CD34+ 细胞在血虚证小鼠中的变化及其意义
http://www.100md.com
中华中西医杂志 第4卷 第5期
【摘要】 目的 研究 60 Coγ射线照射和环磷酰胺给药后血虚证动物模型CD34+ 细胞的数量变化规律及其意义。方法 损伤性血虚证模型射线照射及化学损伤后，流式细胞仪测定CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例。结果 ①CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例随照射剂量的加大而降低，在5.5Gy照射后14d内小鼠CD34+ 细胞的减少表现为持续性;②注射环磷酰胺后CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例下降后迅速上升，然后又下降。结论 CD34+细胞数量下降与中医血虚证的发生密切相关。
关键词 辐射 环磷酰胺 血虚证 骨髓 CD34+
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0658-02
The changes of CD34+ cells in bone marrow of blood deficency mice
, 百拇医药
inducedby irradiation and cyclophosphamide
Gao Yue，Ma Zengchun，Liu Yongxue，et al.
Department of Pharmacology and Toxicology，Institute of Radiation Medicine，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To observe the changes of CD34+ cells in bone marrow of C57blood deficiency mouse after irradiation and cyclophosphamide.Methods Establishment of the blood deficiency mice by irradiation and inˉjected i.p withcyclophosphamide.Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by double fluorescent labeling.Results ①Compared with normal group，the rate of CD34+ cells in bone marrow nuclear cells decreased at least for14days after irradiation，and the changes were related with irradiated doses.②The rate of CD34 + cells in bone marrow nuclear cells after injected i.p with cyclophosphamide decreased at first，then increased for some days，and then decreased.Conclusion The decrease of CD34+ cells in bone marrow is one of causes of the blood deficiency mouse after irradiation and cyclophosphamide.
, 百拇医药
Key words irradiation cyclophosphamide blood deficiency bone marrow CD34+
用一定剂量的60Coγ射线照射和环磷酰胺给药后制成血虚证动物模型，已经观察了该动物模型外周血各血液成份、造血祖细胞、细胞凋亡等变化规律 [1～3] 。为进一步探讨该模型的变化特点，以CD34+ 细胞为指标进行了观察。CD34抗原为细胞表面磷酸化蛋白，选择性表达于早期干祖细胞膜上，随细胞的分化成熟，CD34抗原逐渐减少直至消失 [4] 。输注CD34+ 细胞可使致死剂量照射狗重建造血功能 [5] 。CD34+ 细胞的数量能够反映骨髓造血干祖细胞的数量[6] 。为此探讨了此模型动物骨髓中CD34+ 细胞的数量及变化规律。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 模型制作及动物分组 C57小鼠30只，体重(22±2)g，购自军事医学科学院实验动物中心，级别二级。放射损伤性模型采用60 Coγ射线照射，剂量分别为2.5Gy、5.5Gy和7.5Gy，吸收剂量率为1.31Gy/min，随机分为正常对照组、2.5Gy照射组、5.5Gy照射组、7.5Gy照射组。化学损伤性模型采用环磷酰胺给药，小剂量组小鼠100mg/kg，腹腔注射，隔日1次，连续3次;大剂量组小鼠一次性腹腔注射250mg/kg。
1.2 主要试剂 FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体及对照抗体;Annexin V-FITC试剂盒，均购自美国Becton Dickinˉson公司。碘化丙啶:Pharmingen公司产品。
1.3 CD34 + 细胞检测 用含0.2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲出小鼠股骨骨髓细胞，取1×106 个细胞加入30μl小鼠血清以封闭非特异结合位点，加入10μl FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，对照管加入相应的对照抗体，4℃避光反应30min。加入2ml红细胞裂解液，作用5min，洗细胞两次，加入终浓度为3μg/ml的PI染液，上机检测 [5] 。
, http://www.100md.com
分别在给药后第1d、3d、5d、7d、10d、14d检测小鼠骨髓的CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例和骨髓细胞的细胞周期。
