取阻断血流的方式，而阻断血流又可能加重缺血带来的损害。近年文献报道由延髓池向蛛网膜下腔注射脂质体包括的HVJ基因载体，也能达到治疗目的 [16] ，如果该方法能得到有效转染治疗，会大大地方便将来临床中枢神经系统基因治疗的实施。脑血管一旦发生阻塞，很快就引起缺血后的病理生理反应，对神经元造成损伤，而且神经元是很难再生的，脑缺血的治疗应该尽可能的快和早，特别是脑内注射治疗基因载体，脑缺血后细胞合成蛋白质的能力严重降低，但是多数基因治疗方案，是先转染治疗基因，然后再对动物脑血管阻塞，观察预防治疗效果，或在动物脑血管阻塞之后即刻进行基因转染，然而对于临床上病人的基因治疗，大多是在脑缺血发生后。因此许多实验又验证了脑缺血发生后多长时间，进行基因治疗是有效的。Zhang等 [9] 报道腺病毒介导GDNF在大鼠MCAO1.5h，再灌注1h后注射至缺血部位，虽然可检测到GDNF蛋白的表达，但却不能减少缺血体积。用HSV作载体，Bcl-2在MCAO1h，再灌注1.5h后注射至缺血部位，仍能起到有效的治疗效果 [11] ，HSP72在MCAO1h，再灌注2h后注射至缺血部位，较对照减少15%的缺血区，再灌注5h后注射，对神经细胞的损害就没有保护作用了 [21] 。由于缺血程度的不同、载体的不同及治疗基因的差异，得到的结果也各不相同。但是上述结果表明，如果临床病人发生脑卒中后，经溶栓等相关治疗的同时，给予基因治疗对于缓解病情，减轻缺血引起的神经损害是可行的。
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随着脑缺血基因治疗动物实验的广泛开展和不断完善，以及基因治疗技术的不断改进，相信不久将会走向临床应用。
参考文献
1 张国瑾，赵增荣.国外脑血管疾病研究进展.北京:中国医药科技出版社，2000，177-197.
2 李惠.缺血性脑血管疾病.北京:北京科学技术出版社，2002，47-57.
3 Cone therapy for ischemic brain diseases.Curr Gene Ther，2003，3(1):49-58.
4 Pcchan PA，Yoabida T，Panahlzn N，et al.Genotically raodifiod fibrobˉlasts producing NGF protect hippocampal ssarons after ischemia in the rat.Neuroreport，1995，6(4):669-672.
, http://www.100md.com
5 Andsberg G，Koksia Z，Klein RL，et al.Neuropathological and behavioral ceasequences of adeno-associated viral vector-mediated continuous intrastriatal neurotrophin delivery in a focal ischemia model in rats.Neuˉrobiol Dis，2002，9(2):187-204.
6 Tsai TH，Chen SL，chiang YH，et al.Recombinant adeno associated virus vector expressing glial cell line-derived neurotrophic factor reduces isˉchemia-induced dlamage.Exp Neurol，2000，166(2):266-275.
, 百拇医药
7 Iwai M，Abe K，Kitagawa H，et al.Gene therapywith adenovirus-mediˉated glial cell line-derived neurotrophic factor and neural stem cells activation afterischemic brain injury.Hum Cell，2001，14(1):27-38.
8 Hermann DM，Kilic E，Kugler S，et al.Adenovirus-mediated GDNF and CNTF pretreatment protects against striatal injury following transient middle cerebral artery occlusion in mice.Neurobiol Dis，2001，8(4):655-666.
9 Zhang WR，Sato K，Iwai M，et al.Therapeutic time window of adenovirus-mediated GDNF gene transfer after transient middle cerebral artery occlusion in rat.Brain Res，2002，947(1):140-145.
, 百拇医药
10 LinnikMD，Zahos P，GeschwindMD，et al.Expression of bcl-2from a defectiveherpes simplex virus-1vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia.Stroke，1995，26(9):1670-1674.
11 Lawrence MS，McLaughlin JR，Sun GH，et al.Herpes simplex viral vecˉtors expressing Bcl-2are neuroprotective when delivered after a stroke.J Cereb Blood FlowMetab，1997，17(7):740-744.
12 Kilic E，Hermann DM，Kugler S，et al.Adenovirus-mediated Bcl-X(L)expression using a neuron-specific synapsin-1promoter protects against disseminated neuronal injury and brain infarction following focal cerebral ischemia in mice.Neurobiol Dis，2002，11(2):275-284.
