高温变性在组织切片cDNA原位杂交中的应用
【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614(2003)09-0844-02
原位杂交技术是一种敏感和特异的检测病毒颗粒的方法，其阳性率高，定位好，可被应用于临床诊断病毒相关性肿瘤以及病毒传播机制的研究。我们在实际工作中，经过反复实验，发现使用高温变性不仅提高敏感性，而且可以节约作用时间。
1 材料和方法
(1)先将玻片用洗洁精洗涤，流水冲洗，蒸馏水洗，烘干，APES处理，待用。(2)在本研究中应用的所有组织都是用10%福尔马林固定、石蜡包埋，没有经过特殊处理。组织为手术中切除的①HPV阳性(尖锐湿疣组织)、选用阴性对照组正常皮肤组织;②EB病毒阳性(何杰金淋巴瘤)、选用阴性对照组织正常淋巴结;③HBV阳性(乙肝阳性肝组织)、选用阴性对照组织正常肝组织。切成4μm厚的薄片，56℃干烤过夜。(3)选用DAKO In Situ Hybidzation Detection System。(4)切片脱蜡至75%酒精。(5)蒸馏水洗。(6)用1%H 2 O 2 在蒸馏水中阻断内源性过氧化物酶。(7)蒸馏水洗。(8)37℃干燥5min。(9)蛋白酶K，37℃数10～15min。(10)1%TrIton X-100TBS液洗5min。(11)酒精脱水(75%、95%、100%)。(12)干燥37℃或室温。(13)变性:将3种不同的病毒及各自的阴性片滴加相应的生物素化探针，盖上杂交膜，防止有小气泡逸出。我们选用2组不同的变性温度进行对比实验:第1组将切片平放在铝盒内，放入94℃的水浴箱内，10～12min，将片子取出，放在冰上快速冷却退火。第2组将切片平放在铝盒内，放入已沸的装有水的锅内10～12min，取出片子，冰上快速冷却退火。(14)杂交，37℃，4h。(15)去除盖膜，37℃1%TrIton X-100TBS洗3遍，每遍30s。(16)Streptavidin，37℃，20min。(17)37℃1%TrIton X-100TBS洗3遍，每遍30s。(18)Substrate Solution显色，30～60min(显微镜下控制)避免强光直接照射。(19)蒸馏水水洗，核固红复染。(20)快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
, http://www.100md.com
2 结果
用100℃高温变性的阳性细胞明显高于94℃变性的，且定位清楚，阳性颗粒增强，背景干净。对照组的切片全部 没有染色。
3 讨论
原位杂交方法从1969年被介绍到临床实验室后得到了不断的改进和提高。应用这些方法检测石蜡包埋组织中的DNA序列已被用于几种病毒感染的研究中。原位杂交最常用的是4%多聚甲醛，原因是其不会与蛋白质产生交联反应。我们用普通10%福尔马林固定24h，也能做出满意的结果，有利于临床诊断和回顾性总结。蛋白酶K消化，主要是为了暴露被遮弊的靶核酸，以增加探针的可结合性，但消化的时间要视组织的类型、切片的厚薄、固定液的不同而定，消化不足，则杂交信号很弱;过消化，则组织细胞结构被破坏，靶核酸减少，影响结果。故我们必须对不同的组织，根据其厚度设定相应的消化时间。也有报道用胃蛋白酶水解结果要比蛋白酶K好。我们用37℃1%TrIton X-100TBS进行洗涤，增加组织的通透性，使组织洗的更干净，降低了杂交背景。值得注意的是加上探针后的所有过程中不能干燥，否则切片上的非特异性结合就无法洗净。最重要的是:在变性过程中，我们特别感兴趣的是用94℃探针变性与用100℃高温的办法相比，后者在染色强度上有较大的提高，因为进行杂交的探针和靶核酸都必须是单链，如果用双链cDNA探针检测，必须将探针和靶核酸进行解链，在一定的温度范围内，随着变性温度的升高，解链的数量也随之增加，在达到100℃的温度时，在染色强度上有较大的提高，能增加其后的杂交效率。在去除福尔马林固定影响的同时，迫使DNA互补链分离。100℃高温变性明显优于传统的94℃变性。我们把杂交时间从16h缩短为4h，这种方法可以使控制变性温度和处理大量切片的工作变得简单，杂交工作可以当天完成。
