虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的培养大鼠心肌细胞影响
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中华中西医杂志 2004年1月 第5卷 第1期
【摘要】 目的 探讨虎杖水煎液对病毒性心肌炎的影响，为该药的临床应用提供实验依据。方法 取新生SD大鼠心室肌，培养搏动心肌细胞48h后，接种10 3 TCID 50 的柯萨奇B 3 病毒作实验性病毒性心肌炎模型。实验分4个组:正常对照组、病毒对照组、阳性对照药物(干扰素)组、虎杖水煎液组。结果 虎杖水煎液使感染病毒后心肌病变明显减轻，改善细胞搏动，明显降低心肌细胞释放酶(乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶)活性，减轻超微结构病变。结论 虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的SD大鼠培养心肌细胞具有抗病毒和明显的保护作用。
关键词 柯萨奇病毒B 心肌炎 虎杖 药用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0005-03
Effects of polygonum cuspidatum water exact on cultured rat
, 百拇医药
myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3
Shen Chenghua，Zheng Shanzi，Li Taiyi，et al.
Department of Parasitology，College of Medicine，Yanbian University，Yanji133000.
【Abstract】 Objective To study the anti-viral effects and the protecting mechanisms of polygonum cuspidaˉtum water exact for the cultured rat myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 for clinical application.Methods The beating myocardial cells obtained from the ventricular myocardium of newborn Sparaque-Dawley rats and incuˉbated for48hours and inoculated with10 3 TCID50of Coxsackie virus B 3 virus as experimental model of viral myˉocarditis.All rats were randomly divided into fore group normal group，virus model group，interferon treated group and polygonum cuspidatum water exact group.Results The polygonum cuspidatum water exact significantly alleviated the pathogenic changes of myocardial cells，improve percent of the cell beating，reduce the activity of lactate dehydrogenase and creatine phosphokinase and alleviated the ultrastructive changes of myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 .Conclusion The Polygonum cuspidatum water exact has anti-viral effects and significantly protecting effects for SD rat myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 .
, 百拇医药
Key words Coxsackie viruses B myocarditis polygonum cuspidatum medicinal
病毒性心肌炎是嗜心性病毒侵犯心脏引起的，以心肌坏死和间质内单核细胞、淋巴细胞浸润为主要病理变化的一种常见病。许多报道已证实该病的致病病毒最常见的是肠道病毒、ECHO病毒、风疹病毒、流行性感冒病毒、腮腺炎病毒，特别是与柯萨奇B 3 病毒 [1] 有关。虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb，et Zucc)为蓼科蓼属多年生草本植物，虎杖的干燥根茎、叶亦可入药。据报道 [2] 10%虎杖水煎液对单纯疱疹病毒、甲型流感病毒及埃可Ⅱ型病毒均有抑制作用，而且3%虎杖水煎液对3型腺病毒、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒、9型埃可病毒、A9型和B5型柯萨奇病毒、乙型脑炎病毒等也有较高的抑制作用。为了开发利用虎杖的抗病毒作用，本实验以实验性体外病毒性心肌炎模型探讨了虎杖水煎液的抗病毒和保护心肌损伤作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 新生2～3d的Sparque-Dawley(SD)大鼠，由延边大学医学院实验动物科提供。
