慢性间断性缺氧的大鼠学习记忆能力及脑内单胺类神经递质的变化
【摘要】 目的 研究慢性间断性缺氧(EHYP)大鼠学习记忆能力和不同脑区单胺类神经递质的变化，揭示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)导致学习记忆障碍的可能的生化机制。方法 建立EHYP大鼠模型，用被动避暗回避反射试验评价大鼠学习记忆能力，潜伏期(STL)越长，学习记忆能力越强;用高效液相色谱电化学检测器(HPLC-ECD)法测定大鼠皮层、海马和纹状体内单胺类神经递质的含量。结果 EHYP大鼠STL明显缩短(P<0.01)，皮层、海马和纹状体内单胺类神经递质含量明显下降(P<0.05)。结论 EHYP大鼠学习记忆能力受损，脑内单胺类神经递质含量下降。
关键词 慢性间断性缺氧 被动避暗回避反射试验 单胺类神
经递质 【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0653-02
A study on changes in learning-memory ability and monoaminergic
, 百拇医药
neurotransmitter following chronic episodic hypoxia in rat
Xu Yan，Li Shunwei，Zhang Jianjun，et al.
Department of Neurology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing100730.
【Abstract】 Objective To study changes in learning-memory ability and monoaminergic neurotransmitter afˉter chronic episodic hypoxia(EHYP).Methods Following EHYP in SD rats，the learning-memory ability was evaluˉated by the passive avoidance test，the levels of monoaminergic neurotransmitters，including norepinephrine(NE)，dopamine(DA)and serotonin(5-HT)，were determined in different brain regions using high performance liquid chroˉmatography and electrochemical detection(HPLC-ECD).Results Compared with controlled group，performance of EHYP-exposed rats on passive avoidance test impaired significantly(P<0.01).The levels of monoaminergic neuroˉtransmitters in all different brain regions were also decreased significantly(P<0.05).Conclusion EHYP can affect the learning-memory ability and the levels of monoaminergic neurotransmitters in brain.
, 百拇医药
Key words chronic episodic hypoxia(EHYP) passive avoidance test monoaminergic neurotransmitter
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)可引起学习记忆障碍已得到多方证实 [1] 。大量临床研究显示 [2] ，慢性间断性缺氧(EHYP)在其中发挥了重要作用，但由于众所周知的伦理因素，临床研究很难进一步深入探讨EHYP引起学习记忆障碍的机制。而且，目前尚缺乏一个十分理想的能模拟人类OSAS特征的动物模型。近年来，越来越多的学者认为，去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质与学习记忆功能有关 [3] 。因此，我们通过建立能反映OSAS部分特征(即:慢性间断性缺氧)的EHYP大鼠模型，用被动避暗回避反射试验观察其学习记忆能力，用高效液相色谱电化学检测器法(HPLC-ECD)测定其皮层、海马和纹状体等不同脑区内NE、DA和5-HT含量的变化，以揭示OSAS导致学习记忆障碍的可能的生化机制。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物和分组 雄性SD大鼠20只，190～200g，购自北京协和医院动物中心，经被动避暗回避反射试验初筛后，将符合条件的大鼠随机分为对照组(n=7)和EHYP组(n=9)。
