水蛭素的研究进展及其在抗凝治疗中的应用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)02-0132-03
本文从分子生物学角度简述了水蛭素的结构特点和生物学作用，阐述了水蛭的药代动力学，药效学的研究进展。1955年Markwardt等用传统的方法从医用水蛭咽周腺体分泌物中提取获得天然水蛭素，产量很低 [1] ，价格非常昂贵，难以作为抗凝药物应用于临床。应用基因工程技术在大肠杆菌或酵母细胞中表达水蛭素基因，使大规模生产成为可能。本篇综述对重组水蛭素(r-Hirudin)的结构特点、生物学作用，药理和毒理研究进展作一个简单的介绍，并展望其在临床应用方面的前景。
1 水蛭素结构特点
天然水蛭素从医用水蛭唾液腺分泌物中提取，是一条含65个氨基酸的单链多肽，分子量为7000Dalton。水蛭素的N末端有3对二硫键(Cys 6 -Cys 14 ，Cys 16 -Cys 28 ，Cys32 -Cys 39 )，使N末端肽链绕迭成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N末端含活性中心，能识别底物-凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。天然水蛭素第63位的酪氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的结构，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部有一个由Pro-Lys-Pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，这一结构有2个方面的作用:(1)维持水蛭素分子的稳定性;(2)引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合 [2，3] 。
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2 水蛭素的生物学活性和作用特点
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在血栓形成过程中起非常关键的作用。这些作用包括血凝过程中的级联反应，纤维蛋白沉积和血小板活化等。凝血酶有4个结合位点:纤维蛋白结合位点、非活性底物识别位点、酶活性中心和肝素结合位点。水蛭素作用于其中非活性底物识别位点和酶活性中心两个位点，它们以1:1的方式形成紧密的非共价结合的可逆复合物(结合常数为230fmol/L)，从而发挥抗凝作用(如图1) [4] 。水蛭素与凝血酶特异性结合是一个二相的过程，首先是C末端的酸性氨基酸与凝血酶的碱性部位结合，封闭凝血酶的底物识别位点;其次是这种结合使凝血酶构型发生轻微改变，促进了水蛭素N末端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制了凝血酶的催化活性。天然水蛭素、重组水蛭素以及它们的类似物都有这两个结合位点 [4，5] 。
水蛭素是一种直接凝血酶抑制剂，即与凝血酶直接结合，抑制凝血酶的活性，产生抗凝作用。间接凝血酶抑制剂是通过催化凝血酶的天然抑制剂(ATⅢ或肝素辅因子Ⅱ)而产生抗凝作用。肝素和硫酸皮质素为典型的间接凝血酶抑制剂，肝素催化ATⅢ发挥作用，而后者催化肝素辅因子Ⅱ产生作用。水蛭素的抗凝作用不依赖ATⅢ和肝素辅因子Ⅱ [6] 。因此，水蛭素与肝素相比有明显的优点。水蛭素和它的类似物能够高效抑制血栓中的凝血酶和游离的凝血酶，而肝素-抗凝血酶Ⅲ复合物对血栓中的凝血酶几乎没有作用。在血管损伤时、血管成形术后、溶栓治疗后、深静脉血栓时，应用水蛭素治疗非常有效。水蛭素不仅能够抑制激活状态的凝血酶，还能对凝血酶产生起负反馈作用，从而阻断血凝过程的级联反应，抑制凝血酶诱导的血小板活性。上述发现表明，水蛭素的抗凝作用非常专一，抗凝效果比肝素强。近年来许多临床研究已将用于血管成形术后抗凝治疗，治疗不稳定型心绞痛以及溶栓治疗后防治再梗塞等，收到良好的效果 [7，8] 。
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图1 水蛭素分子与凝血酶分子结合模拟图1水蛭素分子N末端(N-Terminal of Hirudin)2凝血酶活性中心(active center of Thrombin)3水蛭素分子C末端(C-terminal of Hirudin)4凝血酶分子(Thrombin)
