节制饮食对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的预防作用
【摘要】 目的 探讨节制饮食对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的预防作用。方法 雄性SD大鼠30只，随机分为2组。模型组10只以高脂饮食(普通饲料+20g/kg胆固醇+100g/kg猪油)喂养;预防组10只，高脂饮食喂养8周后恢复普通饲料喂养，但仅给予正常需要量的2/3，于第16周处死。处死后称量体重、肝湿重及脂肪重量，计算肝指数(肝湿重/体重);测定肝功能，肝匀浆和血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及游离脂肪酸(FFA);病理切片行HE染色观察肝细胞脂肪变性及炎症程度变化。结果 预防组肝指数、血清和肝匀浆胆固醇水平均显著低于模型组，有统计学意义(P<0.01)，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平较模型组有下降趋势。预防组肝脂肪变性程度和炎症活动度计分较模型组明显好转(P<0.01)。结论 节制饮食对非酒精性脂肪性肝炎有较好的预防效果。
关键词 非酒精性脂肪性肝炎 节制饮食 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)03-0196-03
, http://www.100md.com
Prevention of moderately energy-restricted diet on NASH in rats model
Fang Jiwei，Fan Jiangao，Zhu Jun，et al.
Fatty Liver Research Center，Shanghai First People’s Hospital，Shanghai200080.
【Abstract】 Objective To investigate the prevention of moderately energy-restricted diet on NASH in rats model.Methods 20SD rats were divided into prevention and control groups.10SD rats were fed a fat-rich diet consisted of fat-rich diet，100g/kg lard oil and20g/kg cholesterol.Other10SD rats were also fed with a fat-rich diet for8weeks，and then fed with moderately energy-restricted diet，that was two-thirds normal diet，for another8weeks before sacrificed.These rats were sacrificed at the16week，then the weight of rats，liver and fat were measured，liver index(liver weight/body weight)were gained，and the level of serum liverfunction，the level of triglycerides(TG)，total cholesterol(TCh)，free fatty acid(FFA)both in serum and hepatic tissue.Histopathological changes in liverwere observed under light microscope.Results Liver index，serum and hepatic total cholesterol in moderately energy-restricted diet group rats were lower than that of fat-rich group，with statistical difference，the degrees of hepatocyte steatosis and inflammation score were all improved significantly.Conclusion These results indicate that moderately energy-restricted diet is useful mean of preventing nonalcoholic fatty liver diseases to progress to nonalcoholic steatoˉhepatitis.
, 百拇医药
Key words nonalcoholic steatohepatitis energy-restricted diet rat
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD)可发展为肝纤维化和肝硬化，且必须经过非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)这一病理阶段 [1～3] ，但至今尚无治疗NAFLD的有效药物，并一致认为控制饮食、增加锻炼是治疗该病的首要措施，其中早期干预尤为重要。本研究即观察了节制饮食对NASH的预防作用。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠20只，购自上海西普尔-必凯公司，体重140～160g，正常喂养1周后，随机分为2组。模型组10只予高脂饮食喂养，即普通饲料+20g/kg胆固醇+100g/kg猪油(胆固醇购于上海生化试剂商、猪油自备)，猪油加热熔化后加入胆固醇，然后拌入饲料中;预防组10只，予高脂饮食喂养8周后恢复普通饲料喂养，但仅给予正常需要量的2/3，两组均于第16周处死。称量体重、肝湿重及脂肪重量，计算肝指数(肝湿重/体重);测定肝功能、血清和肝匀浆中TG、TC、FFA，病理切片行HE染色观察肝脂肪变性及炎症程度。
