Ox-LDL诱导大鼠系膜细胞TGF-betal转录增强和NF-κB的活化
【摘要】 目的 研究氧化低密度脂蛋白(oxidation of low density lipoprotein，Ox-LDL)对肾小球系膜细胞(mesangial cell，MsC)核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)与转化生长因子β1(transforming growth factor-betal，TGF-β1)活性的影响，探讨脂质肾损伤的分子机制。方法 以TGF-β1转录起始位点上游序列构建的报告基因质粒转染系膜细胞研究Ox-LDL对TGF-β1启动子的活性的影响，RT-PCR半定量方法检测不同时间和不同浓度的Ox-LDL诱导后TGF-β1mRNA水平的变化，并用凝胶迁移分析实验观察不同浓度和不同时间组的Ox-LDL对肾小球系膜细胞NF-κB结合活性的影响。结果 Ox-LDL呈浓度依赖性增加TGF-β1启动子活性，100μg/ml的Ox-LDL可使TGF-β1启动子活性在36h达到最高点;NF-κB的结合活性对Ox-LDL刺激依时间延伸呈持续激活，在早期有明显波动，活性最强分别在6h和36h。结论 Ox-LDL诱导系膜细胞TGF-β1表达增强可能有核转录因子NF-κB的参与。
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关键词 氧化低密度脂蛋白 转化生长因子β1 核转录因子κB
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)05-0385-05
Ox-LDL induced enhancement of of TGF-β1transcription
and activation of NF-κB in cultured mesangial cells
Lan Yang，Zhou Qin，Wu Zhaolong
Division of Nephrology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To investigate the binding activity of nuclear factor-kappaB(NF-κB)and the tranˉscription of transforming growth factor-betal(TGF-β1)induced by oxidized low density lipoprotein(Ox-LDL)，and to clarify themolecular mechanism of kidney damage by Ox-LDL.Methods A promoter construct wasused to deˉtect the expression of TGF-betal by transient transfection into mesangial cells.And TGF-β1mRNA was determined by RT-PCR assay in mesangial cells exposed to Ox-LDL.The binding activity of NF-κB was measured by gel shift assay.Results The overproduction of TGF-β1increased in a dose-dependent way in mesangial cells incubated with Ox-LDL and reached the maximum at the36 th hour.The binding activity of NF-κB enhanced at the6 th and36 th hour and increased withadded dose of Ox-LDL.Conclusion Ox-LDL induced overexpression of TGF-betal in cultured mesangial cells.It was probably mediated by NF-κB.
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Key words oxidation of low density lipoprotein transforming growth factor-betal nuclear factor-kappaB
氧化低密度胆蛋白(oxidation of low density lipoprotein，Ox-LDL)在肾脏病的发生发展中扮演着重要角色。Ox-LDL与细胞膜上的特异或非特异受体结合而沉积于肾脏固有细胞内，促使其释放各种因子，最终引起肾小球的细胞增殖和细胞外基质沉积，但机制尚未被阐明。核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)，是由p50、p52、p65、RelB和c-Rel蛋白组成的同源和异源二聚体，能与多种细胞因子、生长因子、化学趋化因子以及细胞外基质基因的启动子上的特异位点结合，启动其转录，在免疫炎症反应、抗凋亡和肿瘤发生中起着重要作用。在冠状动脉内皮细胞、PC12、RAW264.7巨噬细胞系均有报道Ox-LDL通过激活NF-κB而诱导一些重要基因的表达 [1～3] ，但有关它对肾脏细胞影响的研究未见报道。本研究采用SD大鼠肾脏系膜细胞为研究对象，观察Ox-LDL对系膜细胞NF-κB结合活性的影响，同时也检测肾脏病发病中介因子—转化生长因子(transforming growth factor-betal，TGF-β1)的启动子活性，探讨脂质肾损伤的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 材料 RPMI1640购自Gibco BRL公司，NF-kappaB特异结合序列双链和双荧光素酶测定试剂盒购自Promega公司，转染试剂GeneJammer TM 购自Stratagene公司，低密度脂蛋白(LDL)购自Sigma公司，TGF-β1启动子全长(-1500～+57)荧光素酶报告质粒pGL3-Basic(pRT1)见报道 [4] ，内参荧光素酶报告质粒pRL-SV40购自Promega公司。TRlzol试剂购自TaKaRa公司，γ- 32 P-dATP购自北京亚辉生物技术公司。Keratin、CD34及desmin一抗购自Sant Cruz公司。HRP标记的二抗及ECL试剂购自上海普飞生物技术公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SD大鼠系膜细胞原代分离、传代培养及鉴定参照张明 [5] 、梅长林[6] 等的方法略作修改。