, 百拇医药
13 Sun Y，Jin K，Clark KR，et al.Adeno-associated virus-mediated deˉlivery of BCL-w gene improves outcome after transient focal cerebral ischemia.Gene Ther，2003，10(2):115-122.
14 Xu DG，Crocker SJ，Doucet JP，et al.Elevation of neuronal expression of NAIP reduces ischemic damage in the rat hippocampus.Nat Med，1997，3(9):997-1004.
15 Yoshimura S，Morishita R，Hayashi K，et al.Gene transfer of hepatocyte growth factor to subarachnoid space in cerebral hypoperfusion model.Hypertension，2002，39(5):1028-1034.
, http://www.100md.com
16 Hayashi K，Morishita R，Nakagami H，et al.Gene therapy for preventˉing neuronal death using hepatocyte growth factor:in vivo gene transferof HGF to subarachnoid space prevents delayed neuronal death in gerbil hippocampal CA1neurons.Gene ther，2001，8:1167-1173.
17 Yang GY，Zhao YJ，Davidson BL，et al.Overexpression of interleukin-1receptor antagonist in the mouse brain reduces ischemic brain injury.Brain Res，1997，751(2):181-188.
18 Yang GY，Liu XH，Kadoya C，et al.Attenuation of ischemic inflammaˉtory response in mouse brain using an adenoviral vector to induce ovexˉpression of interleukin-1receptor antagonist.J Cereb Blood Flow Metab，1997，18(8):840-847.
, http://www.100md.com
19 Yang GY，Mao Y，Zhou LF，et al.Attenuation of temporary focal cereˉbral ischemic injury in the mouse following transfection with interleukin-1receptor antagonist.Brain Res Mol Brain Res，1999，72(2):129-137.
20 Yenari MA，Fink SL，Sun GH，et al.Gene therapy with HSP72is neuˉroprotective in rat models of stroke and epilepsy.Ann Neurol，1998，44(4):584-591.
21 Hoehn B，Ringer TM，Xu L，et al.Overexpresion of HSP72after inducˉtion of experimental stroke protects neurons from ischemic damage.J Cereb Blood FlowMetab，2001，21(11):1303-1309.
, http://www.100md.com
22 Yenari MA，Minami M，Sun GH，et al.Calbindin d28k overexpression protectsstriatal neurons from transient focal cerebral ischemia.Stroke，2001，32(4):1028-1035.
23 Lawrence MS，Sun GH，Kunis DM，et al.Overexpression of the glucose transporter gene with a herpes simplex viral vector protects striatal neuˉrons against stroke.J Cereb Blood Flow Metab，1996，16(2):181-185.
24 Lin H，Lin TN，Cheung WM，et al.Cyclooxygenase-1and bicistronic cyclooxygenase-1/prostacyclin synthase gene transfer protect against ischemic cerebral infarction.Circulation，2002，105(16):1962-1969.
, http://www.100md.com
25 Mies G，Kohno K，Hossmann KA.MK-801，aglutamate antagonist，lowers flow threshold for inhibition of protein synthesis after middle cerebral artery occlusion of rat.Neurosci Lett，1993，155:65-68.
26 Ooboshe H，Welsh MJ，Rios CD，et al.Adenovirus-mediated gene transfer in vivo to cerebral blood vessels and perivascular tissue.Cirus Res，1995，77:7-13.
27 Betz AL，Yang GY，Davidson BL.Attenuation of stroke size in rats usˉing an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1reˉceptor antagnonist in brain.J Cereb Blood Flow Metab，1995，15:547-551.
