粒细胞集落刺激因子调节Th1Th2的体外实验研究
【摘要】 目的 研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在体外对Th1/Th2的调节作用。方法 10例健康成人志愿者的外周血单个核细胞(PBMC)和G-CSF培养24h后，用流式细胞仪(FCM)检测CD4 + 细胞内细胞因子的表达及Th1/Th2细胞表面AnnexinV的表达。结果 G-CSF(100ng/ml)作用于PBMC后，CD4 + 细胞IL-4表达明显增高，IFN-γ表达下降;Th1和Th2细胞表面AnnexinV的表达差异无显著性。结论 G-CSF能够调节Th1/Th2之间的平衡，使Th1向Th2转化，这可能在外周造血干细胞移植(PBSCT)中起重要作用。
关键词 G-CSF Th1/Th2 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0025-02
Experimental study on modulating Th1/Th2by granulocyte colony-stimulating
, http://www.100md.com
factor in vitro Guo Hongfeng，Gao Zhiying，Zhu Lei，et al.
Datong Institute，Shanxi Medical University，Datong037008.
【Abstract】 Objective To study the modulating Th1/Th2by granulocyte colony stimulating factor in vitro.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMC)from10normal volunteers were cultured with G-CSF for24h.Cytokine production by CD4 + cells and expression of AnnexinV in Th1/Th2cells were measured by flow cytomeˉtry(FCM).Results G-CSF decreasing IFN-γand increasing IL-4production werefound in vitro.Expression of AnnexinV was not significantly different between Th1/Th2cells.Conclusion G-CSF polarizes the balance within the T lymphocyte subpopulations toward the production of Th2cytokines，and these effect may be important in PBSCT.
, 百拇医药
Key words G-CSF Th1/Th2 apoptosis
异基因外周造血干细胞移植(allo-PBSCT)已广泛应用于临床，它具有造血及免疫恢复快的优点 [1] ，尽管粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血干细胞移植物中含有比骨髓移植物中多10倍以上的T细胞 [2] ，但allo-PBSCT后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发病率及严重程度并未增加 [1] ，这可能和G-CSF对供者T细胞的免疫调节有关。T细胞据其分泌细胞因子的不同，分为Th1和Th2细胞，Th1产生IL-2、IFN-γ等细胞因子，Th2产生IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子。目前已认识，Th1细胞在aGVHD的发生发展中具有重要作用。我们研究了G-CSF在体外对Th1/Th2的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 G-CSF、PMA、离子霉素购自Sigma公司，GolˉgiStop(蛋白转运抑制剂)、荧光标记单克隆抗体(抗CD4-PerCP，抗IFN-γ-FITC，抗IL-4-PE，抗AnnexinV-PE，抗AnnexinV-FITC)、Cytofix/Cytoperm溶液和Perm/Wash缓冲液购自PharMigen公司。
, http://www.100md.com
1.2 G-CSF作用 取肝素抗凝的健康志愿者外周血10ml，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用10%RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×10 6 /ml，接种于24孔板，每孔1ml，每一志愿者的PBMC分为三组:无G-CSF组，10ng/ml G-CSF组，100ng/ml G-CSF组，分别加于三个孔，5%CO 2 、37℃孵育72h。
1.3 细胞因子及AnnexinV的检测 PBMC和G-CSF作用后，再在每孔加入20ng/ml PMA、1μM离子霉素和0.7μl GolˉgiStop，50%CO 2 、37℃孵育4h后，洗涤，加入抗CD4、抗AnˉnexinV抗体，避光放置15min，然后加入cytofix/cytoperm溶液固定破膜20min，用Perm/Wash溶液洗涤后，加入抗IL-4、IFN-γ抗体，避光30min，洗涤后，上机检测，随机软件分析结果。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用成组设计的两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 G-CSF使CD4细胞中IL-4增加、IFN-γ减少 正常PBMC和不同浓度的G-CSF孵育，在G-CSF100ng/ml组，FCM分析显示表达IFN-γ的CD4 + 细胞数减少，而表达IL-4的CD4 + 细胞数增加(表1)。G-CSF对T细胞的作用是有剂量依赖性的。
