用PCR检测肺结核患者血液中结核分枝杆菌DNA
【文献标识码】 B 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0916-01
PCR应用于结核杆菌的检测是近年来结核病快速诊断的一项新技术。但是，目前市售的RCR试剂盒一般都只能从痰液、胸水、脑脊液、腹水等标本中进行检测，也有用血清进行检测的，但阳性率很低。我院对30例肺结核患者外周血白细胞中的结核杆菌DNA经PCR扩增后进行检测。其结果如下。
1 材料和方法
1.1 病例 本院门诊及住院的肺结核患者30例，男15例，女15例，年龄14～72岁，平均44岁，X线胸片检查和痰涂片抗酸杆菌染色均呈阳性。另有正常健康人15例，男7例，女8例，年龄20～80岁，平均48岁。
1.2 试剂 (1)裂解液Ⅱ;(2)TB PCR mix ;(3)Taq酶。以上试剂均购自北京美迪科生物技术有限公司。
1.3 方法 (1)标本采集及预处理、EDTA-Na 2 抗凝血4000rpm离心10min，小心吸取中间层200μl至一离心管中，加入1ml0.83%氯化铵溶液于37℃20min溶解红细胞后，1000rpm离心10min，弃上清，再同上法处理一次，弃上清。下层白细胞沉淀用生理盐水洗涤三次后备用。(2)标本DNA提取:上述备用液加50μl裂解液Ⅱ充分混匀，55℃保温1h，100℃10min加入等体积的酚氯仿—异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提，在上清液中加2倍体积的无水乙醇，12000rpm离心20min，弃上清。沉淀物用75%乙醇洗2次，沉淀加40μl Tris-EDTA液溶解。(3)PCR扩增:取5μl溶解液，加入20μl mix，1μl Taq混匀后加2滴石蜡油，离心数秒，进行扩增:94℃/45″68℃/45″72℃/45″循环35次。(4)产物检测:扩增产物5μl在含10mg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳20min(电压90V)，在紫外灯下观察结果，在320bp有清晰的扩增条为结核杆菌DNA阳性。
2 结果
在30例肺结核患者血标本中，结核杆菌DNA阳性24例，阳性率为80%，而阴性对照组均为阴性。
3 讨论
肺结核实验室诊断中，由于痰涂片抗酸杆菌染色阳性偏低，PCR法因其快速、灵敏、特异性强正在结核诊断中得到推广应用，而我们应用患者外周血白细胞中的结核杆菌DNA检测的阳性率为80%，所以PCR技术对血液细胞中的结核分枝杆菌DNA进行检测完全可行。
作者单位:277712山东省苍山县文峰山人民医院
(编辑 元红), http://www.100md.com(孙莉)
PCR应用于结核杆菌的检测是近年来结核病快速诊断的一项新技术。但是，目前市售的RCR试剂盒一般都只能从痰液、胸水、脑脊液、腹水等标本中进行检测，也有用血清进行检测的，但阳性率很低。我院对30例肺结核患者外周血白细胞中的结核杆菌DNA经PCR扩增后进行检测。其结果如下。
1 材料和方法
1.1 病例 本院门诊及住院的肺结核患者30例，男15例，女15例，年龄14～72岁，平均44岁，X线胸片检查和痰涂片抗酸杆菌染色均呈阳性。另有正常健康人15例，男7例，女8例，年龄20～80岁，平均48岁。
1.2 试剂 (1)裂解液Ⅱ;(2)TB PCR mix ;(3)Taq酶。以上试剂均购自北京美迪科生物技术有限公司。
1.3 方法 (1)标本采集及预处理、EDTA-Na 2 抗凝血4000rpm离心10min，小心吸取中间层200μl至一离心管中，加入1ml0.83%氯化铵溶液于37℃20min溶解红细胞后，1000rpm离心10min，弃上清，再同上法处理一次，弃上清。下层白细胞沉淀用生理盐水洗涤三次后备用。(2)标本DNA提取:上述备用液加50μl裂解液Ⅱ充分混匀，55℃保温1h，100℃10min加入等体积的酚氯仿—异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提，在上清液中加2倍体积的无水乙醇，12000rpm离心20min，弃上清。沉淀物用75%乙醇洗2次，沉淀加40μl Tris-EDTA液溶解。(3)PCR扩增:取5μl溶解液，加入20μl mix，1μl Taq混匀后加2滴石蜡油，离心数秒，进行扩增:94℃/45″68℃/45″72℃/45″循环35次。(4)产物检测:扩增产物5μl在含10mg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳20min(电压90V)，在紫外灯下观察结果，在320bp有清晰的扩增条为结核杆菌DNA阳性。
2 结果
在30例肺结核患者血标本中，结核杆菌DNA阳性24例，阳性率为80%，而阴性对照组均为阴性。
3 讨论
肺结核实验室诊断中，由于痰涂片抗酸杆菌染色阳性偏低，PCR法因其快速、灵敏、特异性强正在结核诊断中得到推广应用，而我们应用患者外周血白细胞中的结核杆菌DNA检测的阳性率为80%，所以PCR技术对血液细胞中的结核分枝杆菌DNA进行检测完全可行。
作者单位:277712山东省苍山县文峰山人民医院
(编辑 元红), http://www.100md.com(孙莉)