槲皮素、异鼠李素对HDL氧化修饰的逆转作用
【摘要】 目的 研究槲皮素(Quercetin，Que)、异鼠李素(Isorhamnetin，Iso)在体外对已受到Cu2+ 、Fe2+ 氧化修饰的人血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的作用。方法 采用一次性密度梯度法分离正常人血浆HDL，用Cu2+ 、Fe2+ 进行体外氧化修饰。抗氧化组在修饰后6h加Que或Iso(100μmol/L)作用不同时间(4h、8h、16h)。分别检测HDL中脂质过氧化物产物丙二醛(MDA)、维生素E含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 100μmol/L Que和Iso作用4h、8h后可分别明显抑制Fe 2+ -OX-HDL、Cu 2+ -OX-HDL中MDA生成(P<0.001)。Que和Iso作用8h、16h后可分别提高Cu2+ -OX-HDL、Fe2+ -OX-HDL中SOD活性(P<0.001);明显延缓维生素E含量降低(P<0.05)。结论 Que和Iso均对已受到Cu2+ 、Fe2+ 氧化修饰的HDL具有明显的抑制作用，但在对Cu2+ 、Fe2+ 氧化修饰的HDL，槲皮素、异鼠李素的作用存在差异。Que和Iso的作用机制可能与其抗自由基氧化有关，提示该类物质是一种良好的抗氧化剂，动脉粥样硬化(As)的防治有一定的运用价值。
, 百拇医药
关键词 高密度脂蛋白 氧化修饰 槲皮素 异鼠李素 动脉粥样硬化
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0684-03
The inhibitory effects of quercetin and isorhamnetin on
oxidative modification of HDL already induced by Cu 2+ in vitro
He Tao，Li Jiafu，Yang Ye，et al.
Department of Bicohemistry of LuZhou Medical College，LuZhou646000.
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To observe the effects of quercetin(Que)and isorhamnetin(Iso)on the oxidative modˉification of high，density lipoprotein(HDL)already induced by Cu2+ ，Fe2+ in vitro.Methods Human HDL was preˉpared by one-step ultracentrifuge and oxidized by Cu2+ ，Fe2+ in vitro.HDL was incubated with Que or Iso(100μmol/L)for different time(4h，8h，16h)after6h oxidation by Cu2+ or Fe2+ .The content of the production of lipid peroxide(MDA)，vitamin E(VitE)and activity of superoxide dismutase(SOD)in oxidized high density lipoproˉtein(OX-HDL)were determined.Results Compared with OX-HDL group，MDA production in Fe2+ -OX-HDL，Cu2+ -OX-HDL decreased significantly after4hor8h treatment with Que or Iso respectively(P<0.001).Que or Iso also markedlyelevated VitE level and SOD activities in Fe2+ -OX-HDL，Cu2+ -OX-HDL after8h or16h treatment(P<0.001，P<0.05respectively).Conclusion Que and Iso obviously inhibit oxidative modification of HDL already induced by Cu 2+ ，Fe 2+ .But for Fe 2+ -OX-HDL or Cu 2+ -OX-HDL there are some difference between Que and Iso treatment.The results suggest that the mechanism of the protective effect of both Que and Iso on oxidative modification of HDL may be associated with the inhibition of generation of oxygen free radicals and with the prevention of inactivation of SOD or VitE reducing.