表1 G-CSF对CD4 + 细胞表达细胞因子的影响
注:与无G-CSF组比较 ˇ P<0.01
2.2 Th1和Th2细胞表面AnnexinV的表达 在G-CSF100ng/ml组，Th1和Th2细胞表面AnnexinV的表达为4.21±0.57、4.03±0.69，二者间差异无显著性，分别与无G-CSF组(3.87±0.71，3.99±0.47)比较，差异无显著性。
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3 讨论
我们的实验结果显示，G-CSF在体外作用于T淋巴细胞，使CD4 + 细胞IFN-γ的表达减少，IL-4的表达明显增加，和体内作用的结果一致 [3] 。在G-CSF动员后的外周血移植物中，混有大量的单核细胞，它们可能介导了G-CSF对T淋巴细胞的免疫调节。研究报道 G-CSF和Th1/Th2的调节直接作用于CD4 + 细胞，而这种作用并不依赖于单核细胞的存在。G-CSF调节T细胞由Th1向Th2转化，推测可能是由于某一亚型发生凋亡，或某一亚型优势生存所致。我们研究了G-CSF作用后Th1、Th2细胞凋亡率的改变，发现这种Th1/Th2模式的改变，不是通过优先排除Th1细胞，而是通过免疫调节来实现的。D’Garra [4] 的研究认为局部细胞因子微环境起了非常重要的作用，而Risˉsoan [5] 等认为Th的分化由体内功能最强的抗原呈递细胞DC所控制，DC1分泌IL-12，作用于Th0使之向Th1型细胞分化;DC2分泌IL-4，作用于Th0使之向Th2分化。
, http://www.100md.com
目前研究认为G-CSF可能增加了DC2的效力，从而诱导供者 淋巴细胞自身肽的呈递和Th2的转化。我们的实验结果显示G-CSF除了能够刺激造血干细胞增殖分化外，还具有对T淋巴细胞的免疫调节作用，使Th1向Th2转化，这可能是allo-PBSCT后aGVHD发病率及严重程度并未增加的原因之一。
参考文献
1 王峰蓉，黄晓军，任汉云，等.异基因外周血干细胞移植治疗恶性血液病.中华血液学杂志，2002，23:403-406.
2 Champlin RE，Schmitz N，Horowiz MM，et al.Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopietic cells for allogeneic transˉplantation.Blood，2000，95:3702-3709.
, 百拇医药
3 Sloand EM，Kim S，Maciejewski JP，et al.Pharmacologic doses of granuˉlocyte colony-stimulating factor affect cytokine production by lymphoˉcytes in vitro and in vivo.Blood，2000，95:2269-2274.
4 O’Garra A.Cytokines induce the development of functionally heterogeˉneous T helper cell subsets.Immunity，1998，8:275-283.
5 Rissoan MC，Soumelis V，Kadowaki N，et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.Science，1999，283:1183-1186.
作者单位:037008山西医科大学大同学院内科教研室
030001山西医科大学第二附属医院血液科
(编辑李 木), 百拇医药(郭宏锋 高志英 朱镭 鹿育晋)
关键词 G-CSF Th1/Th2 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0025-02
Experimental study on modulating Th1/Th2by granulocyte colony-stimulating
, http://www.100md.com
factor in vitro Guo Hongfeng，Gao Zhiying，Zhu Lei，et al.
Datong Institute，Shanxi Medical University，Datong037008.
【Abstract】 Objective To study the modulating Th1/Th2by granulocyte colony stimulating factor in vitro.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMC)from10normal volunteers were cultured with G-CSF for24h.Cytokine production by CD4 + cells and expression of AnnexinV in Th1/Th2cells were measured by flow cytomeˉtry(FCM).Results G-CSF decreasing IFN-γand increasing IL-4production werefound in vitro.Expression of AnnexinV was not significantly different between Th1/Th2cells.Conclusion G-CSF polarizes the balance within the T lymphocyte subpopulations toward the production of Th2cytokines，and these effect may be important in PBSCT.