3 水蛭素药代动力学
水蛭素作为一个大分子多肽，口服不易吸收。而皮下给药有100%的吸收率，生物利用度为85%～100%，可以在血浆或尿液中测出其药物深度。对健康人，静脉给药1.0mg/kg后，最大的血浆浓度可达到0.6～1.0mg/L。一次静脉给药或多次给药后，水蛭素以开放的二室模型在全身分布，半衰期大约为1h。而皮下给药后，无论是单次给药还是多次给药，均以一室模型在全身分布，半衰期显著延长，达到最大血浆浓度时间为1.7～2.6h，并维持稳定的血浆浓度直到药物释放完全。水蛭素几乎不被肝脏降解代谢，以原型或衍生物的形式从尿中排出，而这些衍生物也同样具有抗凝血酶的活性。单次或多次给药后，以一级动力学的形式消除，即消除速率常数呈线性 [9] 。
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4 水蛭素的药效和毒理学
4.1 水蛭素抑制凝血酶活性的作用 水蛭素既能抑制血浆中游离型凝血酶的活性，也能抑制血栓结合型凝血酶活性，其作用比肝素更为广泛。它能显著延长部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。APTT的长短与水蛭素的血浆浓度呈正相关，所以APTT广泛地被用作衡量水蛭素治疗效果和改变治疗剂量的指针。动物试验和Ⅰ期临床试验均证明静脉注射水蛭素后，APTT显著延长，并具有剂量依赖性关系，水蛭素最高剂量达到0.5mg/kg时，APTT的延长也没有出现饱和，皮下注射水蛭素后也出现同样的结果。但是皮下注射给药，APTT的延长一般要经过2h才达到高峰 [9] 。水蛭素能降低凝血过程中血纤维蛋白肽A的减少，这种作用呈剂量相关性，反映水蛭素具有抑制凝血酶水解纤维蛋白原形成纤维蛋白的作用。
4.2 水蛭素预防血栓形成的作用 静脉血栓模型显示血液高凝状态容易形成血栓，水蛭素具有预防血栓形成的作用。Agnelli等利用兔颈静脉模型证实水蛭素的防栓作用比肝素强50%以上，原因是水蛭素能够抑制血栓中的凝血酶活性，而肝素没有这种作用 [10] 。更重要的是一次给药以后，水蛭素的防栓作用能够维持很长一段时间。Raake等利用颈静脉血栓模型证实静脉注射水蛭素最低剂量为0.2mg/kg就能有效防止静脉血栓的形成。静脉注射水蛭素5mg/kg，3h之内可发挥作用;如果采用皮下注射，剂量同样5mg/kg，其发挥作用的时间可大于6h [11] 。水蛭素也能够防止因血管壁损伤引起的动脉血栓的形成。例如，猪血管成形术引发动脉管壁损伤后，引发急性血小板血栓形成，如在术前和术后用水蛭素作抗凝治疗，则能抑制血栓形成，这种防栓作用比肝素强得多。William L等发现对颈动脉粥样硬化的兔实施血管成形术后，使用抗凝药辅助治疗，结果发现使用水蛭素24h后，血管造影未见明显的血管狭窄和其他的病理症状，显著降低了术后的死亡率，这说明水蛭素能够防止血管形成术后的再狭窄 [12～15] 。此外，类似的实验证明水蛭素具有抗犬冠状动脉损伤引起的血栓形成[16] 。
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4.3 水蛭素的辅助溶栓作用 水蛭素与溶栓药一起使用，有协同作用。在犬冠状动脉溶栓治疗模型中，水蛭素能够加快rt-PA的溶栓作用并防止再栓塞，而在相同剂量下，肝素的作用小得多 [17] 。水蛭素与链激酶联合用药，能够增强后者的溶栓作用。Mruk等报道，水蛭素和肝素都能加快rt-PA溶解富含血小板血栓，但是只有联合使用水蛭素能清除血管壁上残留的血栓 [18] 。
4.4 水蛭素使用剂量与抗凝及出血的关系 水蛭素具有抗凝血的作用，但是同时也延长了出血时间。使用水蛭素最大的不良反应就是出血。Markwardt等报道，只有当水蛭素的剂量远远大于抗凝所需的剂量时，才发生明显的出血。与肝素相比，水蛭素引起出血的危险较小 [2] 。
5 水蛭素的衍生物-双功能水蛭素