1.1.2 病毒 为柯萨奇B 3 亲心肌病毒，由白求恩医科大学细胞生物学教研室提供。此病毒在Vero细胞中传代，反复冻融3次，测定得其TCID 50 为10 -3.66 /ml，分装后于-70℃冻存。
1.1.3 药物及试剂 虎杖水煎液(Polygonum cuspidatum water exact，PCE)母液生药含量为100g/L，棕红色澄清溶液，由延边大学医学院生药学教研室提供。高压灭菌后，保存于4℃冰箱备用;α-1b型干扰素每支为100万U，为深圳科兴生物制品有限公司产品;乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。心肌细胞生长液每1000ml含新生牛血清(美国Biolabs公司产品)200ml，青霉素、链霉素各10万U，RPMI-1640(Sigma公司产品)液800ml。
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1.2 方法
1.2.1 药物毒性测定 将虎杖水煎液母液用生长液分别稀释成8，4，2，1，0.5g/L浓度备用。用常规法 [3] 分离新生SD大鼠心室肌，制成细胞悬液，计活细胞数，调整细胞浓度为5×10 5 个细胞/ml，接种于24孔组织培养板。待心肌细胞长成单层时，弃生长液分别加入以上各稀释浓度的虎杖水煎液继续培养于含50ml/L二氧化碳及适宜湿度的培养箱中。各组均设4个孔，隔12h在倒置显微镜下观察药物对细胞有无毒性反应。与正常心肌细胞比较，凡有细胞形态、搏动异常则视为毒性反应。培养72h，制成细胞悬液，1g/L台盼蓝染色，镜下观察细胞总数及被染细胞数，按公式计算细胞生长抑制率 [4] 。以上实验重复进行3次。细胞生长抑制率(%)=[1-(实验组活细胞总数/正常对照组活细胞总数)]×100%。以细胞生长抑制率<10%为药液对细胞的最高无毒浓度作为实验浓度。
1.2.2 实验分组与病毒感染细胞及其形态学观察 实验共分4组，正常对照组、病毒对照组、阳性对照药物组(病毒加1000U/ml干扰素)、PCE组、病毒加最高无毒浓度虎杖水煎液组。每组设8孔常规培养心肌细胞48h，弃上清液，除正常组外各组单层细胞上加入0.5ml含10 3TCID 50 CVB 3 的生长液。37℃孵育1h后弃上清液，用Hank液洗细胞2次。按分组加入正常和含药生长液1ml/孔，置二氧化碳培养箱中继续培养。细胞搏动及细胞病变均在加100目目镜计数器的倒置显微镜下观察。细胞病变积分以徐岩等的标准判定 [5] ，为0、1、2、3、4分，分别表示无细胞病变、细胞病变少于25%、细胞病变为25%～50%、细胞病变为50%～75%及细胞病变多于75%。
, 百拇医药
1.2.3 心肌细胞释放酶检测 感染病毒72h后取4组各8孔细胞上清液，作乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性的检测，用荷兰VITALmicro-lab200型生化半自动分析仪测定。重复作3次。
1.2.4 细胞透射电镜样品制备及超微结构的观察 感染病毒72h后弃除原培养液，加入1g/L胰蛋白酶0.5ml，把培养板放在倒置显微镜台上，镜下观察，待贴壁细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化。吸除消化液，加入营养液用吸管轻轻反复吹打贴壁细胞，形成细胞悬液，分别置于离心管中，以1500r/min离心5min，弃上清液，用PBS液漂洗2次，以去除培养液，所收集的各组心肌细胞经2.5%戊二醛和锇酸双重固定，丙酮逐级脱水，混合树脂包埋，LKB-V型超薄切片机切片。醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透 射电子显微镜观察。
1.2.5 统计学方法 实验数据处理用均数±标准差(ˉx±s)来表示，统计推断:用统计软件SPSS10.0进行多组间方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 虎杖水煎液对培养SD大鼠心肌细胞毒性的影响 虎杖水煎液对心肌细胞的最高无毒浓度为1g/L。见表1。此浓度时细胞生长抑制率少于10%。高于此剂量时，镜下可见心肌细胞先是停止搏动，形态发生变化，逐渐皱缩成圆形，脱壁、折光加深，而且细胞生长抑制率增高;低于此剂量时细胞形态正常。重复作3次结果一致。
表1 虎杖水煎液不同浓度对大鼠心肌细胞生长的影响浓度
2.2 细胞形态和搏动及细胞病变 正常组心肌细胞培养48h后细胞体宽大呈片状，形态不规则，核不清，搏动频率加快，60～100次/min，呈有力规律的同步搏动。病毒组感染病毒24h后，细胞搏动无明显变化，细胞病变不明显;48h时部分细胞停止搏动，细胞病变明显;72h时多数细胞停止搏动，细胞病变较重，积分为(3.1±0.6)分。虎杖水煎液组与病毒组比较细胞病变明显减轻(P<0.05)，见表2。
, 百拇医药
2.3 心肌细胞释放酶测定 感染病毒72h时各实验组细胞培养液中乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性上升，干扰素、虎杖水煎液组乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性与病毒组比较明显降低(P<0.01)，重复作3次结果一致，见表3。
表2 虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的大鼠心肌细胞CPE的影响
表3 虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的大鼠心肌细胞酶活性的影响