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Key words G-CSF Th1/Th2 apoptosis
异基因外周造血干细胞移植(allo-PBSCT)已广泛应用于临床，它具有造血及免疫恢复快的优点 [1] ，尽管粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血干细胞移植物中含有比骨髓移植物中多10倍以上的T细胞 [2] ，但allo-PBSCT后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发病率及严重程度并未增加 [1] ，这可能和G-CSF对供者T细胞的免疫调节有关。T细胞据其分泌细胞因子的不同，分为Th1和Th2细胞，Th1产生IL-2、IFN-γ等细胞因子，Th2产生IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子。目前已认识，Th1细胞在aGVHD的发生发展中具有重要作用。我们研究了G-CSF在体外对Th1/Th2的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 G-CSF、PMA、离子霉素购自Sigma公司，GolˉgiStop(蛋白转运抑制剂)、荧光标记单克隆抗体(抗CD4-PerCP，抗IFN-γ-FITC，抗IL-4-PE，抗AnnexinV-PE，抗AnnexinV-FITC)、Cytofix/Cytoperm溶液和Perm/Wash缓冲液购自PharMigen公司。
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1.2 G-CSF作用 取肝素抗凝的健康志愿者外周血10ml，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用10%RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×10 6 /ml，接种于24孔板，每孔1ml，每一志愿者的PBMC分为三组:无G-CSF组，10ng/ml G-CSF组，100ng/ml G-CSF组，分别加于三个孔，5%CO 2 、37℃孵育72h。
1.3 细胞因子及AnnexinV的检测 PBMC和G-CSF作用后，再在每孔加入20ng/ml PMA、1μM离子霉素和0.7μl GolˉgiStop，50%CO 2 、37℃孵育4h后，洗涤，加入抗CD4、抗AnˉnexinV抗体，避光放置15min，然后加入cytofix/cytoperm溶液固定破膜20min，用Perm/Wash溶液洗涤后，加入抗IL-4、IFN-γ抗体，避光30min，洗涤后，上机检测，随机软件分析结果。
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1.4 统计学方法 采用成组设计的两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 G-CSF使CD4细胞中IL-4增加、IFN-γ减少 正常PBMC和不同浓度的G-CSF孵育，在G-CSF100ng/ml组，FCM分析显示表达IFN-γ的CD4 + 细胞数减少，而表达IL-4的CD4 + 细胞数增加(表1)。G-CSF对T细胞的作用是有剂量依赖性的。
表1 G-CSF对CD4 + 细胞表达细胞因子的影响
注:与无G-CSF组比较 ˇ P<0.01
2.2 Th1和Th2细胞表面AnnexinV的表达 在G-CSF100ng/ml组，Th1和Th2细胞表面AnnexinV的表达为4.21±0.57、4.03±0.69，二者间差异无显著性，分别与无G-CSF组(3.87±0.71，3.99±0.47)比较，差异无显著性。
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3 讨论
我们的实验结果显示，G-CSF在体外作用于T淋巴细胞，使CD4 + 细胞IFN-γ的表达减少，IL-4的表达明显增加，和体内作用的结果一致 [3] 。在G-CSF动员后的外周血移植物中，混有大量的单核细胞，它们可能介导了G-CSF对T淋巴细胞的免疫调节。研究报道 G-CSF和Th1/Th2的调节直接作用于CD4 + 细胞，而这种作用并不依赖于单核细胞的存在。G-CSF调节T细胞由Th1向Th2转化，推测可能是由于某一亚型发生凋亡，或某一亚型优势生存所致。我们研究了G-CSF作用后Th1、Th2细胞凋亡率的改变，发现这种Th1/Th2模式的改变，不是通过优先排除Th1细胞，而是通过免疫调节来实现的。D’Garra [4] 的研究认为局部细胞因子微环境起了非常重要的作用，而Risˉsoan [5] 等认为Th的分化由体内功能最强的抗原呈递细胞DC所控制，DC1分泌IL-12，作用于Th0使之向Th1型细胞分化;DC2分泌IL-4，作用于Th0使之向Th2分化。
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目前研究认为G-CSF可能增加了DC2的效力，从而诱导供者 淋巴细胞自身肽的呈递和Th2的转化。我们的实验结果显示G-CSF除了能够刺激造血干细胞增殖分化外，还具有对T淋巴细胞的免疫调节作用，使Th1向Th2转化，这可能是allo-PBSCT后aGVHD发病率及严重程度并未增加的原因之一。
参考文献
1 王峰蓉，黄晓军，任汉云，等.异基因外周血干细胞移植治疗恶性血液病.中华血液学杂志，2002，23:403-406.
2 Champlin RE，Schmitz N，Horowiz MM，et al.Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopietic cells for allogeneic transˉplantation.Blood，2000，95:3702-3709.
, 百拇医药
3 Sloand EM，Kim S，Maciejewski JP，et al.Pharmacologic doses of granuˉlocyte colony-stimulating factor affect cytokine production by lymphoˉcytes in vitro and in vivo.Blood，2000，95:2269-2274.
4 O’Garra A.Cytokines induce the development of functionally heterogeˉneous T helper cell subsets.Immunity，1998，8:275-283.
5 Rissoan MC，Soumelis V，Kadowaki N，et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.Science，1999，283:1183-1186.
作者单位:037008山西医科大学大同学院内科教研室
030001山西医科大学第二附属医院血液科
(编辑李 木), 百拇医药(郭宏锋 高志英 朱镭 鹿育晋)