1.2 动物模型的建立 参照薛全福等 [4] 制作EHYP大鼠模型。将大鼠置于常压低氧舱(由中国医学科学院阜外医院肺心病研究室提供)内，向舱内注入氮气，同时在舱内放大量碱石灰和硅胶以吸收CO 2 和水蒸气，使舱内氧浓度持续控制在(10±0.5)%，CO 2 浓度始终<3%，湿度为(50±10)%。舱壁有小缝隙与舱外相通，使舱内气压与大气压平衡。每次缺氧时氧浓度从23%降至10%的时间为45min，每天缺氧8h，连续35天结束。缺氧期间，大鼠摄食、饮水同常。对照组大鼠除不行缺氧处理外，余条件同EHYP组。
1.3 学习记忆的测定 参照Ando等 [5] 用被动避暗回避反射试验测定大鼠学习记忆能力。程控避暗箱由中国医学科学院药物所提供。检测步骤如下:(1)初筛期:缺氧处理前，将大鼠背对洞口放入明室，启动计时器，90s内进入暗室的大鼠作本实验用。(2)训练期:缺氧处理后，大鼠背对洞口放入明室，进入暗室后，通电刺激2s，电刺激后5s取出大鼠，归回饲养笼。(3)测定期:训练后24h，再将大鼠背对洞口置于明室，同时开启计时器，记录大鼠第一次进入暗室时间，为潜伏期(STL)，观察5min，始终未进入的大鼠STL规定为300s。
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1.4 取材 行为实验后，大鼠断头处死，全脑取出置于冰盘上，依次取出皮层、海马和纹状体，去除脑膜和血管，迅速称重后置于液氮保存。为避免单胺类神经递质含量的周期性节律变化，EHYP组与对照组大鼠均于9Am左右处死，且交替断头取材。
1.5 单胺类神经递质的测定 参照屈志炜 [6] 等方法用HPLC-ECD法测定。将待测脑组织置于一试管后，加入2μl/ml DHBA50μl和冷0.1mmol/L HClO 4 1ml后，用超速匀浆器将脑组织制成匀浆，然后于4℃、45000g离心20min，取20μl直接进样，结合脑组织湿重，最后含量以μg/g湿组织表示。
1.6 统计学处理 所有数据用均数±标准差表示，计量资料用t或t′检验作显著性测定，非参数资料用曼-惠特尼U检验作显著性测定。检验显著水平为P<0.05。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 各实验组最后标本数 20只SD大鼠，经被动避暗回避反射试验筛除4只，经35天EHYP处理后死亡2只，最终各实验组大鼠数目为:对照组7只，EHYP组7只。
2.2 被动避暗回避反应能力的比较 与对照组大鼠(STL=300.00±0.00s)相比，EHYP组大鼠STL(136.44±84.63s，P=0.001<0.01)明显缩短。
2.3 单胺类神经递质含量的比较 EHYP组大鼠皮层、海马和纹状体等不同脑区内NE、DA和5-HT含量均明显低于对照组大鼠(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠不同脑区内单胺类神经递质含量的比较 (略 )
3 讨论
有关低氧应激对学习记忆的影响及有关生化机制的研究早在上个世纪70年代即已开始，但均局限于缺血缺氧、减压缺氧或一过性单纯缺氧模型，不能真实反映单纯慢性间断性缺氧对学习记忆的影响。而大量研究 [2] 显示慢性间断性缺氧是OSAS的主要病理生理改变。因此，我们通过建立EHYP大鼠模型，观察EHYP对学习记忆能力和脑内单胺类神经递质的影响，以揭示OSAS患者出现学习记忆障碍的可能的生化机制。
, 百拇医药
目前，用于检测大鼠学习记忆功能的方法较多，但以被动避暗回避反射试验最为简单，且有研究显示 [5] ，它对检测缺氧、缺血所致的记忆障碍最为敏感，故我们采用该法评价EHYP对大鼠学习记忆的影响，发现经学习训练已达到对暗环境被动回避的EHYP组和对照组大鼠，24h后再次行避暗试验时，EHYP组大鼠STL明显短于对照组，说明EHYP可影响学习记忆能力。
近年，越来越多的研究显示，学习记忆除与中枢胆碱能系统有关外，亦与NE、DA和5-HT等单胺类神经递质密切相关。其中，NE和5-HT研究较多，且已被认为可通过与脑内Ach的交互作用直接与学习记忆发生联系。DA与学习记忆关系的研究尽管不多，但也已初步推测它可通过调节精神活动、情绪、识别、思维和推理过程间接影响学习记忆。由此，我们推测EHYP导致学习记忆障碍可能是由于它引起了脑内单胺类神经递质的改变。为证实这一推测，我们采用HPLC-ECD法检测了EHYP组和对照组大鼠皮层、海马和纹状体内NE、DA和5-HT的含量，发现EHYP大鼠各脑区内的单胺类神经递质含量均明显低于对照组大鼠，且与被动避暗回避反射实验结果一致，说明EHYP可影响脑内单胺类神经递质水平，并可能由此进一步导致学习记忆障碍。
, 百拇医药