, http://www.100md.com
1.2 方法 实验动物饲养于本院动物中心，动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～29℃，明暗各12h。实验动物自由进食和饮水，5只1笼饲养。大鼠处死前，隔夜禁食，次日称量体重后，以氯胺酮麻醉，腹腔动脉采血处死，称取肝脏湿重和腹腔脂肪重量，并从肝右叶中部切取2块肝组织，分别用于制备石蜡切片和肝匀浆。
1.2.1 观测指标 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)和肝匀浆TG、TC、FFA均采用全自动生化分析仪检测。游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒购自于和光纯业株式会社NEFA/HA-2(编号为HM033)。
1.2.2 肝匀浆制备 取0.2g肝组织，剪碎，加入冰生理盐水至总体积2ml，用匀浆机磨成10%肝匀浆，3500rpm离心10min，取上清。
1.3 病理学检查 切取小块肝组织，用40g/L甲醛固定后制备石蜡切片，HE染色观察肝组织病理学变化。根据肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数之比值为0，<1/3，1/3～2/3或>2/3将肝细胞脂肪变性分为(-)～(+++)四个程度，达到(++)或以上诊断为脂肪肝。炎症活动计分标准分汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)、桥接坏死(BN)四项，每项根据病变程度分别计分1～4分，因为PN、BN严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，等级资料采用非参数检验，P<0.05为差异有显著意义，上述检验方法均采用SPSS10.0统计软件处理。
2 结果
2.1 一般情况 实验过程中未出现大鼠死亡，预防组大鼠体重、腹腔内脂肪较模型组有下降趋势，预防组肝指数(肝 脏湿重/体重×100%)显著低于模型组(P<0.01)，见表1。
表1 大鼠体重、腹内脂肪和肝指数 (略 )
2.2 生化指标改变
2.2.1 血脂和肝功能 预防组血清TC水平显著低于模型组(P<0.01)，血清ALT水平较模型组有下降趋势，但无统计学差异，而AST、TG、FFA与模型组比较无统计学差异，见表2。
, 百拇医药
表2 大鼠血脂和血清转氨酶水平 (略 )
2.2.2 肝匀浆脂肪含量 预防组肝匀浆中TG、FFA水平较模型组有下降趋势，而肝匀浆TC含量显著低于模型组(P<0.01)，见表3。
表3 大鼠肝匀浆脂肪含量 (略 )
2.3 肝脏病理 肉眼观察，模型组大鼠肝脏均外形饱满，色泽灰黄，质地脆，切面油腻。光镜下呈中-重度脂肪变，为大泡性为主的混合型脂肪变性，小叶内均见大量以单核细胞为主的炎症细胞浸润，呈点状和小灶性分布，部分融合呈片(图1)。预防组大鼠除有1例轻度脂肪变性外，余大鼠肝脏均正常(图2)。预防组肝脂肪变性程度、炎症活动度计分均显著低于模型组(P<0.01)，见表4。
表4 大鼠肝脏脂肪变性程度和炎症活动度计分 (略)
3 讨论
, 百拇医药
NAFLD是一类肝组织学改变与酒精性肝病相类似，但无过量饮酒史的临床病理综合征 [4，5] 。NAFLD患病率达16%～20% [6] ，病理学改变包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化三种类型，其中NASH是单纯性脂肪肝发展为肝纤维化的必经的病理阶段。
在NAFLD早期阶段，去除病因和控制原发病后，肝脏 病变可得到逆转。但任其发展，则可演变为肝硬化，即使积极治疗也难使肝脏病理学改变恢复正常。所以早期干预对NAFLD的逆转有着重要意义。为此，本研究观察了节制饮食对NASH的预防作用。
图1 模型组大鼠肝组织HE染色×100(略)
图2 预防组大鼠肝组织HE染色×100(略)
我们在以往的研究中已成功用普通饲料20g/kg胆固醇+100g/kg猪油组成的高脂饮食喂养SD大鼠复制了NAFLD模型，并发现高脂饮食饲养8周表现为单纯性脂肪肝、12周呈现脂肪性肝炎、第24周表现为脂肪性肝纤维化，造模成功率达100% [7] ，故本研究未再设立正常对照组。
, 百拇医药
本实验中16周高脂饮食SD大鼠肝脏病理表现为NASH，这与我们以往研究结果一致。预防组在单纯性脂肪肝的基础上给予8周节制饮食治疗，结果显示肝指数、血清和肝匀浆TC水平均明显低于模型组，病理改变其肝脂肪变性程度和炎症活动度计分均较模型组明显好转。实验结果说明NAFLD早期诊断、早期干预可延缓疾病的进展，甚至可完全治愈。
NAFLD与胰岛素抵抗为中心的代谢综合征关系密切。肥胖是NAFLD最常见的危险因子，且肥胖可加重内毒素对肝脏的损伤、降低胰岛素敏感性而诱发胰岛素抵抗 [8] 。
节制饮食治疗作为减肥的基本方法，可改善胰岛素敏感性，降低瘦素水平，并使血清转氨酶下降、肝脂肪变性程度减轻 [9] 。节食治疗包括减食治疗、低热卡饮食和极低热卡饮食 [10] 。范建高等在高脂饮食喂养SD大鼠10周后改为低热卡饮食(即恢复普通饲料喂养，但仅给予正常需要量的1/3)治疗2周，结果发现低热卡饮食治疗组肝脂肪变性较模型组显著减轻，但未恢复正常，而肝脏炎症程度下降为明显 [11] ，这可能与他们观察时间较短有关。本试验节制饮食经推算属于减食治疗，在高脂饮食喂养SD大鼠8周后仅予节制饮食治疗8周，病理学显示预防组肝脂肪变性、肝炎症程度基本恢复正常，提示NAFLD早期干预、长期治疗的重要性，显示节制饮食对NASH有较好的预防作用。
, 百拇医药
参考文献
1 范建高.中国脂肪肝的研究.世界华人消化杂志，2001，9:6-10.
