线粒体DNA3316G→A基因突变与糖尿病的关系
【摘要】 目的 探讨糖尿病(DM)患者线粒体DNA(mtDNA)NADH脱氢酶亚单位1基因(ND-1)3316G→A基因突变情况及临床特点。方法 提取100例DM患者和50例空腹和餐后2h血糖正常、无DM家族史对照者外周血DNA，用聚合酶链反应扩增mtDNA3307-3610基因片段直接测序。并对DM患者分别进行眼底镜检查、测定体重指数、24h尿蛋白定量，了解代谢控制、胰岛素抵抗和胰岛细胞自身抗体阳性情况。结果 100例DM患者有6例出现mtDNA3316G→A基因突变。6例患者大多数存在胰岛素抵抗，高脂血症。有4/6例出现24h尿蛋白异常，3/6例出现糖尿病视网膜病变及部分患者胰岛细胞自身抗体阳性。结论 mtDNA3316G→A基因突变携带者发病与胰岛素抵抗和高脂血症有关。因此，有DM家族史的人群必须及早控制体重和高脂血症。
关键词 线粒体DNA 基因突变 糖尿病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)02-0106-03
, 百拇医药
The association of point mutation3316G→A of mitochodrian DNA with diabetes mullitus.
Wang Cuifang，Cui Zhichu，Yang Ling，et al.
Affiliated Hospital of Nan-tong Medical College，Nan-tong226001.
【Abstract】 Objective To investigate the incidence and clinical characteristics of mitochondrial DNA NADH dehydrogenase subunit1(mtDNA ND1)3316G→A gene mutation in diabetic patients.Methods One hundred paˉtients with diabetes mellitus(DM)and fifty controls with normal glucose tolerance and absence of DM family history were included.The target fragments amplified by polymerase chain reaction by PCR.Genetic analyses were performed in all of them.Clinicl analyses were performed in patients with the point mutation.Results In diabetic patients the frequencies of point mutation3316G→A in mt DNA were6%respectively but none incontrols.Most of the patients with3316G→A points mutation had higher blood lipid and had insulin resistence.The3/6of the patiens had higher urinary protine leveles in24h.and3/6had diabetic retinopathy.Conclusion The diabetic patients with3316G→A points mutation onset is related to higher blood lipid and had insulin resistence.So，the people with DM family history must as early as to control weight of body and blood lipid abnormalities.
, 百拇医药
Key words mitochondrial DNA gene mutation diabetes mullitus Nakagawa等 [1]
于1995年报道了mtDNA ND-13316位点发生突变以来，各国学者均对此进行了一系列的研究，国内也对mtDNA3316G→A突变进行了多项研究。有学者认为3316G→A占突变可能是一种2型糖尿病(T2DM)和谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体阳性的1型糖尿病(T1DM)的易感因素 [2] 。也有认为3316G→A点突变是增龄和肥胖而致的易感因子 [3，4] 。为探讨3316G→A点突变与DM的关系我们进行了下列研究。
1 对象与方法
1.1 对象 受试者为在我院住院治疗的100例无亲缘关系的DM患者(按照WHO1999年DM诊断标准)。男41例，女59例。年龄14～95岁，平均(54±16)岁。无DM家族史对照组50人，空腹和餐后2h血糖均正常。男22例，女28例，年龄28～81岁，平均(50±16)岁。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 体格检查 脱鞋着内衣测量身高、体重，计算体重指数(BM1)。