, 百拇医药
Key words high density lipoprotein oxidative modification quercetin isorhmnetin atherosclerosis
大量流行病学调查资料表明，人群中血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)胆固醇浓度与冠心病患病率呈明显负相关。从转基因动物实验研究中观察到，改变HDL代谢相关基因，可明显影响试验动物动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的发生和发展 [1] 。目前已公认HDL具有抗As的作用。但研究发现，HDL可在体内和体外发生氧化修饰，并且一旦HDL被氧化修饰后，不但丧失其抗As作用，反而具有致动脉粥样硬化的作用 [2] 。故寻找抗氧化剂，抑制天然HDL的氧化修饰对As防治具有重要临床价值。我们以前的工作表明，黄酮类物质槲皮素(Quercetin，Que)、异鼠李素(Isorhamnetin，Iso)能有效抑制体外HDL的氧化修饰 [3] 。本文进一步观察Que和Iso对体外已受到Cu 2+ 、Fe2+ 介导的氧化修饰HDL(OX-HDL)的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 Que购于Sigma公司，Iso由四川美达康药业有限公司提供(纯度>98%)，NaBr(AR，成都临江化工厂生产)，CuSO4 、FeSO4 (AR，上海试剂一厂生产)，EDTA-2Na(AR，上海试剂厂生产)。722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司分析仪器总公司制造)，Beckman L-55M超速离心机。
1.2 方法
1.2.1 HDL的分离制备 取健康成人新鲜血，EDTA抗凝并分离血浆，采用一次性密度梯度离心法制备血浆脂蛋白 [4] ，收集HDL部分。在含EDTA-2Na的PBS中透析48h后，用脂蛋白预染电泳鉴定 [5] ，用改良Lowry法 [6] 测定蛋白质浓度，超滤除菌，4℃低温保存备用。
1.2.2 HDL的氧化修饰及实验分组 HDL(0.5mg/ml)置于终浓度为25μmol/L的CuSO4 、FeSO4 或PBS溶液中，37℃温育6h，用1mmol/L的EDTA-2Na终止修饰。HDL氧化修饰程度用脂质过氧化物代谢产物丙二醛(MDA)表示。
, 百拇医药
实验分为对照组(HDL组)，HDL氧化修饰组(Cu 2+ -OX-HDL组和Fe 2+ -OX-HDL组)和抗氧化组(Cu2+ -Que组和Fe 2+ -Iso组)。对照组以等量的PBS代替CuSO4 或FeSO4溶液，抗氧化组在HDL氧化修饰6h后加Que或Iso(100μmol/L)作用不同时间(4h、8h、16h)。
1.2.3 指标检测 脂蛋白中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法;维生素E测定采用菲罗啉还原法;SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，按试制盒说明书进行操作(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。所有数据均采用均数±标准差(ˉx±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 Que和Iso对已受到Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化修饰的HDL中MDA生成的影响 HDL经Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化修饰后，形成的OX-HDL中MDA含量显著升高(P<0.001);在终止修饰后加入不同浓度的Que和Iso作用不同时间后，与氧化修饰组相比，MDA值明显下降，并以作用8h效果最佳(见表1)。
, 百拇医药
表1 Que和Iso(100μmol/L)对Ox-HDL中MDA含量(nmol/mg·pro)的影响 (略 )
2.2 Que和Iso对OX-HDL中SOD活性的影响 HDL经 Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化后SOD活性明显降低(P<0.001)。分别加入100μmol/L的Que和Iso作用8h、16h后SOD活性显著提高(见表2)。
表2 Que和Iso对HDL中SOD活性(nU/mg·pro) 和维生素E含量(μg/mg.Pro)的影响(略 )
2.3 Que和Iso对OX-HDL中维生素E含量的影响 表2显示HDL经Cu2+ 、Fe2+ 氧化后，维生素E含量明显降低，除Cu2+ -OX-HDL+Que组外，加入100μmol/L的Que、Iso分别作用8h、16h则能显著抑制维生素E含量的降低。
, http://www.100md.com
3 讨论
天然HDL能介导泡沫细胞内胆固醇外流，具有抗As的作用，HDL一旦被氧化修饰，其蛋白质和脂质成分均发生改变，介导泡沫细胞内胆固醇外流能力明显下降，不利于As消退。此外，OX-HDL还可刺激平滑肌细胞增殖及原癌基因的表达，激活血小板，引起血小板聚集，促进血栓形成及As的发生 [7] 。因此，如何防止HDL的氧化，预防As的发生，已成为氧化修饰脂蛋白研究的重要课题之一。
过渡金属离子Cu 2+ 、Fe 2+ 是脂蛋白氧化修饰的前氧化剂，在脂蛋白溶液中只要存在微量的Cu 2+ 和Fe 2+ 即可诱导脂蛋白的氧化修饰。这是因为在脂蛋白中存在微量脂质过氧化物受到Cu 2+ 、Fe 2+ 催化能生成脂过氧基和脂氧基。这些脂自由基作为引发剂，引发脂质过氧化物的链式反应。黄酮类化合物作为脂自由基清除剂及金属离子螯合剂，在抑制脂蛋白的氧化修饰中发挥了重要的作用 [8] 。我们以前的工作表明槲皮素(Que)、异鼠李素(Iso)可在体外抑制Cu 2+ 或Fe 2+ 介导的HDL、LDL及VLDL的氧化修饰，槲皮素优于异鼠李素 [9，10] 。本文进一步探讨槲皮素(Que)、异鼠李素(Iso)对已受到Cu2+ 、Fe2+ 氧化修饰的HDL的是否具有逆转作用。结果显示在HDL氧化修饰6h后加入Que和Iso，温育8h后，可明显降低HDL中的MDA含量，其中Que对Cu 2+ 、Fe 2+ 介导的OX-HDL MDA生成的抑制作用相似，而Iso对Fe 2+ 介导的OX-HDL中MDA生成的抑制作用强于Cu 2+ 介导的OX-HDL。8h后Que和Iso均可显著提高Cu 2+ 介导的OX-HDL中的SOD活性，Que的作用优于Iso;16h时Que和Iso可使Fe 2+ 介导的OX-HDL中SOD活性，二者作用相似。16h时Que和Iso均可使Fe 2+ 介导的OX-HDL中维生素E含量增高，且作用效果类似;但在8h时，只有Iso能明显提高Cu 2+ -OX-HDL中的维生素E含量。表明Que和Iso对已受到氧化修饰的HDL具有逆转作用，是一类良好的抑制脂蛋白氧化修饰的天然抗氧化剂。Que和Iso的作用途径可能与其提高HDL中内源性抗氧化物质(SOD、维生素E)活性和阻断脂蛋白的自由基链式反应有关。但对其具体的作用机制尚需更深入的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Schultz JR，Rubin EM.The properties of HDL in genetically engineered mice.Curr Opin Lipidol，1994，5(2):126.