NE、DA和5-HT的合成分别始于酪氨酸和色氨酸，并 分别在酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的作用下催化而成，最后在单胺氧化酶的作用下酶解失活。其中，酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶是NE、DA和5-HT合成与分解过程中的主要限速酶，均需分子氧作底物且酶活性受分子氧的调节。因此，我们认为，酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶在慢性间断性缺氧条件下活性受到抑制，引起的单胺类神经递质合成分解障碍可能是慢性间断性缺氧导致脑内NE、DA和5-HT水平下降的原因之一。近年来，大量有关低氧应激致脑损伤的研究显示，氧自由基及其脂质过氧化反应在其发生发展中发挥了重要作用 [7] ，因此，我们推测，脑内单胺类神经递质含量降低除与递质的合成分解障碍有关外，还可能与缺氧后脑组织内生成的大量氧自由基引起的生物膜发生脂质过氧化损伤所致的NE、DA和5-HT能神经细胞坏死有关。
参考文献
1 Skomro RT，Kryger MH.Clinical presentation of obstructive sleep apnea syndrome.Prog Cardiac Dis，1999，41:331-340.
, http://www.100md.com
2 彭斌，李舜伟，黄席珍，等.睡眠呼吸暂停综合征及鼾症患者事件相关电位的研究.中华医学杂志，2000，80:429-431.
3 张钟启，罗织璞.学习记忆的胆碱能机制与去甲肾上腺素和5-羟色胺能介质系统的关系.中国药理学通报，1994，10:81-83.
4 薛全福，谢剑明，胡长贵，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的建立.中华结核和呼吸杂志，1989，12:350-351.
5 Ando S，Kametani H，Osada H，et al.Delayed memory dysfunction by transienthypoxia，and its prevention with forsholin.Brain Res，1987，405:371-375.
6 屈志炜，刘云，张均田.用高效液相色谱电化学检测器测定大小鼠脑内单胺类物质的研究.中国医学科学院学报，1987，9:371-374.
7 Rosenberg AA，Rapoport DM，Rigatto H，et al.The role of oxygen free radicals in post asphysia cerebral hyperfusion in newborn lambs.Pediatr Res，1989，26:215-219.
(编辑 于少伟), http://www.100md.com(徐雁)
关键词 慢性间断性缺氧 被动避暗回避反射试验 单胺类神
经递质 【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0653-02
A study on changes in learning-memory ability and monoaminergic
, 百拇医药
neurotransmitter following chronic episodic hypoxia in rat
Xu Yan，Li Shunwei，Zhang Jianjun，et al.
Department of Neurology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing100730.
【Abstract】 Objective To study changes in learning-memory ability and monoaminergic neurotransmitter afˉter chronic episodic hypoxia(EHYP).Methods Following EHYP in SD rats，the learning-memory ability was evaluˉated by the passive avoidance test，the levels of monoaminergic neurotransmitters，including norepinephrine(NE)，dopamine(DA)and serotonin(5-HT)，were determined in different brain regions using high performance liquid chroˉmatography and electrochemical detection(HPLC-ECD).Results Compared with controlled group，performance of EHYP-exposed rats on passive avoidance test impaired significantly(P<0.01).The levels of monoaminergic neuroˉtransmitters in all different brain regions were also decreased significantly(P<0.05).Conclusion EHYP can affect the learning-memory ability and the levels of monoaminergic neurotransmitters in brain.