血小板与血管壁粘附后，血小板被激活，并发生聚集，导致血栓形成。在这个过程中，血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa 起了非常关键的作用，它作为受体引导血小板聚集。位于纤维蛋白原上的Arg-Gly-Asp(RGD)序列是血小板GPⅡb/Ⅲa复合物的识别位点，两者的结合是血栓形成的最后通路，所以阻断该环节是防治血栓形成的新途径。研究表明含RGD序列的外源性多肽可抑制纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa复合物的结合，从而达到抑制血小板聚集的目的 [4，10，11] 。我们将RGD序列融合于水蛭素分子中，使这种水蛭素的衍生物具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能，并且这两种功能非常匹配。从水蛭素晶体结构可以发现，其空间构象中含有一指形区，伸展在整个分子的外部，这 个指形区是由β-折叠构成，位于27-31位残基和36-40位残基，实验证明将32-35位残基突变，并在这个位置引入RGD序列，得到的水蛭素衍生物具有强大的抗血小板聚集的活性。这种双功能水蛭素与野生型水蛭素相比，抗栓作用更强。野生型水蛭素只具有抗凝血酶活性，因此用来预防深静脉血栓很有效，而双功能水蛭素既能预防静脉血栓，也能预防动脉血栓。两者在生产相同治疗效果时，双功能水蛭素的治疗剂量可以显著降低，由此减少出血等不良反应，具有更好的临床应用前景。
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6 水蛭素的临床应用前景
重组水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的凝血酶和血栓中与纤维蛋白结合的凝血酶结合，以防止血栓形成或血栓增大。临床研究发现:对于髋关节替换手术的病人，以重组水蛭素作为抗凝剂，较其它溶栓剂或小分子肝素，具有更好的预防深静脉血栓形成的效果。重组水蛭素比肝素更明显降低急性心肌梗死病人的死亡率和非致死性梗塞的发生率 [19] 。治疗不稳定型心绞痛或非Q波型心肌梗死也有与上述相同的结果 [20] 。此外，不稳定型心绞痛病人在血管成形术后30周内用重组水蛭素或肝素抗凝，预防再梗塞，两者的治疗效果类似。
目前，水蛭素主要适应证有治疗急性心肌梗死病人溶栓后辅助治疗心绞痛，预防和治疗深静脉血栓，Ⅱ型肝素相关性血小板减少症和弥慢性血管内凝血 [21] 。德国赫斯特公司的重组水蛭素于1999年上市，取得了令人鼓舞的结果。天然或重组水蛭素是高效、专一、安全的凝血酶抑制剂。与肝素、乙酰水杨酸等传统的抗凝药物相比，水蛭素治疗剂量小，疗效好，不良反应少而轻，不会引起过敏反应，是一种防治血栓性心血管疾病的良药。
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参考文献
1 Markwardt F，Sturzebecker J，Griessbach U.Hirudins as an inhibitor of thrombin.Method in Enzymology，1970，19:924-932.
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10 Agnelli G.The comparative effects of recombinant hirudin and standard heparin on thrombus growth in rabbits.Thromb Haemost，1990，63:204-207.
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12 William L.Arterial thrombin activity after angioplasty in an atheroscleˉrotic rabbit model.Circulation，1996，94:88-93.
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14 Buchwald AB.Platelet and fibrin deposition on coronary stents in minipigs;effect of hirudin versus heparin.J Am Coll Cardiol，1993，21:249-254.
15 Bittl JA.Treatment with hirulog as compared with heparin during coroˉnary angioplasty for unstable or postinfarction angina.N Engl J Med，1995，333:658-665.