2 Reid AE.Nonalcoholic steatohepatitis.Gastroenterology，2001，121:710-723.
3 Charlton M，Kasparova P，Weston S，et al.Frequency of nonalcoholic steatohepatitis as a cause of advanced liver disease.Liver Transp1，2001，7:608-614.
4 Kumar KS，Malet PF.Nonalcoholic steatohepatitis.Mayo Clin Proc，2000，75:733-739.
, http://www.100md.com
5 Ballentani S，Saccoccio G，Masutti F，et al.Prevalence of and risk factorsfor hepatic steatosis in northern Italy.Ann InternMed，2000，132:112-117.
6 Clark JM，Diehl AM.Defining nonalcoholic fatty liver disease:Implicaˉtions for epidemiologic studies.Gastroenterology，2003，124:248-250.
7 徐正婕，范建高，王国良，等.高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型.世界华人消化杂志，2002，10:392-396.
8 Sanyal AJ.AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease.Gastroenterology，2002，123:1705-1725.
, http://www.100md.com
9 Miyawaki T，Masuzaki H，Ogawa Y，et al.Clinical implications of leptin andits potential humoral regulators in long-term low-calorie diet therapy for obese humans.Eur J Clin Nutr，2002，56:593-600.
10 范建高，曾民德.脂肪肝.上海:上海医科大学出版社，2000，206-213.
11 范建高，钟岚，王国良，等.低热卡饮食对大鼠肥胖高脂血症和脂肪肝的影响.中华消化杂志，22，119-120.
(收稿日期:2003-05-04) (编辑 何蓓), 百拇医药(方继伟)
关键词 非酒精性脂肪性肝炎 节制饮食 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)03-0196-03
, http://www.100md.com
Prevention of moderately energy-restricted diet on NASH in rats model
Fang Jiwei，Fan Jiangao，Zhu Jun，et al.
Fatty Liver Research Center，Shanghai First People’s Hospital，Shanghai200080.
【Abstract】 Objective To investigate the prevention of moderately energy-restricted diet on NASH in rats model.Methods 20SD rats were divided into prevention and control groups.10SD rats were fed a fat-rich diet consisted of fat-rich diet，100g/kg lard oil and20g/kg cholesterol.Other10SD rats were also fed with a fat-rich diet for8weeks，and then fed with moderately energy-restricted diet，that was two-thirds normal diet，for another8weeks before sacrificed.These rats were sacrificed at the16week，then the weight of rats，liver and fat were measured，liver index(liver weight/body weight)were gained，and the level of serum liverfunction，the level of triglycerides(TG)，total cholesterol(TCh)，free fatty acid(FFA)both in serum and hepatic tissue.Histopathological changes in liverwere observed under light microscope.Results Liver index，serum and hepatic total cholesterol in moderately energy-restricted diet group rats were lower than that of fat-rich group，with statistical difference，the degrees of hepatocyte steatosis and inflammation score were all improved significantly.Conclusion These results indicate that moderately energy-restricted diet is useful mean of preventing nonalcoholic fatty liver diseases to progress to nonalcoholic steatoˉhepatitis.