2 王浩川，刘秉文，傅明德.氧化修饰脂蛋白刺激人动脉平滑肌细胞DNA合成.生物化学与生物物理进展，1996，23(6):544.
3 李家富，何涛，邓辉胜，等.槲皮素、异鼠李素对体外HDL氧化修饰的保护作用.中华中西医杂志，2001，2(12):1057.
4 张华林，刘秉文.一次性密度体度超速离心分离人血清脂蛋白.生物化学与生物物理学报，1989，21(3):257.
5 王继贵.临床生化检验.第二版.长沙:湖南科学技术出版社，1996，355.
, http://www.100md.com
6 Markwell MA，Hass sm，Bieber LL，et al.A modification of Lowry proceˉdure to simplity porotein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal Biochem，1978，87(1):261.
7 傅强，刘秉文.氧化修饰高密度脂蛋白研究进展.生物化学与生物物理进展，2000，27(3):544.
8 Michael GL Herlog，Edith JMFeskens，Peter CH Hollman，et al.Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease:the Zutphon Elˉdery Study.Lancet，1993，342:1007-1011.
9 吴明泸，何涛，李家富，等.槲皮素、异鼠李素对Cu 2+ 介导的LDL氧化修饰的抑制作用.泸州医学院学报，2000，23(3):185.
10 李蓉晖，何涛，李家富，等.槲皮素、异鼠李素对Cu 2+ 介导的极低密度脂蛋白氧化修饰的影响.华西医科大学学报，2001，32(2):281. (编辑 何蓓), http://www.100md.com
, 百拇医药
关键词 高密度脂蛋白 氧化修饰 槲皮素 异鼠李素 动脉粥样硬化
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0684-03
The inhibitory effects of quercetin and isorhamnetin on
oxidative modification of HDL already induced by Cu 2+ in vitro
He Tao，Li Jiafu，Yang Ye，et al.
Department of Bicohemistry of LuZhou Medical College，LuZhou646000.
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To observe the effects of quercetin(Que)and isorhamnetin(Iso)on the oxidative modˉification of high，density lipoprotein(HDL)already induced by Cu2+ ，Fe2+ in vitro.Methods Human HDL was preˉpared by one-step ultracentrifuge and oxidized by Cu2+ ，Fe2+ in vitro.HDL was incubated with Que or Iso(100μmol/L)for different time(4h，8h，16h)after6h oxidation by Cu2+ or Fe2+ .The content of the production of lipid peroxide(MDA)，vitamin E(VitE)and activity of superoxide dismutase(SOD)in oxidized high density lipoproˉtein(OX-HDL)were determined.Results Compared with OX-HDL group，MDA production in Fe2+ -OX-HDL，Cu2+ -OX-HDL decreased significantly after4hor8h treatment with Que or Iso respectively(P<0.001).Que or Iso also markedlyelevated VitE level and SOD activities in Fe2+ -OX-HDL，Cu2+ -OX-HDL after8h or16h treatment(P<0.001，P<0.05respectively).Conclusion Que and Iso obviously inhibit oxidative modification of HDL already induced by Cu 2+ ，Fe 2+ .But for Fe 2+ -OX-HDL or Cu 2+ -OX-HDL there are some difference between Que and Iso treatment.The results suggest that the mechanism of the protective effect of both Que and Iso on oxidative modification of HDL may be associated with the inhibition of generation of oxygen free radicals and with the prevention of inactivation of SOD or VitE reducing.