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21 Greinacher A Recombinant hirudin in the treatment of patients with heparin associated thrombocytopenie typeⅡ:A historically controlled clinical trial.In:Recombinant hirudin-clinical experiences in heparin-associated thrombocytopeniatypeⅡand cardiovascular disease，A Satellite Symposiumto the XVⅢth Congress of the European Society of Cardiology，Birmingham，United Kingdom，26August1996.Scientific Communications，1997，8-10.
作者单位:200032上海复旦大学教育部分子医学重点实验室
(编辑曲 全), 百拇医药(莫)
本文从分子生物学角度简述了水蛭素的结构特点和生物学作用，阐述了水蛭的药代动力学，药效学的研究进展。1955年Markwardt等用传统的方法从医用水蛭咽周腺体分泌物中提取获得天然水蛭素，产量很低 [1] ，价格非常昂贵，难以作为抗凝药物应用于临床。应用基因工程技术在大肠杆菌或酵母细胞中表达水蛭素基因，使大规模生产成为可能。本篇综述对重组水蛭素(r-Hirudin)的结构特点、生物学作用，药理和毒理研究进展作一个简单的介绍，并展望其在临床应用方面的前景。
1 水蛭素结构特点
天然水蛭素从医用水蛭唾液腺分泌物中提取，是一条含65个氨基酸的单链多肽，分子量为7000Dalton。水蛭素的N末端有3对二硫键(Cys 6 -Cys 14 ，Cys 16 -Cys 28 ，Cys32 -Cys 39 )，使N末端肽链绕迭成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N末端含活性中心，能识别底物-凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。天然水蛭素第63位的酪氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的结构，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部有一个由Pro-Lys-Pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，这一结构有2个方面的作用:(1)维持水蛭素分子的稳定性;(2)引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合 [2，3] 。
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2 水蛭素的生物学活性和作用特点
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在血栓形成过程中起非常关键的作用。这些作用包括血凝过程中的级联反应，纤维蛋白沉积和血小板活化等。凝血酶有4个结合位点:纤维蛋白结合位点、非活性底物识别位点、酶活性中心和肝素结合位点。水蛭素作用于其中非活性底物识别位点和酶活性中心两个位点，它们以1:1的方式形成紧密的非共价结合的可逆复合物(结合常数为230fmol/L)，从而发挥抗凝作用(如图1) [4] 。水蛭素与凝血酶特异性结合是一个二相的过程，首先是C末端的酸性氨基酸与凝血酶的碱性部位结合，封闭凝血酶的底物识别位点;其次是这种结合使凝血酶构型发生轻微改变，促进了水蛭素N末端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制了凝血酶的催化活性。天然水蛭素、重组水蛭素以及它们的类似物都有这两个结合位点 [4，5] 。