, 百拇医药
Key words nonalcoholic steatohepatitis energy-restricted diet rat
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD)可发展为肝纤维化和肝硬化，且必须经过非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)这一病理阶段 [1～3] ，但至今尚无治疗NAFLD的有效药物，并一致认为控制饮食、增加锻炼是治疗该病的首要措施，其中早期干预尤为重要。本研究即观察了节制饮食对NASH的预防作用。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠20只，购自上海西普尔-必凯公司，体重140～160g，正常喂养1周后，随机分为2组。模型组10只予高脂饮食喂养，即普通饲料+20g/kg胆固醇+100g/kg猪油(胆固醇购于上海生化试剂商、猪油自备)，猪油加热熔化后加入胆固醇，然后拌入饲料中;预防组10只，予高脂饮食喂养8周后恢复普通饲料喂养，但仅给予正常需要量的2/3，两组均于第16周处死。称量体重、肝湿重及脂肪重量，计算肝指数(肝湿重/体重);测定肝功能、血清和肝匀浆中TG、TC、FFA，病理切片行HE染色观察肝脂肪变性及炎症程度。
, http://www.100md.com
1.2 方法 实验动物饲养于本院动物中心，动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～29℃，明暗各12h。实验动物自由进食和饮水，5只1笼饲养。大鼠处死前，隔夜禁食，次日称量体重后，以氯胺酮麻醉，腹腔动脉采血处死，称取肝脏湿重和腹腔脂肪重量，并从肝右叶中部切取2块肝组织，分别用于制备石蜡切片和肝匀浆。
1.2.1 观测指标 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)和肝匀浆TG、TC、FFA均采用全自动生化分析仪检测。游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒购自于和光纯业株式会社NEFA/HA-2(编号为HM033)。
1.2.2 肝匀浆制备 取0.2g肝组织，剪碎，加入冰生理盐水至总体积2ml，用匀浆机磨成10%肝匀浆，3500rpm离心10min，取上清。
1.3 病理学检查 切取小块肝组织，用40g/L甲醛固定后制备石蜡切片，HE染色观察肝组织病理学变化。根据肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数之比值为0，<1/3，1/3～2/3或>2/3将肝细胞脂肪变性分为(-)～(+++)四个程度，达到(++)或以上诊断为脂肪肝。炎症活动计分标准分汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)、桥接坏死(BN)四项，每项根据病变程度分别计分1～4分，因为PN、BN严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，等级资料采用非参数检验，P<0.05为差异有显著意义，上述检验方法均采用SPSS10.0统计软件处理。
2 结果
2.1 一般情况 实验过程中未出现大鼠死亡，预防组大鼠体重、腹腔内脂肪较模型组有下降趋势，预防组肝指数(肝 脏湿重/体重×100%)显著低于模型组(P<0.01)，见表1。
表1 大鼠体重、腹内脂肪和肝指数 (略 )
2.2 生化指标改变
2.2.1 血脂和肝功能 预防组血清TC水平显著低于模型组(P<0.01)，血清ALT水平较模型组有下降趋势，但无统计学差异，而AST、TG、FFA与模型组比较无统计学差异，见表2。
, 百拇医药
表2 大鼠血脂和血清转氨酶水平 (略 )
2.2.2 肝匀浆脂肪含量 预防组肝匀浆中TG、FFA水平较模型组有下降趋势，而肝匀浆TC含量显著低于模型组(P<0.01)，见表3。
表3 大鼠肝匀浆脂肪含量 (略 )
2.3 肝脏病理 肉眼观察，模型组大鼠肝脏均外形饱满，色泽灰黄，质地脆，切面油腻。光镜下呈中-重度脂肪变，为大泡性为主的混合型脂肪变性，小叶内均见大量以单核细胞为主的炎症细胞浸润，呈点状和小灶性分布，部分融合呈片(图1)。预防组大鼠除有1例轻度脂肪变性外，余大鼠肝脏均正常(图2)。预防组肝脂肪变性程度、炎症活动度计分均显著低于模型组(P<0.01)，见表4。
表4 大鼠肝脏脂肪变性程度和炎症活动度计分 (略)
3 讨论
, 百拇医药
NAFLD是一类肝组织学改变与酒精性肝病相类似，但无过量饮酒史的临床病理综合征 [4，5] 。NAFLD患病率达16%～20% [6] ，病理学改变包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化三种类型，其中NASH是单纯性脂肪肝发展为肝纤维化的必经的病理阶段。