2.4 心肌细胞超微结构的病变 正常组心肌细胞细胞膜完整，双层核膜清晰可见，胞质内线粒体丰富聚集于细胞内或沿肌丝走行排列，嵴清晰，呈板状紧密排列，糖原颗粒分布于线粒体周围或肌丝面。病毒组心肌细胞细胞膜被破坏，细胞器严重损伤，线粒体变性、肿胀、嵴断裂，内外膜结构不清，糖原颗粒消失，部分核膜双层结构不清晰，肌浆网扩张，并见大量脂滴沉积。虎杖水煎液组心肌细胞部分线粒体破坏，有的线粒体轻度肿胀，周围可见糖原颗粒，肌原纤维排列整齐，有少量脂质沉积，但大部分心肌细胞保持基本形态。干扰素组心肌细胞超微结构改变较轻。
, 百拇医药
3 讨论
病毒损伤心肌的机制主要与其在心肌细胞内增殖有关，即病毒在细胞浆中利用心肌细胞提供的低分子量前提成分、能量、必要的酶与细胞器等作为原料合成病毒核酸与蛋白质，装配成病毒，并释放至细胞外 [6] 。本实验病毒组结果显示感染病毒72h时心肌细胞病变严重，细胞搏动停止，心肌细胞释放酶活性上升，表明病毒侵入心肌增殖细胞使细胞膜脂质层不稳定，导致膜渗透性增加，从而改变膜的正常功能，并破坏线粒体而抑制细胞的有氧氧化，导致细胞内酸中毒，干扰细胞的代谢及收缩功能。虎杖水煎液组结果显示，它减轻感染柯萨奇B 3 病毒心肌细胞病变，改善细胞搏动，降低细胞释放酶活性，减轻超微结构的病变，其作用与1000U/ml干扰素相同。表明虎杖水煎液可能通过抑制增殖稳定心肌细胞膜，保护线粒体，增加心肌细胞能量供应，增强心肌细胞收缩功能，从而抑制病毒对心肌细胞的损伤，起保护心肌细胞的作用。虎杖的抗病毒机制不是单一 的，有关它的抗病毒机制和有效成分尚待进一步研究。
, 百拇医药 参考文献
1 失崎ぎ雄.心筋症.心筋炎.日本东京:株式会社南江堂，1994，35.
2 刘春安，彭明.抗癌中草药大辞典.武汉:湖北科学技术出版社，1994，618.
3 Yang YZ，Dyke JW.Coxsackie B2virus infection in rat beating heart culˉture cell.J Viral Methods，1985，12:217-220.
4 贺又舜，伍参荣，赵国荣，等.甘露消毒丹对柯萨奇病毒体外抑制作用的实验研究.中国中西医结合杂志，1998，18(12):737.
5 徐岩，杨英珍，陈灏珠，等.病毒性心肌炎药物治疗的细胞学研究.安徽医学，1999，20(2):4.
6 熊丁丁.病毒介导的心肌损害在心肌炎发病机制中的作用研究进展.心血管病学进展，1999，20(3):156.
作者单位:133000吉林延吉延边大学医学院寄生虫学教研室
133700吉林省敦化市太一口腔诊所
132011吉林省吉林市中心医院
(编辑秋 实), 百拇医药(申成华)
关键词 柯萨奇病毒B 心肌炎 虎杖 药用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0005-03
Effects of polygonum cuspidatum water exact on cultured rat
, 百拇医药
myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3
Shen Chenghua，Zheng Shanzi，Li Taiyi，et al.
Department of Parasitology，College of Medicine，Yanbian University，Yanji133000.
【Abstract】 Objective To study the anti-viral effects and the protecting mechanisms of polygonum cuspidaˉtum water exact for the cultured rat myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 for clinical application.Methods The beating myocardial cells obtained from the ventricular myocardium of newborn Sparaque-Dawley rats and incuˉbated for48hours and inoculated with10 3 TCID50of Coxsackie virus B 3 virus as experimental model of viral myˉocarditis.All rats were randomly divided into fore group normal group，virus model group，interferon treated group and polygonum cuspidatum water exact group.Results The polygonum cuspidatum water exact significantly alleviated the pathogenic changes of myocardial cells，improve percent of the cell beating，reduce the activity of lactate dehydrogenase and creatine phosphokinase and alleviated the ultrastructive changes of myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 .Conclusion The Polygonum cuspidatum water exact has anti-viral effects and significantly protecting effects for SD rat myocardial cells infected with Coxsackie virus B 3 .