1.4 统计学方法 数据以ˉx±s表示，采用Microsoft excel97软件中的t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 照射所致骨髓有核细胞中CD34+ 细胞比例的变化 5.5Gy照射小鼠在照射后各检测时相点，CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例均下降，与正常组相比，差异有显著性，见表1。表2显示了吸收剂量对骨髓CD34+ 细胞比例的改变情况，在检测范围内，吸收剂量越大，CD34+ 细胞比例下降越明显。小鼠骨髓中有核细胞数有相似的变化规律。
2.2 环磷酰胺对CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中比例的影响 结果表明:环磷酰胺小剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先升高，在第5d达峰值，以后下降，在第10d CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例低于正常。大剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先下降后上升，在第3d达峰值，以后下降，在第7d、10d CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例低于正常，见表3。
, http://www.100md.com
表1 5.5Gy照射后小鼠CD34+ 细胞的动态变化 (略)
表2 不同剂量射线对小鼠骨髓细胞的影响 (略 )
表3 环磷酰胺对小鼠骨髓中CD34 + 细胞比例的影响 (略 )
3 讨论
照射和化学药物造成的中医血虚证主要表现在外周血各血液成份的下降，造血干祖细胞增生受抑，细胞凋亡和细胞周期紊乱等。骨髓是损伤的敏感组织，CD34+ 细胞代表了骨髓中的造血干祖细胞，在一定程度上反映了骨髓的造血状况。在以往工作的基础上，我们以损伤引起CD34+ 细胞的变化为重点，探讨此模型小鼠CD34+ 细胞的变化规律。
5.5Gy照射小鼠CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例在照射后各检测时相点均下降，在2.5～7.5Gy之间，随吸收剂量的加大，CD34 + 细胞在骨髓有核细胞中的比例下降越明显。骨髓细胞集落生成能力在照射后14d有所恢复，但骨髓中CD34+ 细胞比例仍呈下降趋势，CD34促进造血干祖细胞粘附于骨髓基质 [7] ;在骨髓细胞的分化过程中起负性调节作用，CD34表达下调时细胞走向分化;在胚胎及成年造血祖细胞形成中起重要作用 [8] 。辐射损伤后CD34+ 细胞在小鼠骨髓有核细胞中的比例下降，在14d内呈持续性，且在2.5～7.5Gy范围内与剂量呈正相关，结果提示骨髓造血干祖细胞对射线更为敏感而易损伤。
, 百拇医药
环磷酰胺小剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先升高，在第5d达峰值，以后下降。CD34+ 细胞用药后5d数量最多;大剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先下降后上升，在第3d达峰值，以后下降。CD34+ 细胞数量增多，成熟后释放入外周血中，引起外周血中白细胞在用药后7～10d达峰值。大剂量组小鼠用药后1d时CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例下降低于正常，可能与CTX诱导骨髓细胞凋亡有关，Morrison 曾报道CTX和G-CSF可使小鼠骨髓中造血干祖细胞的比例增加12倍 [9] ，本实验大小剂量分别使CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例增加12.5和13.6倍。
参考文献
1 刘永学，高月，陶来宝，等.造血细胞凋亡在射线诱发小鼠血虚证中的作用.深圳中西医结合杂志，2000，10(1):14.
, 百拇医药
2 马增春，高月.血虚证的病理研究概况.新中医，2000，32(9):60.
3 高月，吕秋军，付艳荣，等.中医血虚证动物模型的分子基础研究.中国药理学会通讯，1999，16(1):30.
4 Knapp W，Strobl H，Scheminecker C，et al.Molecular characterization of CD34+ human hematopoietic progenitor cells.Ann hematol，1995，70:281-296.
5 Bruno B，Nash RA，Wallace PM，et al.CD34+ selected bone marrow Grafts areradioprotective and establish mixed chimerism in dogs give high dose total bodyirradiation.Transplantation，1999，68:338-344.
, http://www.100md.com
6 Xuetao Pei.Who is hematopoieticstem cell:CD34 + or CD34 - ?Intern J Hematol，1999，70:213-215.
7 Fackler M，Krause O，Smith O，et al.Full-length but not truncted CD34inhibits hematopoietic cell differentiation ofM 1 cells.Blood，1995，85:3040-3047.
8 Cheng J，Baumhueter S，Cacalanno G，et al.Hematopoietiv defects in mice lacking the sialomucin CD34.Blood，1996，87:479-490.