1.2.2 糖、脂代谢测定 葡萄糖氧化酶法测定空腹葡萄糖(FBG);酶联免疫分析方法测定空腹血清胰岛素、C肽水平;全自动生化测定仪测定血浆总胆固醇(TC酶法)、甘油三酯(TG酶法)，磺柳酸法测定24h尿蛋白定量。
1.2.3 胰岛素抵抗 按照稳态模型评估法(HOMA)估计胰岛素抵抗(HOMA-IR)程度。行上述检查时停用胰岛素12h以上，口服降糖药(OHA)以及降脂药物1周以上。
1.2.4 GADA与ICA测定 采用酶联免疫吸附(ELISA)测定谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和胰岛细胞抗体(ICA)。
1.2.5 糖尿病视网膜病变 由专人行眼底镜检查。
, 百拇医药
1.3 基因测序
1.3.1 mtDNA提取 抽取受试者外周血3ml，用蛋白酶K快速裂解消化法提取白细胞总DNA。
1.3.2 聚合酶链反应(PCR) 上游引物为5′-TTCAˉCAAAGCGCCTTCCCCC-3′，下游5′-GGCCTAGGTTGAGGTTG ACC-3′，引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。反应物在PE9600上扩增，94℃预变性5min后，93℃45s，55℃45s，70℃90s，30次循环，最后72℃延伸5min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
1.3.3 序列测定 所有样品送中科院上海植物生理生态研究所予3307-3610基因片段测序，测序仪为美国Beckman2000型。
2 结果
, 百拇医药 2.1 线粒体DNA ND-13316G→A基因突变检出情况 100例DM患者中发现6例阳性病人见表1，对照组无一例阳性。3例阳性病例除3316位点突变外，还伴随其它位点突变。
2.2 ND-13316G→A突变患者的临床资料 6例3316G→A基因突变的患者大多数有脂代谢紊乱、尿蛋白高于正常、糖尿病视网膜病变(DR)，见表2。
表1 ND-13316G→A基因突变DM患者检出率
表2 3316G→A基因突变DM患者临床表现
注:M:男性;F:女性;BMI:体重指数;IR:稳态模型评估胰岛素抵抗;BP:血压;TC:总胆固醇;TG:甘油三酯;INS:胰岛素;CP:C肽;DR:糖尿病视网膜病变;GADA:谷氨酸脱羧酶抗体;ICA:胰岛细胞抗体
3 讨论
, 百拇医药
近年来随着对线粒体疾病研究的深入，发现至少20多种线粒体基因突变与DM有关 [5] 。线粒体DM是一大类异质性疾病，随着研究的深入必然要进行分类。实验表明，若线粒体氧化磷酸化过程受损，则胰岛素分泌受到抑制。线粒体产生的ATP至少在葡萄糖激酶的磷酸化和ATP依赖性K + 通道的关闭过程中参与胰岛素的分泌。3316G→A突变经流行病学调查证实，它在DM人群中高发(2%～4%)。而我们的研究发现3316G→A突变在DM人群中占6%，明显高于国内外报道。可能是因为选择研究对象不同或存在地区差异。以往的研究，有的是在T2DM进行筛选，有的研究对象有年龄限制。而更为重要的是:其它研究首先用聚合酶链反应扩增，限制性内切酶MSCL消化进行突变筛选，而我们每一例DM患者均进行基因测序，致阳性率明显提高。mtDNA3316G→A突变为丙氨酸突变为苏氨酸(GCC→ACC)。多项研究证实3316G→A转换是同质型突变，而mtDNA同质型突变往往只能轻度影响线粒体功能，仅使机体对某种疾病的易感性增高，在其他因子(如基因突变，环境因子或合并其他遗传性mtDNA突变)的协同作用下发病。无肥胖时，合成的胰岛素尚可满足机体需要。一旦发生肥胖，胰岛B细胞功能失代偿，INS分泌不足从而诱导DM发生。也有学者认为mtDNA突变的DM患者，胰岛素分泌大致正常而葡萄糖感受系统功能不完全。糖代谢的异常一方面引起胰岛素分泌障碍，另一方面存在胰岛素抵抗。
, 百拇医药
我们的研究发现，大多数3316G→A基因突变DM患者的 CP值均在正常范围，且大多数患者存在高胰岛素血症。证实3316G→A基因突变者的发病与胰岛素抵抗有关。Liang等 [6] 认为，DM患者或糖耐量异常者mtDNA突变率高，是由于年龄或高血糖造成的。已有大量的证据支持衰老过程中存在mtDNA突变。mtDNA缺失随增龄不断积聚，而高血糖通过氧自由基诱导mtDNA损伤，增加其mtDˉNA突变率 [7] 。故有学者把衰老看成是一种与年龄有关的线粒体疾病。也有研究发现肥胖和老龄是DM携带3316G→A突变者发病的共同特点 [4] ，认为肥胖和增龄与mtDNA3316G→A突变者发病有关。但也有研究认为 [3] 年龄不是发生这种现象的主要因素，可能还存在其他因素的协同作用。我们的研究发现，在6例3316G→A点突变患者中，有5人发病年龄>45岁，其中3人除3316G→A位点突变外，还存在其它不同位点的突变。4例患者大多数存在脂代谢紊乱。因此，基因突变不排除与增龄及长期高血脂、脂代谢紊乱有关。有研究认为mtDNA3316G→A突变引起的DM病情较轻，大多数仅需口服降糖药治疗。但我们发现，3316G→A突变的DM患者部分存在血清胰岛自身抗体阳性，且同样出现糖尿病肾病和/或糖尿病视网膜病变等并发症，一般认为ICA和GAD阳性与胰岛B细胞免疫性损伤有关。国内萧氏也发现GAD阳性的1型DMND-13316G→A突变发生率显著高于对照组，认为mtDNA3316G→A突变者与1型DM有关 [2] 。因此，我们认为3316G→A突变的DM患者必要时需及早使用胰岛素控制血糖以保护胰岛B细胞功能，避免DM慢性并发症的发生。DM患者ND-13316G→A突变率明显高于正常人，且随年龄增高而增加，大都伴有高脂血症和胰岛素抵抗，部分患者免疫性抗体阳性。因此，有DM家族史的人群必须尽早控制体重和纠正脂代谢紊乱。