, 百拇医药
Key words Coxsackie viruses B myocarditis polygonum cuspidatum medicinal
病毒性心肌炎是嗜心性病毒侵犯心脏引起的，以心肌坏死和间质内单核细胞、淋巴细胞浸润为主要病理变化的一种常见病。许多报道已证实该病的致病病毒最常见的是肠道病毒、ECHO病毒、风疹病毒、流行性感冒病毒、腮腺炎病毒，特别是与柯萨奇B 3 病毒 [1] 有关。虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb，et Zucc)为蓼科蓼属多年生草本植物，虎杖的干燥根茎、叶亦可入药。据报道 [2] 10%虎杖水煎液对单纯疱疹病毒、甲型流感病毒及埃可Ⅱ型病毒均有抑制作用，而且3%虎杖水煎液对3型腺病毒、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒、9型埃可病毒、A9型和B5型柯萨奇病毒、乙型脑炎病毒等也有较高的抑制作用。为了开发利用虎杖的抗病毒作用，本实验以实验性体外病毒性心肌炎模型探讨了虎杖水煎液的抗病毒和保护心肌损伤作用。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 新生2～3d的Sparque-Dawley(SD)大鼠，由延边大学医学院实验动物科提供。
1.1.2 病毒 为柯萨奇B 3 亲心肌病毒，由白求恩医科大学细胞生物学教研室提供。此病毒在Vero细胞中传代，反复冻融3次，测定得其TCID 50 为10 -3.66 /ml，分装后于-70℃冻存。
1.1.3 药物及试剂 虎杖水煎液(Polygonum cuspidatum water exact，PCE)母液生药含量为100g/L，棕红色澄清溶液，由延边大学医学院生药学教研室提供。高压灭菌后，保存于4℃冰箱备用;α-1b型干扰素每支为100万U，为深圳科兴生物制品有限公司产品;乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。心肌细胞生长液每1000ml含新生牛血清(美国Biolabs公司产品)200ml，青霉素、链霉素各10万U，RPMI-1640(Sigma公司产品)液800ml。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 药物毒性测定 将虎杖水煎液母液用生长液分别稀释成8，4，2，1，0.5g/L浓度备用。用常规法 [3] 分离新生SD大鼠心室肌，制成细胞悬液，计活细胞数，调整细胞浓度为5×10 5 个细胞/ml，接种于24孔组织培养板。待心肌细胞长成单层时，弃生长液分别加入以上各稀释浓度的虎杖水煎液继续培养于含50ml/L二氧化碳及适宜湿度的培养箱中。各组均设4个孔，隔12h在倒置显微镜下观察药物对细胞有无毒性反应。与正常心肌细胞比较，凡有细胞形态、搏动异常则视为毒性反应。培养72h，制成细胞悬液，1g/L台盼蓝染色，镜下观察细胞总数及被染细胞数，按公式计算细胞生长抑制率 [4] 。以上实验重复进行3次。细胞生长抑制率(%)=[1-(实验组活细胞总数/正常对照组活细胞总数)]×100%。以细胞生长抑制率<10%为药液对细胞的最高无毒浓度作为实验浓度。
1.2.2 实验分组与病毒感染细胞及其形态学观察 实验共分4组，正常对照组、病毒对照组、阳性对照药物组(病毒加1000U/ml干扰素)、PCE组、病毒加最高无毒浓度虎杖水煎液组。每组设8孔常规培养心肌细胞48h，弃上清液，除正常组外各组单层细胞上加入0.5ml含10 3TCID 50 CVB 3 的生长液。37℃孵育1h后弃上清液，用Hank液洗细胞2次。按分组加入正常和含药生长液1ml/孔，置二氧化碳培养箱中继续培养。细胞搏动及细胞病变均在加100目目镜计数器的倒置显微镜下观察。细胞病变积分以徐岩等的标准判定 [5] ，为0、1、2、3、4分，分别表示无细胞病变、细胞病变少于25%、细胞病变为25%～50%、细胞病变为50%～75%及细胞病变多于75%。
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1.2.3 心肌细胞释放酶检测 感染病毒72h后取4组各8孔细胞上清液，作乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性的检测，用荷兰VITALmicro-lab200型生化半自动分析仪测定。重复作3次。
1.2.4 细胞透射电镜样品制备及超微结构的观察 感染病毒72h后弃除原培养液，加入1g/L胰蛋白酶0.5ml，把培养板放在倒置显微镜台上，镜下观察，待贴壁细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化。吸除消化液，加入营养液用吸管轻轻反复吹打贴壁细胞，形成细胞悬液，分别置于离心管中，以1500r/min离心5min，弃上清液，用PBS液漂洗2次，以去除培养液，所收集的各组心肌细胞经2.5%戊二醛和锇酸双重固定，丙酮逐级脱水，混合树脂包埋，LKB-V型超薄切片机切片。醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透 射电子显微镜观察。