水蛭素是一种直接凝血酶抑制剂，即与凝血酶直接结合，抑制凝血酶的活性，产生抗凝作用。间接凝血酶抑制剂是通过催化凝血酶的天然抑制剂(ATⅢ或肝素辅因子Ⅱ)而产生抗凝作用。肝素和硫酸皮质素为典型的间接凝血酶抑制剂，肝素催化ATⅢ发挥作用，而后者催化肝素辅因子Ⅱ产生作用。水蛭素的抗凝作用不依赖ATⅢ和肝素辅因子Ⅱ [6] 。因此，水蛭素与肝素相比有明显的优点。水蛭素和它的类似物能够高效抑制血栓中的凝血酶和游离的凝血酶，而肝素-抗凝血酶Ⅲ复合物对血栓中的凝血酶几乎没有作用。在血管损伤时、血管成形术后、溶栓治疗后、深静脉血栓时，应用水蛭素治疗非常有效。水蛭素不仅能够抑制激活状态的凝血酶，还能对凝血酶产生起负反馈作用，从而阻断血凝过程的级联反应，抑制凝血酶诱导的血小板活性。上述发现表明，水蛭素的抗凝作用非常专一，抗凝效果比肝素强。近年来许多临床研究已将用于血管成形术后抗凝治疗，治疗不稳定型心绞痛以及溶栓治疗后防治再梗塞等，收到良好的效果 [7，8] 。
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图1 水蛭素分子与凝血酶分子结合模拟图1水蛭素分子N末端(N-Terminal of Hirudin)2凝血酶活性中心(active center of Thrombin)3水蛭素分子C末端(C-terminal of Hirudin)4凝血酶分子(Thrombin)
3 水蛭素药代动力学
水蛭素作为一个大分子多肽，口服不易吸收。而皮下给药有100%的吸收率，生物利用度为85%～100%，可以在血浆或尿液中测出其药物深度。对健康人，静脉给药1.0mg/kg后，最大的血浆浓度可达到0.6～1.0mg/L。一次静脉给药或多次给药后，水蛭素以开放的二室模型在全身分布，半衰期大约为1h。而皮下给药后，无论是单次给药还是多次给药，均以一室模型在全身分布，半衰期显著延长，达到最大血浆浓度时间为1.7～2.6h，并维持稳定的血浆浓度直到药物释放完全。水蛭素几乎不被肝脏降解代谢，以原型或衍生物的形式从尿中排出，而这些衍生物也同样具有抗凝血酶的活性。单次或多次给药后，以一级动力学的形式消除，即消除速率常数呈线性 [9] 。
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4 水蛭素的药效和毒理学
4.1 水蛭素抑制凝血酶活性的作用 水蛭素既能抑制血浆中游离型凝血酶的活性，也能抑制血栓结合型凝血酶活性，其作用比肝素更为广泛。它能显著延长部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。APTT的长短与水蛭素的血浆浓度呈正相关，所以APTT广泛地被用作衡量水蛭素治疗效果和改变治疗剂量的指针。动物试验和Ⅰ期临床试验均证明静脉注射水蛭素后，APTT显著延长，并具有剂量依赖性关系，水蛭素最高剂量达到0.5mg/kg时，APTT的延长也没有出现饱和，皮下注射水蛭素后也出现同样的结果。但是皮下注射给药，APTT的延长一般要经过2h才达到高峰 [9] 。水蛭素能降低凝血过程中血纤维蛋白肽A的减少，这种作用呈剂量相关性，反映水蛭素具有抑制凝血酶水解纤维蛋白原形成纤维蛋白的作用。
4.2 水蛭素预防血栓形成的作用 静脉血栓模型显示血液高凝状态容易形成血栓，水蛭素具有预防血栓形成的作用。Agnelli等利用兔颈静脉模型证实水蛭素的防栓作用比肝素强50%以上，原因是水蛭素能够抑制血栓中的凝血酶活性，而肝素没有这种作用 [10] 。更重要的是一次给药以后，水蛭素的防栓作用能够维持很长一段时间。Raake等利用颈静脉血栓模型证实静脉注射水蛭素最低剂量为0.2mg/kg就能有效防止静脉血栓的形成。静脉注射水蛭素5mg/kg，3h之内可发挥作用;如果采用皮下注射，剂量同样5mg/kg，其发挥作用的时间可大于6h [11] 。水蛭素也能够防止因血管壁损伤引起的动脉血栓的形成。例如，猪血管成形术引发动脉管壁损伤后，引发急性血小板血栓形成，如在术前和术后用水蛭素作抗凝治疗，则能抑制血栓形成，这种防栓作用比肝素强得多。William L等发现对颈动脉粥样硬化的兔实施血管成形术后，使用抗凝药辅助治疗，结果发现使用水蛭素24h后，血管造影未见明显的血管狭窄和其他的病理症状，显著降低了术后的死亡率，这说明水蛭素能够防止血管形成术后的再狭窄 [12～15] 。此外，类似的实验证明水蛭素具有抗犬冠状动脉损伤引起的血栓形成[16] 。