, 百拇医药
参考文献
1 Nakagawa Y，Lkegami H，Yamato E，et al.A new mitochondrial DNA mutation associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus.Biophys Res Commun，1995，209:664-668.
2 萧建中，于志清，徐明，等.线粒体基因np3316G→A突变与糖尿病.中国糖尿病杂志，1999，7:330-333.
3 钱杰，张丽容.线粒体DNA ND-1基因点突变与2型糖尿病的关系.中华内分泌代谢杂志，2003，19:46-47.
4 赵青，张丽容.线粒体DNA ND-1基因nt3316G→A突变与2型糖尿病的关系.中华内分泌代谢杂志，2001，17:158-159.
, http://www.100md.com
5 李永航.线粒体糖尿病研究进展.国外医学·内分泌学分册，2000，20:252-255.
6 Liang P，Hughes V，Fukagawa NK.Inoreased prevalence of mitochondrial DNA deletions in sbdetal muscle of older individuals with impaired gluˉcose tolerance:possible marber of glycemic tress.Diabetes，1997，46:920-923.
7 Fukagawa NK，Lim，Liang P，et al.Aging and high concentrations of gluˉcose poten tiate injury to mitochondrial DNA.Free Radic Biol Med，1999，27:1437-1443.
作者单位:226001江苏南通医学院附属医院
200032上海中科院上海植物生理生态研究所
(编辑海 涛), 百拇医药(王粹芳)
关键词 线粒体DNA 基因突变 糖尿病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)02-0106-03
, 百拇医药
The association of point mutation3316G→A of mitochodrian DNA with diabetes mullitus.
Wang Cuifang，Cui Zhichu，Yang Ling，et al.
Affiliated Hospital of Nan-tong Medical College，Nan-tong226001.
【Abstract】 Objective To investigate the incidence and clinical characteristics of mitochondrial DNA NADH dehydrogenase subunit1(mtDNA ND1)3316G→A gene mutation in diabetic patients.Methods One hundred paˉtients with diabetes mellitus(DM)and fifty controls with normal glucose tolerance and absence of DM family history were included.The target fragments amplified by polymerase chain reaction by PCR.Genetic analyses were performed in all of them.Clinicl analyses were performed in patients with the point mutation.Results In diabetic patients the frequencies of point mutation3316G→A in mt DNA were6%respectively but none incontrols.Most of the patients with3316G→A points mutation had higher blood lipid and had insulin resistence.The3/6of the patiens had higher urinary protine leveles in24h.and3/6had diabetic retinopathy.Conclusion The diabetic patients with3316G→A points mutation onset is related to higher blood lipid and had insulin resistence.So，the people with DM family history must as early as to control weight of body and blood lipid abnormalities.