在NAFLD早期阶段，去除病因和控制原发病后，肝脏 病变可得到逆转。但任其发展，则可演变为肝硬化，即使积极治疗也难使肝脏病理学改变恢复正常。所以早期干预对NAFLD的逆转有着重要意义。为此，本研究观察了节制饮食对NASH的预防作用。
图1 模型组大鼠肝组织HE染色×100(略)
图2 预防组大鼠肝组织HE染色×100(略)
我们在以往的研究中已成功用普通饲料20g/kg胆固醇+100g/kg猪油组成的高脂饮食喂养SD大鼠复制了NAFLD模型，并发现高脂饮食饲养8周表现为单纯性脂肪肝、12周呈现脂肪性肝炎、第24周表现为脂肪性肝纤维化，造模成功率达100% [7] ，故本研究未再设立正常对照组。
, 百拇医药
本实验中16周高脂饮食SD大鼠肝脏病理表现为NASH，这与我们以往研究结果一致。预防组在单纯性脂肪肝的基础上给予8周节制饮食治疗，结果显示肝指数、血清和肝匀浆TC水平均明显低于模型组，病理改变其肝脂肪变性程度和炎症活动度计分均较模型组明显好转。实验结果说明NAFLD早期诊断、早期干预可延缓疾病的进展，甚至可完全治愈。
NAFLD与胰岛素抵抗为中心的代谢综合征关系密切。肥胖是NAFLD最常见的危险因子，且肥胖可加重内毒素对肝脏的损伤、降低胰岛素敏感性而诱发胰岛素抵抗 [8] 。
节制饮食治疗作为减肥的基本方法，可改善胰岛素敏感性，降低瘦素水平，并使血清转氨酶下降、肝脂肪变性程度减轻 [9] 。节食治疗包括减食治疗、低热卡饮食和极低热卡饮食 [10] 。范建高等在高脂饮食喂养SD大鼠10周后改为低热卡饮食(即恢复普通饲料喂养，但仅给予正常需要量的1/3)治疗2周，结果发现低热卡饮食治疗组肝脂肪变性较模型组显著减轻，但未恢复正常，而肝脏炎症程度下降为明显 [11] ，这可能与他们观察时间较短有关。本试验节制饮食经推算属于减食治疗，在高脂饮食喂养SD大鼠8周后仅予节制饮食治疗8周，病理学显示预防组肝脂肪变性、肝炎症程度基本恢复正常，提示NAFLD早期干预、长期治疗的重要性，显示节制饮食对NASH有较好的预防作用。
, 百拇医药
参考文献
1 范建高.中国脂肪肝的研究.世界华人消化杂志，2001，9:6-10.
2 Reid AE.Nonalcoholic steatohepatitis.Gastroenterology，2001，121:710-723.
3 Charlton M，Kasparova P，Weston S，et al.Frequency of nonalcoholic steatohepatitis as a cause of advanced liver disease.Liver Transp1，2001，7:608-614.
4 Kumar KS，Malet PF.Nonalcoholic steatohepatitis.Mayo Clin Proc，2000，75:733-739.
, http://www.100md.com
5 Ballentani S，Saccoccio G，Masutti F，et al.Prevalence of and risk factorsfor hepatic steatosis in northern Italy.Ann InternMed，2000，132:112-117.
6 Clark JM，Diehl AM.Defining nonalcoholic fatty liver disease:Implicaˉtions for epidemiologic studies.Gastroenterology，2003，124:248-250.
7 徐正婕，范建高，王国良，等.高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型.世界华人消化杂志，2002，10:392-396.
8 Sanyal AJ.AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease.Gastroenterology，2002，123:1705-1725.
, http://www.100md.com
9 Miyawaki T，Masuzaki H，Ogawa Y，et al.Clinical implications of leptin andits potential humoral regulators in long-term low-calorie diet therapy for obese humans.Eur J Clin Nutr，2002，56:593-600.
10 范建高，曾民德.脂肪肝.上海:上海医科大学出版社，2000，206-213.
11 范建高，钟岚，王国良，等.低热卡饮食对大鼠肥胖高脂血症和脂肪肝的影响.中华消化杂志，22，119-120.
(收稿日期:2003-05-04) (编辑 何蓓), 百拇医药(方继伟)