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4.3 水蛭素的辅助溶栓作用 水蛭素与溶栓药一起使用，有协同作用。在犬冠状动脉溶栓治疗模型中，水蛭素能够加快rt-PA的溶栓作用并防止再栓塞，而在相同剂量下，肝素的作用小得多 [17] 。水蛭素与链激酶联合用药，能够增强后者的溶栓作用。Mruk等报道，水蛭素和肝素都能加快rt-PA溶解富含血小板血栓，但是只有联合使用水蛭素能清除血管壁上残留的血栓 [18] 。
4.4 水蛭素使用剂量与抗凝及出血的关系 水蛭素具有抗凝血的作用，但是同时也延长了出血时间。使用水蛭素最大的不良反应就是出血。Markwardt等报道，只有当水蛭素的剂量远远大于抗凝所需的剂量时，才发生明显的出血。与肝素相比，水蛭素引起出血的危险较小 [2] 。
5 水蛭素的衍生物-双功能水蛭素
血小板与血管壁粘附后，血小板被激活，并发生聚集，导致血栓形成。在这个过程中，血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa 起了非常关键的作用，它作为受体引导血小板聚集。位于纤维蛋白原上的Arg-Gly-Asp(RGD)序列是血小板GPⅡb/Ⅲa复合物的识别位点，两者的结合是血栓形成的最后通路，所以阻断该环节是防治血栓形成的新途径。研究表明含RGD序列的外源性多肽可抑制纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa复合物的结合，从而达到抑制血小板聚集的目的 [4，10，11] 。我们将RGD序列融合于水蛭素分子中，使这种水蛭素的衍生物具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能，并且这两种功能非常匹配。从水蛭素晶体结构可以发现，其空间构象中含有一指形区，伸展在整个分子的外部，这 个指形区是由β-折叠构成，位于27-31位残基和36-40位残基，实验证明将32-35位残基突变，并在这个位置引入RGD序列，得到的水蛭素衍生物具有强大的抗血小板聚集的活性。这种双功能水蛭素与野生型水蛭素相比，抗栓作用更强。野生型水蛭素只具有抗凝血酶活性，因此用来预防深静脉血栓很有效，而双功能水蛭素既能预防静脉血栓，也能预防动脉血栓。两者在生产相同治疗效果时，双功能水蛭素的治疗剂量可以显著降低，由此减少出血等不良反应，具有更好的临床应用前景。
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6 水蛭素的临床应用前景
重组水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的凝血酶和血栓中与纤维蛋白结合的凝血酶结合，以防止血栓形成或血栓增大。临床研究发现:对于髋关节替换手术的病人，以重组水蛭素作为抗凝剂，较其它溶栓剂或小分子肝素，具有更好的预防深静脉血栓形成的效果。重组水蛭素比肝素更明显降低急性心肌梗死病人的死亡率和非致死性梗塞的发生率 [19] 。治疗不稳定型心绞痛或非Q波型心肌梗死也有与上述相同的结果 [20] 。此外，不稳定型心绞痛病人在血管成形术后30周内用重组水蛭素或肝素抗凝，预防再梗塞，两者的治疗效果类似。
目前，水蛭素主要适应证有治疗急性心肌梗死病人溶栓后辅助治疗心绞痛，预防和治疗深静脉血栓，Ⅱ型肝素相关性血小板减少症和弥慢性血管内凝血 [21] 。德国赫斯特公司的重组水蛭素于1999年上市，取得了令人鼓舞的结果。天然或重组水蛭素是高效、专一、安全的凝血酶抑制剂。与肝素、乙酰水杨酸等传统的抗凝药物相比，水蛭素治疗剂量小，疗效好，不良反应少而轻，不会引起过敏反应，是一种防治血栓性心血管疾病的良药。
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参考文献
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12 William L.Arterial thrombin activity after angioplasty in an atheroscleˉrotic rabbit model.Circulation，1996，94:88-93.
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作者单位:200032上海复旦大学教育部分子医学重点实验室
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