, 百拇医药
Key words mitochondrial DNA gene mutation diabetes mullitus Nakagawa等 [1]
于1995年报道了mtDNA ND-13316位点发生突变以来，各国学者均对此进行了一系列的研究，国内也对mtDNA3316G→A突变进行了多项研究。有学者认为3316G→A占突变可能是一种2型糖尿病(T2DM)和谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体阳性的1型糖尿病(T1DM)的易感因素 [2] 。也有认为3316G→A点突变是增龄和肥胖而致的易感因子 [3，4] 。为探讨3316G→A点突变与DM的关系我们进行了下列研究。
1 对象与方法
1.1 对象 受试者为在我院住院治疗的100例无亲缘关系的DM患者(按照WHO1999年DM诊断标准)。男41例，女59例。年龄14～95岁，平均(54±16)岁。无DM家族史对照组50人，空腹和餐后2h血糖均正常。男22例，女28例，年龄28～81岁，平均(50±16)岁。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 体格检查 脱鞋着内衣测量身高、体重，计算体重指数(BM1)。
1.2.2 糖、脂代谢测定 葡萄糖氧化酶法测定空腹葡萄糖(FBG);酶联免疫分析方法测定空腹血清胰岛素、C肽水平;全自动生化测定仪测定血浆总胆固醇(TC酶法)、甘油三酯(TG酶法)，磺柳酸法测定24h尿蛋白定量。
1.2.3 胰岛素抵抗 按照稳态模型评估法(HOMA)估计胰岛素抵抗(HOMA-IR)程度。行上述检查时停用胰岛素12h以上，口服降糖药(OHA)以及降脂药物1周以上。
1.2.4 GADA与ICA测定 采用酶联免疫吸附(ELISA)测定谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和胰岛细胞抗体(ICA)。
1.2.5 糖尿病视网膜病变 由专人行眼底镜检查。
, 百拇医药
1.3 基因测序
1.3.1 mtDNA提取 抽取受试者外周血3ml，用蛋白酶K快速裂解消化法提取白细胞总DNA。
1.3.2 聚合酶链反应(PCR) 上游引物为5′-TTCAˉCAAAGCGCCTTCCCCC-3′，下游5′-GGCCTAGGTTGAGGTTG ACC-3′，引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。反应物在PE9600上扩增，94℃预变性5min后，93℃45s，55℃45s，70℃90s，30次循环，最后72℃延伸5min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
1.3.3 序列测定 所有样品送中科院上海植物生理生态研究所予3307-3610基因片段测序，测序仪为美国Beckman2000型。
2 结果
, 百拇医药 2.1 线粒体DNA ND-13316G→A基因突变检出情况 100例DM患者中发现6例阳性病人见表1，对照组无一例阳性。3例阳性病例除3316位点突变外，还伴随其它位点突变。
2.2 ND-13316G→A突变患者的临床资料 6例3316G→A基因突变的患者大多数有脂代谢紊乱、尿蛋白高于正常、糖尿病视网膜病变(DR)，见表2。
表1 ND-13316G→A基因突变DM患者检出率
表2 3316G→A基因突变DM患者临床表现
注:M:男性;F:女性;BMI:体重指数;IR:稳态模型评估胰岛素抵抗;BP:血压;TC:总胆固醇;TG:甘油三酯;INS:胰岛素;CP:C肽;DR:糖尿病视网膜病变;GADA:谷氨酸脱羧酶抗体;ICA:胰岛细胞抗体
3 讨论
, 百拇医药
近年来随着对线粒体疾病研究的深入，发现至少20多种线粒体基因突变与DM有关 [5] 。线粒体DM是一大类异质性疾病，随着研究的深入必然要进行分类。实验表明，若线粒体氧化磷酸化过程受损，则胰岛素分泌受到抑制。线粒体产生的ATP至少在葡萄糖激酶的磷酸化和ATP依赖性K + 通道的关闭过程中参与胰岛素的分泌。3316G→A突变经流行病学调查证实，它在DM人群中高发(2%～4%)。而我们的研究发现3316G→A突变在DM人群中占6%，明显高于国内外报道。可能是因为选择研究对象不同或存在地区差异。以往的研究，有的是在T2DM进行筛选，有的研究对象有年龄限制。而更为重要的是:其它研究首先用聚合酶链反应扩增，限制性内切酶MSCL消化进行突变筛选，而我们每一例DM患者均进行基因测序，致阳性率明显提高。mtDNA3316G→A突变为丙氨酸突变为苏氨酸(GCC→ACC)。多项研究证实3316G→A转换是同质型突变，而mtDNA同质型突变往往只能轻度影响线粒体功能，仅使机体对某种疾病的易感性增高，在其他因子(如基因突变，环境因子或合并其他遗传性mtDNA突变)的协同作用下发病。无肥胖时，合成的胰岛素尚可满足机体需要。一旦发生肥胖，胰岛B细胞功能失代偿，INS分泌不足从而诱导DM发生。也有学者认为mtDNA突变的DM患者，胰岛素分泌大致正常而葡萄糖感受系统功能不完全。糖代谢的异常一方面引起胰岛素分泌障碍，另一方面存在胰岛素抵抗。