, 百拇医药
Key words high density lipoprotein oxidative modification quercetin isorhmnetin atherosclerosis
大量流行病学调查资料表明，人群中血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)胆固醇浓度与冠心病患病率呈明显负相关。从转基因动物实验研究中观察到，改变HDL代谢相关基因，可明显影响试验动物动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的发生和发展 [1] 。目前已公认HDL具有抗As的作用。但研究发现，HDL可在体内和体外发生氧化修饰，并且一旦HDL被氧化修饰后，不但丧失其抗As作用，反而具有致动脉粥样硬化的作用 [2] 。故寻找抗氧化剂，抑制天然HDL的氧化修饰对As防治具有重要临床价值。我们以前的工作表明，黄酮类物质槲皮素(Quercetin，Que)、异鼠李素(Isorhamnetin，Iso)能有效抑制体外HDL的氧化修饰 [3] 。本文进一步观察Que和Iso对体外已受到Cu 2+ 、Fe2+ 介导的氧化修饰HDL(OX-HDL)的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 Que购于Sigma公司，Iso由四川美达康药业有限公司提供(纯度>98%)，NaBr(AR，成都临江化工厂生产)，CuSO4 、FeSO4 (AR，上海试剂一厂生产)，EDTA-2Na(AR，上海试剂厂生产)。722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司分析仪器总公司制造)，Beckman L-55M超速离心机。
1.2 方法
1.2.1 HDL的分离制备 取健康成人新鲜血，EDTA抗凝并分离血浆，采用一次性密度梯度离心法制备血浆脂蛋白 [4] ，收集HDL部分。在含EDTA-2Na的PBS中透析48h后，用脂蛋白预染电泳鉴定 [5] ，用改良Lowry法 [6] 测定蛋白质浓度，超滤除菌，4℃低温保存备用。
1.2.2 HDL的氧化修饰及实验分组 HDL(0.5mg/ml)置于终浓度为25μmol/L的CuSO4 、FeSO4 或PBS溶液中，37℃温育6h，用1mmol/L的EDTA-2Na终止修饰。HDL氧化修饰程度用脂质过氧化物代谢产物丙二醛(MDA)表示。
, 百拇医药
实验分为对照组(HDL组)，HDL氧化修饰组(Cu 2+ -OX-HDL组和Fe 2+ -OX-HDL组)和抗氧化组(Cu2+ -Que组和Fe 2+ -Iso组)。对照组以等量的PBS代替CuSO4 或FeSO4溶液，抗氧化组在HDL氧化修饰6h后加Que或Iso(100μmol/L)作用不同时间(4h、8h、16h)。
1.2.3 指标检测 脂蛋白中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法;维生素E测定采用菲罗啉还原法;SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，按试制盒说明书进行操作(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。所有数据均采用均数±标准差(ˉx±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 Que和Iso对已受到Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化修饰的HDL中MDA生成的影响 HDL经Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化修饰后，形成的OX-HDL中MDA含量显著升高(P<0.001);在终止修饰后加入不同浓度的Que和Iso作用不同时间后，与氧化修饰组相比，MDA值明显下降，并以作用8h效果最佳(见表1)。
, 百拇医药
表1 Que和Iso(100μmol/L)对Ox-HDL中MDA含量(nmol/mg·pro)的影响 (略 )
2.2 Que和Iso对OX-HDL中SOD活性的影响 HDL经 Cu 2+ 、Fe 2+ 氧化后SOD活性明显降低(P<0.001)。分别加入100μmol/L的Que和Iso作用8h、16h后SOD活性显著提高(见表2)。
表2 Que和Iso对HDL中SOD活性(nU/mg·pro) 和维生素E含量(μg/mg.Pro)的影响(略 )