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Key words chronic episodic hypoxia(EHYP) passive avoidance test monoaminergic neurotransmitter
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)可引起学习记忆障碍已得到多方证实 [1] 。大量临床研究显示 [2] ，慢性间断性缺氧(EHYP)在其中发挥了重要作用，但由于众所周知的伦理因素，临床研究很难进一步深入探讨EHYP引起学习记忆障碍的机制。而且，目前尚缺乏一个十分理想的能模拟人类OSAS特征的动物模型。近年来，越来越多的学者认为，去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质与学习记忆功能有关 [3] 。因此，我们通过建立能反映OSAS部分特征(即:慢性间断性缺氧)的EHYP大鼠模型，用被动避暗回避反射试验观察其学习记忆能力，用高效液相色谱电化学检测器法(HPLC-ECD)测定其皮层、海马和纹状体等不同脑区内NE、DA和5-HT含量的变化，以揭示OSAS导致学习记忆障碍的可能的生化机制。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物和分组 雄性SD大鼠20只，190～200g，购自北京协和医院动物中心，经被动避暗回避反射试验初筛后，将符合条件的大鼠随机分为对照组(n=7)和EHYP组(n=9)。
1.2 动物模型的建立 参照薛全福等 [4] 制作EHYP大鼠模型。将大鼠置于常压低氧舱(由中国医学科学院阜外医院肺心病研究室提供)内，向舱内注入氮气，同时在舱内放大量碱石灰和硅胶以吸收CO 2 和水蒸气，使舱内氧浓度持续控制在(10±0.5)%，CO 2 浓度始终<3%，湿度为(50±10)%。舱壁有小缝隙与舱外相通，使舱内气压与大气压平衡。每次缺氧时氧浓度从23%降至10%的时间为45min，每天缺氧8h，连续35天结束。缺氧期间，大鼠摄食、饮水同常。对照组大鼠除不行缺氧处理外，余条件同EHYP组。
1.3 学习记忆的测定 参照Ando等 [5] 用被动避暗回避反射试验测定大鼠学习记忆能力。程控避暗箱由中国医学科学院药物所提供。检测步骤如下:(1)初筛期:缺氧处理前，将大鼠背对洞口放入明室，启动计时器，90s内进入暗室的大鼠作本实验用。(2)训练期:缺氧处理后，大鼠背对洞口放入明室，进入暗室后，通电刺激2s，电刺激后5s取出大鼠，归回饲养笼。(3)测定期:训练后24h，再将大鼠背对洞口置于明室，同时开启计时器，记录大鼠第一次进入暗室时间，为潜伏期(STL)，观察5min，始终未进入的大鼠STL规定为300s。
, http://www.100md.com
1.4 取材 行为实验后，大鼠断头处死，全脑取出置于冰盘上，依次取出皮层、海马和纹状体，去除脑膜和血管，迅速称重后置于液氮保存。为避免单胺类神经递质含量的周期性节律变化，EHYP组与对照组大鼠均于9Am左右处死，且交替断头取材。
1.5 单胺类神经递质的测定 参照屈志炜 [6] 等方法用HPLC-ECD法测定。将待测脑组织置于一试管后，加入2μl/ml DHBA50μl和冷0.1mmol/L HClO 4 1ml后，用超速匀浆器将脑组织制成匀浆，然后于4℃、45000g离心20min，取20μl直接进样，结合脑组织湿重，最后含量以μg/g湿组织表示。
1.6 统计学处理 所有数据用均数±标准差表示，计量资料用t或t′检验作显著性测定，非参数资料用曼-惠特尼U检验作显著性测定。检验显著水平为P<0.05。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 各实验组最后标本数 20只SD大鼠，经被动避暗回避反射试验筛除4只，经35天EHYP处理后死亡2只，最终各实验组大鼠数目为:对照组7只，EHYP组7只。
2.2 被动避暗回避反应能力的比较 与对照组大鼠(STL=300.00±0.00s)相比，EHYP组大鼠STL(136.44±84.63s，P=0.001<0.01)明显缩短。
2.3 单胺类神经递质含量的比较 EHYP组大鼠皮层、海马和纹状体等不同脑区内NE、DA和5-HT含量均明显低于对照组大鼠(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠不同脑区内单胺类神经递质含量的比较 (略 )
3 讨论