, 百拇医药
我们的研究发现，大多数3316G→A基因突变DM患者的 CP值均在正常范围，且大多数患者存在高胰岛素血症。证实3316G→A基因突变者的发病与胰岛素抵抗有关。Liang等 [6] 认为，DM患者或糖耐量异常者mtDNA突变率高，是由于年龄或高血糖造成的。已有大量的证据支持衰老过程中存在mtDNA突变。mtDNA缺失随增龄不断积聚，而高血糖通过氧自由基诱导mtDNA损伤，增加其mtDˉNA突变率 [7] 。故有学者把衰老看成是一种与年龄有关的线粒体疾病。也有研究发现肥胖和老龄是DM携带3316G→A突变者发病的共同特点 [4] ，认为肥胖和增龄与mtDNA3316G→A突变者发病有关。但也有研究认为 [3] 年龄不是发生这种现象的主要因素，可能还存在其他因素的协同作用。我们的研究发现，在6例3316G→A点突变患者中，有5人发病年龄>45岁，其中3人除3316G→A位点突变外，还存在其它不同位点的突变。4例患者大多数存在脂代谢紊乱。因此，基因突变不排除与增龄及长期高血脂、脂代谢紊乱有关。有研究认为mtDNA3316G→A突变引起的DM病情较轻，大多数仅需口服降糖药治疗。但我们发现，3316G→A突变的DM患者部分存在血清胰岛自身抗体阳性，且同样出现糖尿病肾病和/或糖尿病视网膜病变等并发症，一般认为ICA和GAD阳性与胰岛B细胞免疫性损伤有关。国内萧氏也发现GAD阳性的1型DMND-13316G→A突变发生率显著高于对照组，认为mtDNA3316G→A突变者与1型DM有关 [2] 。因此，我们认为3316G→A突变的DM患者必要时需及早使用胰岛素控制血糖以保护胰岛B细胞功能，避免DM慢性并发症的发生。DM患者ND-13316G→A突变率明显高于正常人，且随年龄增高而增加，大都伴有高脂血症和胰岛素抵抗，部分患者免疫性抗体阳性。因此，有DM家族史的人群必须尽早控制体重和纠正脂代谢紊乱。
, 百拇医药
参考文献
1 Nakagawa Y，Lkegami H，Yamato E，et al.A new mitochondrial DNA mutation associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus.Biophys Res Commun，1995，209:664-668.
2 萧建中，于志清，徐明，等.线粒体基因np3316G→A突变与糖尿病.中国糖尿病杂志，1999，7:330-333.
3 钱杰，张丽容.线粒体DNA ND-1基因点突变与2型糖尿病的关系.中华内分泌代谢杂志，2003，19:46-47.
4 赵青，张丽容.线粒体DNA ND-1基因nt3316G→A突变与2型糖尿病的关系.中华内分泌代谢杂志，2001，17:158-159.
, http://www.100md.com
5 李永航.线粒体糖尿病研究进展.国外医学·内分泌学分册，2000，20:252-255.
6 Liang P，Hughes V，Fukagawa NK.Inoreased prevalence of mitochondrial DNA deletions in sbdetal muscle of older individuals with impaired gluˉcose tolerance:possible marber of glycemic tress.Diabetes，1997，46:920-923.
7 Fukagawa NK，Lim，Liang P，et al.Aging and high concentrations of gluˉcose poten tiate injury to mitochondrial DNA.Free Radic Biol Med，1999，27:1437-1443.
作者单位:226001江苏南通医学院附属医院
200032上海中科院上海植物生理生态研究所
(编辑海 涛), 百拇医药(王粹芳)