9 Morrison SJ，Wright DE，Weissman IL，et al.Cyclophosphamide/granuˉlocyte colony-stimulating factor induces hematopoietic stem cells to proliferate prior to mobilization.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:1908-1913.
(编辑 小川), http://www.100md.com
关键词 辐射 环磷酰胺 血虚证 骨髓 CD34+
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0658-02
The changes of CD34+ cells in bone marrow of blood deficency mice
, 百拇医药
inducedby irradiation and cyclophosphamide
Gao Yue，Ma Zengchun，Liu Yongxue，et al.
Department of Pharmacology and Toxicology，Institute of Radiation Medicine，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To observe the changes of CD34+ cells in bone marrow of C57blood deficiency mouse after irradiation and cyclophosphamide.Methods Establishment of the blood deficiency mice by irradiation and inˉjected i.p withcyclophosphamide.Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by double fluorescent labeling.Results ①Compared with normal group，the rate of CD34+ cells in bone marrow nuclear cells decreased at least for14days after irradiation，and the changes were related with irradiated doses.②The rate of CD34 + cells in bone marrow nuclear cells after injected i.p with cyclophosphamide decreased at first，then increased for some days，and then decreased.Conclusion The decrease of CD34+ cells in bone marrow is one of causes of the blood deficiency mouse after irradiation and cyclophosphamide.
, 百拇医药
Key words irradiation cyclophosphamide blood deficiency bone marrow CD34+
用一定剂量的60Coγ射线照射和环磷酰胺给药后制成血虚证动物模型，已经观察了该动物模型外周血各血液成份、造血祖细胞、细胞凋亡等变化规律 [1～3] 。为进一步探讨该模型的变化特点，以CD34+ 细胞为指标进行了观察。CD34抗原为细胞表面磷酸化蛋白，选择性表达于早期干祖细胞膜上，随细胞的分化成熟，CD34抗原逐渐减少直至消失 [4] 。输注CD34+ 细胞可使致死剂量照射狗重建造血功能 [5] 。CD34+ 细胞的数量能够反映骨髓造血干祖细胞的数量[6] 。为此探讨了此模型动物骨髓中CD34+ 细胞的数量及变化规律。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 模型制作及动物分组 C57小鼠30只，体重(22±2)g，购自军事医学科学院实验动物中心，级别二级。放射损伤性模型采用60 Coγ射线照射，剂量分别为2.5Gy、5.5Gy和7.5Gy，吸收剂量率为1.31Gy/min，随机分为正常对照组、2.5Gy照射组、5.5Gy照射组、7.5Gy照射组。化学损伤性模型采用环磷酰胺给药，小剂量组小鼠100mg/kg，腹腔注射，隔日1次，连续3次;大剂量组小鼠一次性腹腔注射250mg/kg。
1.2 主要试剂 FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体及对照抗体;Annexin V-FITC试剂盒，均购自美国Becton Dickinˉson公司。碘化丙啶:Pharmingen公司产品。
1.3 CD34 + 细胞检测 用含0.2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲出小鼠股骨骨髓细胞，取1×106 个细胞加入30μl小鼠血清以封闭非特异结合位点，加入10μl FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，对照管加入相应的对照抗体，4℃避光反应30min。加入2ml红细胞裂解液，作用5min，洗细胞两次，加入终浓度为3μg/ml的PI染液，上机检测 [5] 。
, http://www.100md.com
分别在给药后第1d、3d、5d、7d、10d、14d检测小鼠骨髓的CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例和骨髓细胞的细胞周期。
1.4 统计学方法 数据以ˉx±s表示，采用Microsoft excel97软件中的t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 照射所致骨髓有核细胞中CD34+ 细胞比例的变化 5.5Gy照射小鼠在照射后各检测时相点，CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例均下降，与正常组相比，差异有显著性，见表1。表2显示了吸收剂量对骨髓CD34+ 细胞比例的改变情况，在检测范围内，吸收剂量越大，CD34+ 细胞比例下降越明显。小鼠骨髓中有核细胞数有相似的变化规律。