(编辑 使臻), 百拇医药(丁伟)
原位杂交技术是一种敏感和特异的检测病毒颗粒的方法，其阳性率高，定位好，可被应用于临床诊断病毒相关性肿瘤以及病毒传播机制的研究。我们在实际工作中，经过反复实验，发现使用高温变性不仅提高敏感性，而且可以节约作用时间。
1 材料和方法
(1)先将玻片用洗洁精洗涤，流水冲洗，蒸馏水洗，烘干，APES处理，待用。(2)在本研究中应用的所有组织都是用10%福尔马林固定、石蜡包埋，没有经过特殊处理。组织为手术中切除的①HPV阳性(尖锐湿疣组织)、选用阴性对照组正常皮肤组织;②EB病毒阳性(何杰金淋巴瘤)、选用阴性对照组织正常淋巴结;③HBV阳性(乙肝阳性肝组织)、选用阴性对照组织正常肝组织。切成4μm厚的薄片，56℃干烤过夜。(3)选用DAKO In Situ Hybidzation Detection System。(4)切片脱蜡至75%酒精。(5)蒸馏水洗。(6)用1%H 2 O 2 在蒸馏水中阻断内源性过氧化物酶。(7)蒸馏水洗。(8)37℃干燥5min。(9)蛋白酶K，37℃数10～15min。(10)1%TrIton X-100TBS液洗5min。(11)酒精脱水(75%、95%、100%)。(12)干燥37℃或室温。(13)变性:将3种不同的病毒及各自的阴性片滴加相应的生物素化探针，盖上杂交膜，防止有小气泡逸出。我们选用2组不同的变性温度进行对比实验:第1组将切片平放在铝盒内，放入94℃的水浴箱内，10～12min，将片子取出，放在冰上快速冷却退火。第2组将切片平放在铝盒内，放入已沸的装有水的锅内10～12min，取出片子，冰上快速冷却退火。(14)杂交，37℃，4h。(15)去除盖膜，37℃1%TrIton X-100TBS洗3遍，每遍30s。(16)Streptavidin，37℃，20min。(17)37℃1%TrIton X-100TBS洗3遍，每遍30s。(18)Substrate Solution显色，30～60min(显微镜下控制)避免强光直接照射。(19)蒸馏水水洗，核固红复染。(20)快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
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2 结果
用100℃高温变性的阳性细胞明显高于94℃变性的，且定位清楚，阳性颗粒增强，背景干净。对照组的切片全部 没有染色。
3 讨论
原位杂交方法从1969年被介绍到临床实验室后得到了不断的改进和提高。应用这些方法检测石蜡包埋组织中的DNA序列已被用于几种病毒感染的研究中。原位杂交最常用的是4%多聚甲醛，原因是其不会与蛋白质产生交联反应。我们用普通10%福尔马林固定24h，也能做出满意的结果，有利于临床诊断和回顾性总结。蛋白酶K消化，主要是为了暴露被遮弊的靶核酸，以增加探针的可结合性，但消化的时间要视组织的类型、切片的厚薄、固定液的不同而定，消化不足，则杂交信号很弱;过消化，则组织细胞结构被破坏，靶核酸减少，影响结果。故我们必须对不同的组织，根据其厚度设定相应的消化时间。也有报道用胃蛋白酶水解结果要比蛋白酶K好。我们用37℃1%TrIton X-100TBS进行洗涤，增加组织的通透性，使组织洗的更干净，降低了杂交背景。值得注意的是加上探针后的所有过程中不能干燥，否则切片上的非特异性结合就无法洗净。最重要的是:在变性过程中，我们特别感兴趣的是用94℃探针变性与用100℃高温的办法相比，后者在染色强度上有较大的提高，因为进行杂交的探针和靶核酸都必须是单链，如果用双链cDNA探针检测，必须将探针和靶核酸进行解链，在一定的温度范围内，随着变性温度的升高，解链的数量也随之增加，在达到100℃的温度时，在染色强度上有较大的提高，能增加其后的杂交效率。在去除福尔马林固定影响的同时，迫使DNA互补链分离。100℃高温变性明显优于传统的94℃变性。我们把杂交时间从16h缩短为4h，这种方法可以使控制变性温度和处理大量切片的工作变得简单，杂交工作可以当天完成。
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