(收稿日期:2003-05-24)(编辑 小川), http://www.100md.com(靳继德)
基因治疗作为一种新的具有很大应用潜力的治疗方法，在遗传性疾病、心血管疾病和肿瘤的治疗中取得了较好的效果，近年来在脑缺血的治疗中也积累了丰富的经验。
1 脑血管病的流行病学 [1]
随着当今社会的老龄化，脑血管病发病率不断增高，是目前公认为危害人类健康最重要的疾病之一。在联合国世界卫生组织调查的57个国家中死于脑血管病者占11.3%，其中40个国家脑血管病占死因前三位。世界平均发病率为150～200万/(10万人口·年)，患病率为500～600万/(10万人口·年)，全世界按50亿人口算，大约有2500～3000万病人。在我国死于脑血管病者多于心脏病及癌症，居三大死因首位。我国标化的发病率为120～180万/(10万人口·年)，患病率为429万/(10万人口·年)，大约有500～600万病人，而缺血性脑梗塞占全部脑血管病的60%～80%，它具有高发病率、高致残率及高复发率的特点。脑梗塞造成大量的残疾人群，带来了沉重的社会及经济负担，所以日益受到政府和医学界的重视。在神经药理学和神经病理生理学取得了很多进展，但是脑缺血的治疗效果还不理想，仍然迫切需要研究新的治疗方法。
, 百拇医药
2 脑缺血的病理生理 [2]
缺血性脑损害的重要病理生理机制是多方面的:(1)能量耗竭:糖酵解增加，ATP生成不足。(2)酸中毒:细胞缺血、缺氧后能量耗竭，无糖酵解增加，产生大量的乳酸，pH下降。(3)兴奋性氨基酸的毒性作用:脑缺血时兴奋性氨基酸递质增多，包括谷氨酸、天门冬氨酸和其它酸性氨基酸。(4)细胞离子失衡:由于能量耗竭使细胞能量依赖性离子泵功能衰竭，加上细胞膜通透性增高使Na + /K + ，Ca 2+ /H + 交换受阻，Na + 、Ca 2+ 大量进入细胞内，细胞外K + 增多，细胞内钙超载，激活多种钙依赖性酶。(5)自由基损伤:缺血状态下自由基大量产生，体内超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，导致细胞膜脂质过氧化，膜通透性增加。(6)炎症反应:缺血再灌注时，最早的反应是缺血区白细胞聚集及炎症细胞因子释放。此外，脑内缺血的反应不仅在于激活杀伤神经元的离子通道、受体和化学反应，而且通过快速诱导基因表达和蛋白质合成等机制来抵抗导致细胞死亡的病理生理反应，为通过改变基因的表达治疗脑缺血提供了依据。
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3 基因治疗的载体
载体是基因治疗最主要的制约因素，理想的载体应该是可以将基因转移到特定的细胞或组织中，不引起免疫和炎症反应，不会引起潜在的基因突变，而且基因的表达能得到有效的控制。目前用于基因治疗的载体都达不到这种理想的要求，尤其对于中枢神经系统的基因治疗很难获得较为有效的基因转染。基因治疗常用载体特点见表1。
表1 基因治疗常用载体的特点
注:AAV，adeno-associated virus，herpes simplex virus;HVJ，hemagglutinating virus of Japan
从表1中比较了常用于基因治疗载体的特点，它们各有优缺点，在这些载体中最常用于脑缺血基因治疗的载体是HSV，AAV和腺病毒 [3] 。HSV具有嗜神经性，但复制缺陷型HSV的生产过程中容易污染野生型病毒。AAV可以将治疗基因整合到靶细胞的染色体上，表达时间较长，但有可能发生基因突变，且病毒不易生产;腺病毒转染率高，宿主范围广，突变的可能性低，易于生产，但机体容易产生免疫反应，而中枢神经系统是一个免疫获免区。因此，腺病毒在脑缺血的基因治疗中会更有发展潜力，最近日本采用一种新的病毒HVJ包装基因，经脂质体包裹后用于转染基因，在治疗中也取得了较好的效果。
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4 治疗的靶基因
4.1 神经营养因子基因 根据体内外的实验，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)对神经元有很好的保护作用。早在1995年，Pechan等 [4] 就将遗传修饰后能分泌NGF的成纤维细胞移植到大鼠海马内，可以减轻全脑缺血引起的CA1神经元损伤。后来Andsberg等[5] 把携带NGF的AAV注射到大鼠海马内，能明显增加局灶性缺血30min后神经元的存活，对缺血造成的运动功能障碍也有一定程度的改善。NGF的受体P75是一种酪氨酸激酶，脑缺血可诱导它的表达增强，与NGF结合后产生保护性的调控机制，促进过氧化氢酶表达、神经元的分化和轴突的形成。另一种对神经元有保护作用的因子是胶质细胞源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，属转化生长因子β超家族成员，它对多种原因引起的神经损害都有很好的保护作用。大鼠右侧大脑中动脉阻塞(Middle cereˉbral artery occlusion，MCAO)造成局灶性缺血90min后，皮质注射携带GDNF的AAV，可以减少大脑皮质的梗死体积 [6] ;以腺病毒为载体，GDNF也能减轻局灶性缺血引起的皮质和纹状体神经元损伤 [7～9] 。GDNF可以减少caspase-3的激活，从而抑制神经元的凋亡。此外睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF) [8] 和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF) [5] ，对缺血引起的纹状体损伤也有保护作用。