2.2 环磷酰胺对CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中比例的影响 结果表明:环磷酰胺小剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先升高，在第5d达峰值，以后下降，在第10d CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例低于正常。大剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先下降后上升，在第3d达峰值，以后下降，在第7d、10d CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例低于正常，见表3。
, http://www.100md.com
表1 5.5Gy照射后小鼠CD34+ 细胞的动态变化 (略)
表2 不同剂量射线对小鼠骨髓细胞的影响 (略 )
表3 环磷酰胺对小鼠骨髓中CD34 + 细胞比例的影响 (略 )
3 讨论
照射和化学药物造成的中医血虚证主要表现在外周血各血液成份的下降，造血干祖细胞增生受抑，细胞凋亡和细胞周期紊乱等。骨髓是损伤的敏感组织，CD34+ 细胞代表了骨髓中的造血干祖细胞，在一定程度上反映了骨髓的造血状况。在以往工作的基础上，我们以损伤引起CD34+ 细胞的变化为重点，探讨此模型小鼠CD34+ 细胞的变化规律。
5.5Gy照射小鼠CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例在照射后各检测时相点均下降，在2.5～7.5Gy之间，随吸收剂量的加大，CD34 + 细胞在骨髓有核细胞中的比例下降越明显。骨髓细胞集落生成能力在照射后14d有所恢复，但骨髓中CD34+ 细胞比例仍呈下降趋势，CD34促进造血干祖细胞粘附于骨髓基质 [7] ;在骨髓细胞的分化过程中起负性调节作用，CD34表达下调时细胞走向分化;在胚胎及成年造血祖细胞形成中起重要作用 [8] 。辐射损伤后CD34+ 细胞在小鼠骨髓有核细胞中的比例下降，在14d内呈持续性，且在2.5～7.5Gy范围内与剂量呈正相关，结果提示骨髓造血干祖细胞对射线更为敏感而易损伤。
, 百拇医药
环磷酰胺小剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先升高，在第5d达峰值，以后下降。CD34+ 细胞用药后5d数量最多;大剂量组小鼠骨髓中CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例先下降后上升，在第3d达峰值，以后下降。CD34+ 细胞数量增多，成熟后释放入外周血中，引起外周血中白细胞在用药后7～10d达峰值。大剂量组小鼠用药后1d时CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例下降低于正常，可能与CTX诱导骨髓细胞凋亡有关，Morrison 曾报道CTX和G-CSF可使小鼠骨髓中造血干祖细胞的比例增加12倍 [9] ，本实验大小剂量分别使CD34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例增加12.5和13.6倍。
参考文献
1 刘永学，高月，陶来宝，等.造血细胞凋亡在射线诱发小鼠血虚证中的作用.深圳中西医结合杂志，2000，10(1):14.
, 百拇医药
2 马增春，高月.血虚证的病理研究概况.新中医，2000，32(9):60.
3 高月，吕秋军，付艳荣，等.中医血虚证动物模型的分子基础研究.中国药理学会通讯，1999，16(1):30.
4 Knapp W，Strobl H，Scheminecker C，et al.Molecular characterization of CD34+ human hematopoietic progenitor cells.Ann hematol，1995，70:281-296.
5 Bruno B，Nash RA，Wallace PM，et al.CD34+ selected bone marrow Grafts areradioprotective and establish mixed chimerism in dogs give high dose total bodyirradiation.Transplantation，1999，68:338-344.
, http://www.100md.com
6 Xuetao Pei.Who is hematopoieticstem cell:CD34 + or CD34 - ?Intern J Hematol，1999，70:213-215.
7 Fackler M，Krause O，Smith O，et al.Full-length but not truncted CD34inhibits hematopoietic cell differentiation ofM 1 cells.Blood，1995，85:3040-3047.
8 Cheng J，Baumhueter S，Cacalanno G，et al.Hematopoietiv defects in mice lacking the sialomucin CD34.Blood，1996，87:479-490.
9 Morrison SJ，Wright DE，Weissman IL，et al.Cyclophosphamide/granuˉlocyte colony-stimulating factor induces hematopoietic stem cells to proliferate prior to mobilization.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:1908-1913.
(编辑 小川), http://www.100md.com