2.3 Que和Iso对OX-HDL中维生素E含量的影响 表2显示HDL经Cu2+ 、Fe2+ 氧化后，维生素E含量明显降低，除Cu2+ -OX-HDL+Que组外，加入100μmol/L的Que、Iso分别作用8h、16h则能显著抑制维生素E含量的降低。
, http://www.100md.com
3 讨论
天然HDL能介导泡沫细胞内胆固醇外流，具有抗As的作用，HDL一旦被氧化修饰，其蛋白质和脂质成分均发生改变，介导泡沫细胞内胆固醇外流能力明显下降，不利于As消退。此外，OX-HDL还可刺激平滑肌细胞增殖及原癌基因的表达，激活血小板，引起血小板聚集，促进血栓形成及As的发生 [7] 。因此，如何防止HDL的氧化，预防As的发生，已成为氧化修饰脂蛋白研究的重要课题之一。
过渡金属离子Cu 2+ 、Fe 2+ 是脂蛋白氧化修饰的前氧化剂，在脂蛋白溶液中只要存在微量的Cu 2+ 和Fe 2+ 即可诱导脂蛋白的氧化修饰。这是因为在脂蛋白中存在微量脂质过氧化物受到Cu 2+ 、Fe 2+ 催化能生成脂过氧基和脂氧基。这些脂自由基作为引发剂，引发脂质过氧化物的链式反应。黄酮类化合物作为脂自由基清除剂及金属离子螯合剂，在抑制脂蛋白的氧化修饰中发挥了重要的作用 [8] 。我们以前的工作表明槲皮素(Que)、异鼠李素(Iso)可在体外抑制Cu 2+ 或Fe 2+ 介导的HDL、LDL及VLDL的氧化修饰，槲皮素优于异鼠李素 [9，10] 。本文进一步探讨槲皮素(Que)、异鼠李素(Iso)对已受到Cu2+ 、Fe2+ 氧化修饰的HDL的是否具有逆转作用。结果显示在HDL氧化修饰6h后加入Que和Iso，温育8h后，可明显降低HDL中的MDA含量，其中Que对Cu 2+ 、Fe 2+ 介导的OX-HDL MDA生成的抑制作用相似，而Iso对Fe 2+ 介导的OX-HDL中MDA生成的抑制作用强于Cu 2+ 介导的OX-HDL。8h后Que和Iso均可显著提高Cu 2+ 介导的OX-HDL中的SOD活性，Que的作用优于Iso;16h时Que和Iso可使Fe 2+ 介导的OX-HDL中SOD活性，二者作用相似。16h时Que和Iso均可使Fe 2+ 介导的OX-HDL中维生素E含量增高，且作用效果类似;但在8h时，只有Iso能明显提高Cu 2+ -OX-HDL中的维生素E含量。表明Que和Iso对已受到氧化修饰的HDL具有逆转作用，是一类良好的抑制脂蛋白氧化修饰的天然抗氧化剂。Que和Iso的作用途径可能与其提高HDL中内源性抗氧化物质(SOD、维生素E)活性和阻断脂蛋白的自由基链式反应有关。但对其具体的作用机制尚需更深入的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Schultz JR，Rubin EM.The properties of HDL in genetically engineered mice.Curr Opin Lipidol，1994，5(2):126.
2 王浩川，刘秉文，傅明德.氧化修饰脂蛋白刺激人动脉平滑肌细胞DNA合成.生物化学与生物物理进展，1996，23(6):544.
3 李家富，何涛，邓辉胜，等.槲皮素、异鼠李素对体外HDL氧化修饰的保护作用.中华中西医杂志，2001，2(12):1057.
4 张华林，刘秉文.一次性密度体度超速离心分离人血清脂蛋白.生物化学与生物物理学报，1989，21(3):257.
5 王继贵.临床生化检验.第二版.长沙:湖南科学技术出版社，1996，355.
, http://www.100md.com
6 Markwell MA，Hass sm，Bieber LL，et al.A modification of Lowry proceˉdure to simplity porotein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal Biochem，1978，87(1):261.
7 傅强，刘秉文.氧化修饰高密度脂蛋白研究进展.生物化学与生物物理进展，2000，27(3):544.
8 Michael GL Herlog，Edith JMFeskens，Peter CH Hollman，et al.Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease:the Zutphon Elˉdery Study.Lancet，1993，342:1007-1011.
9 吴明泸，何涛，李家富，等.槲皮素、异鼠李素对Cu 2+ 介导的LDL氧化修饰的抑制作用.泸州医学院学报，2000，23(3):185.
10 李蓉晖，何涛，李家富，等.槲皮素、异鼠李素对Cu 2+ 介导的极低密度脂蛋白氧化修饰的影响.华西医科大学学报，2001，32(2):281. (编辑 何蓓), http://www.100md.com