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4.2 抗凋亡基因 迟发性凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，抗凋亡基因bcl-2是该基因家族中的代表，1995年Linnik等 [10] 用HSV作为载体将它注入MCAO大鼠脑皮质，24h后，观察到注射部位神经细胞凋亡明显减少。Lawrence MS等 [11] 在大鼠局灶性缺血1h，再灌注0.5h后，纹状体给予携带bcl-2的HSV，仍然可以起到保护作用。该家族成员的bcl-x(1)和bcl-w对局灶性缺血引起的纹状体和皮质的损伤也有较好的预防作用 [12，13] ，能减少神经元的凋亡和梗死面积。短暂脑缺血能上调神经凋亡抑制蛋白(Neuronal apoptosis inhibitory protein，NATP)的表达，Xu等 [14] 将其构建到腺病毒载体中，注射到大鼠海马内，能对抗脑缺血性损害，提高存活神经元的数量。
4.3 血管生成基因 脑缺血同其它组织缺血一样，机体会产生保护性代偿机制，诱导促血管生成相关基因的高表达，以促进侧支血管的发生和生长。血管内皮生长因子(Vasˉcularendothelial growth factor，VEGF)在肢体缺血和心肌缺血的基因治疗中，取得了较好的效果。肝细胞生长因子(Hepˉatocyte growth factor，HGF)是另一种促血管生长的细胞因子。Yoshimura等 [15] 把这两种细胞因子构建到HVJ载体中，经脂质体包裹后注射到大鼠蛛网膜下腔，可以增加脑血管阻塞后新生血管的数量和缺血脑区的血流量。此外HVJ-HGF用脂质体包裹后注射到蛛网膜下腔还能抑制缺血引起的沙土鼠海马CA1神经元的迟发性凋亡 [16] 。
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4.4 抗炎基因 缺血再灌注后，在缺血区会发生白细胞聚集及炎症细胞因子释放，而引起脑水肿，进一步加重缺血性损害，神经细胞死亡。MCAO能引起IL-1β表达升高，它对于激活炎症反应起着重要的作用。携带IL-1β受体拮抗蛋白基因的重组腺病毒，注射到小鼠脑室内，可以明显减轻缺血引起的脑水肿，减少梗死面积 [17～19] 。
4.5 其它保护性蛋白基因 机体遭受侵害时产生一系列的应激反应，上调表达一些应激反应蛋白，热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)就是其中之一。HSPs作为分子伴侣，协助蛋白质的正确折叠及转运，并能清除未成熟的蛋白。同样脑缺血时也能诱导HSPs的表达，但是否在脑缺血时有神经保护作用，曾存在着争议。Yenari等 [20] 将表达HSP72的HSV注射到大鼠纹状体，能显著提高MCAO1h神经元的存活率，证明HSP对脑缺血引起的神经细胞损害有保护作用。Hoehn等 [21] 在大鼠MCAO1h再灌注后0.5h和2h，将表达HSP72的HSV注射到纹状体，依然可以使神经元的存活率分别提高23%和15%。脑缺血后细胞内钙超载，而激活许多钙调蛋白也是引起细胞损害的一个重要因素，因此通过降低细胞内的钙水平也能起到减轻神经损害的效果。Yenari等 [22] 把一种细胞内钙结合蛋白(Calbindin D28K，CaBP)构建到HSV载体中，注射到大鼠纹状体，能明显提高动物MCAO1h后神经元的存活率。能量代谢障碍也是造成神经元死亡的重要原因，葡萄糖是神经元最主要和直接的能源物质，Lavrence等[23] 用携带葡萄糖转运蛋白的HSV注射到大鼠纹状体，可以减少MCAO1h造成的神经细胞死亡。花生四烯酸的代谢产物血栓素A 2 、前列腺素E 2 和白三烯能减少缺血后脑血管的血流量、引起脑水肿、炎性反应及神经损害，而另一种代谢产物前列环素却能通过舒 张血管、抑制血小板聚集、白细胞激活以及白细胞与内皮细胞间的相互作用，而保护缺血后的脑损伤。前列环素的环氧合酶-1和前列环素合成酶是合成前列腺素的关键酶，可以抑制花生四烯酸其它代谢产物的生成，Lin等 [24] 将其构建到重组腺病毒载体中，通过大脑侧室给药观察对大鼠MACO60min再灌注后的治疗效果，可以明显增加内前列环素含量，减少白三烯等其它代谢产物，并且明显减少缺血梗死体积。
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5 基因转移的途径及时间性选择