有关低氧应激对学习记忆的影响及有关生化机制的研究早在上个世纪70年代即已开始，但均局限于缺血缺氧、减压缺氧或一过性单纯缺氧模型，不能真实反映单纯慢性间断性缺氧对学习记忆的影响。而大量研究 [2] 显示慢性间断性缺氧是OSAS的主要病理生理改变。因此，我们通过建立EHYP大鼠模型，观察EHYP对学习记忆能力和脑内单胺类神经递质的影响，以揭示OSAS患者出现学习记忆障碍的可能的生化机制。
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目前，用于检测大鼠学习记忆功能的方法较多，但以被动避暗回避反射试验最为简单，且有研究显示 [5] ，它对检测缺氧、缺血所致的记忆障碍最为敏感，故我们采用该法评价EHYP对大鼠学习记忆的影响，发现经学习训练已达到对暗环境被动回避的EHYP组和对照组大鼠，24h后再次行避暗试验时，EHYP组大鼠STL明显短于对照组，说明EHYP可影响学习记忆能力。
近年，越来越多的研究显示，学习记忆除与中枢胆碱能系统有关外，亦与NE、DA和5-HT等单胺类神经递质密切相关。其中，NE和5-HT研究较多，且已被认为可通过与脑内Ach的交互作用直接与学习记忆发生联系。DA与学习记忆关系的研究尽管不多，但也已初步推测它可通过调节精神活动、情绪、识别、思维和推理过程间接影响学习记忆。由此，我们推测EHYP导致学习记忆障碍可能是由于它引起了脑内单胺类神经递质的改变。为证实这一推测，我们采用HPLC-ECD法检测了EHYP组和对照组大鼠皮层、海马和纹状体内NE、DA和5-HT的含量，发现EHYP大鼠各脑区内的单胺类神经递质含量均明显低于对照组大鼠，且与被动避暗回避反射实验结果一致，说明EHYP可影响脑内单胺类神经递质水平，并可能由此进一步导致学习记忆障碍。
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NE、DA和5-HT的合成分别始于酪氨酸和色氨酸，并 分别在酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的作用下催化而成，最后在单胺氧化酶的作用下酶解失活。其中，酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶是NE、DA和5-HT合成与分解过程中的主要限速酶，均需分子氧作底物且酶活性受分子氧的调节。因此，我们认为，酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶在慢性间断性缺氧条件下活性受到抑制，引起的单胺类神经递质合成分解障碍可能是慢性间断性缺氧导致脑内NE、DA和5-HT水平下降的原因之一。近年来，大量有关低氧应激致脑损伤的研究显示，氧自由基及其脂质过氧化反应在其发生发展中发挥了重要作用 [7] ，因此，我们推测，脑内单胺类神经递质含量降低除与递质的合成分解障碍有关外，还可能与缺氧后脑组织内生成的大量氧自由基引起的生物膜发生脂质过氧化损伤所致的NE、DA和5-HT能神经细胞坏死有关。
参考文献
1 Skomro RT，Kryger MH.Clinical presentation of obstructive sleep apnea syndrome.Prog Cardiac Dis，1999，41:331-340.
, http://www.100md.com
2 彭斌，李舜伟，黄席珍，等.睡眠呼吸暂停综合征及鼾症患者事件相关电位的研究.中华医学杂志，2000，80:429-431.
3 张钟启，罗织璞.学习记忆的胆碱能机制与去甲肾上腺素和5-羟色胺能介质系统的关系.中国药理学通报，1994，10:81-83.
4 薛全福，谢剑明，胡长贵，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的建立.中华结核和呼吸杂志，1989，12:350-351.
5 Ando S，Kametani H，Osada H，et al.Delayed memory dysfunction by transienthypoxia，and its prevention with forsholin.Brain Res，1987，405:371-375.
6 屈志炜，刘云，张均田.用高效液相色谱电化学检测器测定大小鼠脑内单胺类物质的研究.中国医学科学院学报，1987，9:371-374.
7 Rosenberg AA，Rapoport DM，Rigatto H，et al.The role of oxygen free radicals in post asphysia cerebral hyperfusion in newborn lambs.Pediatr Res，1989，26:215-219.
(编辑 于少伟), http://www.100md.com(徐雁)