1.2.5 统计学方法 实验数据处理用均数±标准差(ˉx±s)来表示，统计推断:用统计软件SPSS10.0进行多组间方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 虎杖水煎液对培养SD大鼠心肌细胞毒性的影响 虎杖水煎液对心肌细胞的最高无毒浓度为1g/L。见表1。此浓度时细胞生长抑制率少于10%。高于此剂量时，镜下可见心肌细胞先是停止搏动，形态发生变化，逐渐皱缩成圆形，脱壁、折光加深，而且细胞生长抑制率增高;低于此剂量时细胞形态正常。重复作3次结果一致。
表1 虎杖水煎液不同浓度对大鼠心肌细胞生长的影响浓度
2.2 细胞形态和搏动及细胞病变 正常组心肌细胞培养48h后细胞体宽大呈片状，形态不规则，核不清，搏动频率加快，60～100次/min，呈有力规律的同步搏动。病毒组感染病毒24h后，细胞搏动无明显变化，细胞病变不明显;48h时部分细胞停止搏动，细胞病变明显;72h时多数细胞停止搏动，细胞病变较重，积分为(3.1±0.6)分。虎杖水煎液组与病毒组比较细胞病变明显减轻(P<0.05)，见表2。
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2.3 心肌细胞释放酶测定 感染病毒72h时各实验组细胞培养液中乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性上升，干扰素、虎杖水煎液组乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性与病毒组比较明显降低(P<0.01)，重复作3次结果一致，见表3。
表2 虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的大鼠心肌细胞CPE的影响
表3 虎杖水煎液对感染柯萨奇B 3 病毒的大鼠心肌细胞酶活性的影响
2.4 心肌细胞超微结构的病变 正常组心肌细胞细胞膜完整，双层核膜清晰可见，胞质内线粒体丰富聚集于细胞内或沿肌丝走行排列，嵴清晰，呈板状紧密排列，糖原颗粒分布于线粒体周围或肌丝面。病毒组心肌细胞细胞膜被破坏，细胞器严重损伤，线粒体变性、肿胀、嵴断裂，内外膜结构不清，糖原颗粒消失，部分核膜双层结构不清晰，肌浆网扩张，并见大量脂滴沉积。虎杖水煎液组心肌细胞部分线粒体破坏，有的线粒体轻度肿胀，周围可见糖原颗粒，肌原纤维排列整齐，有少量脂质沉积，但大部分心肌细胞保持基本形态。干扰素组心肌细胞超微结构改变较轻。
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3 讨论
病毒损伤心肌的机制主要与其在心肌细胞内增殖有关，即病毒在细胞浆中利用心肌细胞提供的低分子量前提成分、能量、必要的酶与细胞器等作为原料合成病毒核酸与蛋白质，装配成病毒，并释放至细胞外 [6] 。本实验病毒组结果显示感染病毒72h时心肌细胞病变严重，细胞搏动停止，心肌细胞释放酶活性上升，表明病毒侵入心肌增殖细胞使细胞膜脂质层不稳定，导致膜渗透性增加，从而改变膜的正常功能，并破坏线粒体而抑制细胞的有氧氧化，导致细胞内酸中毒，干扰细胞的代谢及收缩功能。虎杖水煎液组结果显示，它减轻感染柯萨奇B 3 病毒心肌细胞病变，改善细胞搏动，降低细胞释放酶活性，减轻超微结构的病变，其作用与1000U/ml干扰素相同。表明虎杖水煎液可能通过抑制增殖稳定心肌细胞膜，保护线粒体，增加心肌细胞能量供应，增强心肌细胞收缩功能，从而抑制病毒对心肌细胞的损伤，起保护心肌细胞的作用。虎杖的抗病毒机制不是单一 的，有关它的抗病毒机制和有效成分尚待进一步研究。
, 百拇医药 参考文献
1 失崎ぎ雄.心筋症.心筋炎.日本东京:株式会社南江堂，1994，35.
2 刘春安，彭明.抗癌中草药大辞典.武汉:湖北科学技术出版社，1994，618.
3 Yang YZ，Dyke JW.Coxsackie B2virus infection in rat beating heart culˉture cell.J Viral Methods，1985，12:217-220.
4 贺又舜，伍参荣，赵国荣，等.甘露消毒丹对柯萨奇病毒体外抑制作用的实验研究.中国中西医结合杂志，1998，18(12):737.
5 徐岩，杨英珍，陈灏珠，等.病毒性心肌炎药物治疗的细胞学研究.安徽医学，1999，20(2):4.
6 熊丁丁.病毒介导的心肌损害在心肌炎发病机制中的作用研究进展.心血管病学进展，1999，20(3):156.
作者单位:133000吉林延吉延边大学医学院寄生虫学教研室
133700吉林省敦化市太一口腔诊所
132011吉林省吉林市中心医院
(编辑秋 实), 百拇医药(申成华)