用于脑缺血治疗所采取的基因转染途径主要是脑内注射、脑室注射或血管内给药，脑内注射治疗载体，基因表达的范围局限，仅仅限于注射部位，并且必需在缺血早期给治疗载体，否则神经细胞蛋白合成功能严重受损，或细胞处于濒死时，目的基因就很难表达，也就很难达到较好的治疗效果 [25] ;脑室给药只能转染软脑膜细胞，而很难通过血脑屏障转染脑细胞，但表达的目的蛋白可通过脑脊液扩散到缺血部位，达到治疗目的 [26，27] ;由于血脑屏障的存在，血管内给药，通常很难有效转染血管内皮细胞或脑细胞，除非采取阻断血流的方式，而阻断血流又可能加重缺血带来的损害。近年文献报道由延髓池向蛛网膜下腔注射脂质体包括的HVJ基因载体，也能达到治疗目的 [16] ，如果该方法能得到有效转染治疗，会大大地方便将来临床中枢神经系统基因治疗的实施。脑血管一旦发生阻塞，很快就引起缺血后的病理生理反应，对神经元造成损伤，而且神经元是很难再生的，脑缺血的治疗应该尽可能的快和早，特别是脑内注射治疗基因载体，脑缺血后细胞合成蛋白质的能力严重降低，但是多数基因治疗方案，是先转染治疗基因，然后再对动物脑血管阻塞，观察预防治疗效果，或在动物脑血管阻塞之后即刻进行基因转染，然而对于临床上病人的基因治疗，大多是在脑缺血发生后。因此许多实验又验证了脑缺血发生后多长时间，进行基因治疗是有效的。Zhang等 [9] 报道腺病毒介导GDNF在大鼠MCAO1.5h，再灌注1h后注射至缺血部位，虽然可检测到GDNF蛋白的表达，但却不能减少缺血体积。用HSV作载体，Bcl-2在MCAO1h，再灌注1.5h后注射至缺血部位，仍能起到有效的治疗效果 [11] ，HSP72在MCAO1h，再灌注2h后注射至缺血部位，较对照减少15%的缺血区，再灌注5h后注射，对神经细胞的损害就没有保护作用了 [21] 。由于缺血程度的不同、载体的不同及治疗基因的差异，得到的结果也各不相同。但是上述结果表明，如果临床病人发生脑卒中后，经溶栓等相关治疗的同时，给予基因治疗对于缓解病情，减轻缺血引起的神经损害是可行的。
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随着脑缺血基因治疗动物实验的广泛开展和不断完善，以及基因治疗技术的不断改进，相信不久将会走向临床应用。
参考文献
1 张国瑾，赵增荣.国外脑血管疾病研究进展.北京:中国医药科技出版社，2000，177-197.
2 李惠.缺血性脑血管疾病.北京:北京科学技术出版社，2002，47-57.
3 Cone therapy for ischemic brain diseases.Curr Gene Ther，2003，3(1):49-58.
4 Pcchan PA，Yoabida T，Panahlzn N，et al.Genotically raodifiod fibrobˉlasts producing NGF protect hippocampal ssarons after ischemia in the rat.Neuroreport，1995，6(4):669-672.
, http://www.100md.com
5 Andsberg G，Koksia Z，Klein RL，et al.Neuropathological and behavioral ceasequences of adeno-associated viral vector-mediated continuous intrastriatal neurotrophin delivery in a focal ischemia model in rats.Neuˉrobiol Dis，2002，9(2):187-204.
6 Tsai TH，Chen SL，chiang YH，et al.Recombinant adeno associated virus vector expressing glial cell line-derived neurotrophic factor reduces isˉchemia-induced dlamage.Exp Neurol，2000，166(2):266-275.
, 百拇医药
7 Iwai M，Abe K，Kitagawa H，et al.Gene therapywith adenovirus-mediˉated glial cell line-derived neurotrophic factor and neural stem cells activation afterischemic brain injury.Hum Cell，2001，14(1):27-38.
8 Hermann DM，Kilic E，Kugler S，et al.Adenovirus-mediated GDNF and CNTF pretreatment protects against striatal injury following transient middle cerebral artery occlusion in mice.Neurobiol Dis，2001，8(4):655-666.
9 Zhang WR，Sato K，Iwai M，et al.Therapeutic time window of adenovirus-mediated GDNF gene transfer after transient middle cerebral artery occlusion in rat.Brain Res，2002，947(1):140-145.
, 百拇医药
10 LinnikMD，Zahos P，GeschwindMD，et al.Expression of bcl-2from a defectiveherpes simplex virus-1vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia.Stroke，1995，26(9):1670-1674.
11 Lawrence MS，McLaughlin JR，Sun GH，et al.Herpes simplex viral vecˉtors expressing Bcl-2are neuroprotective when delivered after a stroke.J Cereb Blood FlowMetab，1997，17(7):740-744.
12 Kilic E，Hermann DM，Kugler S，et al.Adenovirus-mediated Bcl-X(L)expression using a neuron-specific synapsin-1promoter protects against disseminated neuronal injury and brain infarction following focal cerebral ischemia in mice.Neurobiol Dis，2002，11(2):275-284.
, 百拇医药
13 Sun Y，Jin K，Clark KR，et al.Adeno-associated virus-mediated deˉlivery of BCL-w gene improves outcome after transient focal cerebral ischemia.Gene Ther，2003，10(2):115-122.
14 Xu DG，Crocker SJ，Doucet JP，et al.Elevation of neuronal expression of NAIP reduces ischemic damage in the rat hippocampus.Nat Med，1997，3(9):997-1004.
15 Yoshimura S，Morishita R，Hayashi K，et al.Gene transfer of hepatocyte growth factor to subarachnoid space in cerebral hypoperfusion model.Hypertension，2002，39(5):1028-1034.
, http://www.100md.com
16 Hayashi K，Morishita R，Nakagami H，et al.Gene therapy for preventˉing neuronal death using hepatocyte growth factor:in vivo gene transferof HGF to subarachnoid space prevents delayed neuronal death in gerbil hippocampal CA1neurons.Gene ther，2001，8:1167-1173.
17 Yang GY，Zhao YJ，Davidson BL，et al.Overexpression of interleukin-1receptor antagonist in the mouse brain reduces ischemic brain injury.Brain Res，1997，751(2):181-188.
18 Yang GY，Liu XH，Kadoya C，et al.Attenuation of ischemic inflammaˉtory response in mouse brain using an adenoviral vector to induce ovexˉpression of interleukin-1receptor antagonist.J Cereb Blood Flow Metab，1997，18(8):840-847.
, http://www.100md.com
19 Yang GY，Mao Y，Zhou LF，et al.Attenuation of temporary focal cereˉbral ischemic injury in the mouse following transfection with interleukin-1receptor antagonist.Brain Res Mol Brain Res，1999，72(2):129-137.
20 Yenari MA，Fink SL，Sun GH，et al.Gene therapy with HSP72is neuˉroprotective in rat models of stroke and epilepsy.Ann Neurol，1998，44(4):584-591.
21 Hoehn B，Ringer TM，Xu L，et al.Overexpresion of HSP72after inducˉtion of experimental stroke protects neurons from ischemic damage.J Cereb Blood FlowMetab，2001，21(11):1303-1309.
, http://www.100md.com
22 Yenari MA，Minami M，Sun GH，et al.Calbindin d28k overexpression protectsstriatal neurons from transient focal cerebral ischemia.Stroke，2001，32(4):1028-1035.
23 Lawrence MS，Sun GH，Kunis DM，et al.Overexpression of the glucose transporter gene with a herpes simplex viral vector protects striatal neuˉrons against stroke.J Cereb Blood Flow Metab，1996，16(2):181-185.
24 Lin H，Lin TN，Cheung WM，et al.Cyclooxygenase-1and bicistronic cyclooxygenase-1/prostacyclin synthase gene transfer protect against ischemic cerebral infarction.Circulation，2002，105(16):1962-1969.
, http://www.100md.com
25 Mies G，Kohno K，Hossmann KA.MK-801，aglutamate antagonist，lowers flow threshold for inhibition of protein synthesis after middle cerebral artery occlusion of rat.Neurosci Lett，1993，155:65-68.
26 Ooboshe H，Welsh MJ，Rios CD，et al.Adenovirus-mediated gene transfer in vivo to cerebral blood vessels and perivascular tissue.Cirus Res，1995，77:7-13.
27 Betz AL，Yang GY，Davidson BL.Attenuation of stroke size in rats usˉing an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1reˉceptor antagnonist in brain.J Cereb Blood Flow Metab，1995，15:547-551.
(收稿日期:2003-05-24)(编辑 小川), http://www.100md.com(靳继德)
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