4只7～10周龄(100～150g)的雄性SD大鼠颈椎脱位处死后浸泡于70%酒精中消毒15min。在无菌环境中:剪开腹腔充分暴露腹主动脉、下腔动脉和双侧肾脏，用PBS(pH7.4)进行腹主动脉逆行灌注至双侧肾脏发白，剪开包膜后取肾脏，沿皮髓线分离皮质切碎成1mm大小的碎屑，从上至下按顺序放好80、150、200目的不锈钢筛网，将碎屑移至80目不锈钢筛网，以无菌注射器针芯轻轻按压碎屑，同时用PBS冲洗，移去80目钢筛，边用针芯按压边用PBS冲洗150目钢筛，用PBS冲洗数次后收集200目钢筛上的肾小球。0.1%Ⅳ胶原酶37℃水浴震摇消化30min，PBS洗2次，最后离心收集肾小球，重悬于RPM1640(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1.5mMHEPES)10ml，分装入两只5ml培养瓶，5%CO 2 、37℃培养箱培养。大约3周后系膜细胞(MsC)开始长出，4周左右能长到融合。原代细胞生长融合传代后用10%FBS的RPˉMI1640培养。实验用系膜细胞为第5～8代细胞。系膜细胞鉴定用免疫组织化学方法。
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1.2.2 实验分组 转染实验分组:系膜细胞以每孔0.5×10 5 细胞数传代至24孔板，长至60%～80%融合即随机分为对照组和Ox-LDL处理组。NF-kappaB活性检测分组:系膜细胞90%融合时更换培养液为0.5%胎牛血清RPˉMI1640培养液，待24h后随机分为正常细胞组和Ox-LDL处理组。
1.2.3 氧化低密度脂蛋白的制备 用铜氧化法氧化LDL [7] 。向LDL中加入终浓度为5μmol/L CuSO 4 ，37℃水浴箱放置16h，以终浓度为200μmol/L的EDTA和40μmol/L的2，6-二叔丁基苯酚终止反应，PBS透析×3次，RPMI1640透析1次，0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。Ox-LDL蛋白质定量用Bladford法，用荧光分光光度法测定Ox-LDL中丙二醛含量 [8]。
1.2.4 转染实验及双荧光素酶活性检测 转染实验:基本按GeneJammer TM 转染试剂说明进行操作。系膜细胞60%～80%融合时，以不含血清的RPMI1640洗细胞3次，加150μl不含抗生素的10%胎牛血清RPMI1640，置培养箱待转染。向一灭菌eppendorff管中加100μl的RPMI1640和转染试剂2μl，吹打混匀后室温放置10min，再加入4μg质粒pRT1和0.4μg的pRL-SV40，轻轻吹打混匀，置室温5min后加入培养孔，轻晃培养板混匀，置培养箱3h，加入250μl无抗生素10%胎牛血清RPMI1640，6h后加Ox-LDL刺激。最后于不同时间点收获裂解细胞冻存-70℃备用。
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双荧光素酶活性检测:细胞裂解液自-70℃取出后室温放置15min，短暂离心，取10ml上清加入样品检测管，分别检测加底物Ⅰ和底物Ⅱ后的10s荧光计数，第2次所得值为内参值，取两次所得值相对值分析。
1.2.5 核蛋白抽提 弃去培养液，冰预冷的PBS洗细胞2次，将细胞用细胞刮刮下，收集于1.5ml离心管中，3000×rpm离心5min，细胞沉淀-20℃放置5min，重悬于400μl缓冲液A(10mmol/L HEPES-KOH pH7.9，10mmol/L KCl，105mmol/L MgCl 2 ，用前临时加入1mmol/L DTT，1mmol/L PMSF，10μg/ml Leupeptin，10μg/ml Aprotinin，1mmol/L Na 3 VO 3 )中，冰上放置5min，加入终浓度为0.1%的NP-40，来回倒置10次，再置冰上5min，8000×rpm离心5min弃上清，缓冲液A洗涤1次，将细胞核沉淀悬于缓冲液B100μl轻轻吹打至液体不再粘稠，置冰上搅拌30min，12000×rpm于4℃离心30min，所得上清为核蛋白，以1:100体积透析2次，Bradˉford法定量蛋白，按每管20μg冻存于-70℃备用。
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1.2.6 双链寡核苷酸探针的标记 反应体系:10×T 1 Polynucleotide Kinase Bufferlul+NF-kappaB Double stranded Oligoucleotide5μl+γ- 32 P-dATP1μl+T 1 PK1μl+ddH2 O2μl37℃水浴30min，冰上放置2min，PAGE电泳2h，-70℃压片10min，洗片后根据胶片上条带割胶，放入1.5ml离心管，捣 碎后加ddH 2 O200μl浸泡过夜，离心后取上清。取1μl测为3103.37CPM。
1.2.7 Gel shift assay DNA-蛋白质结合反应体系;冰上加入10×Binding Buffer2μl+核蛋白20μg(5μl)+Poly dI-dC(1μg/ul)2μl+PolyL-Lysinelul+Unlabelled Double Stranded Oligonucleotide3μl+Labelled.Double Stranded Oligonucleotide lul+ddH 2 0.6μl，冰上放置15min后，置室温15min。制备6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，于4℃进行电泳。6%非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳Buffer中以10～15V/cm电压预电泳2h，向样品溶液加入5μl上样缓冲液混匀后上样电泳，在4℃以8V/cm电压电泳，约2～3h后待溴酚蓝泳至胶的3/4位置时停止电泳。剥胶后用保鲜膜包好后压片，-70℃放射自显影。
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1.2.8 RT-PCR Assay RNA抽提。对Ox-LDL作用各时间点的MsC，弃去培养液，冰预冷的PBS洗涤MsC3次，各孔加入TRIzol试剂1ml，置室温裂解5min，匀浆器反复研磨裂解液，匀浆后的液体室温放置5min，加入0.2ml的氯仿，上述混合物反复震摇，室温放置5min，于4℃以10000rpm离心15min，转移上层无色液相至另一1.5ml Eppendorff管中，加入0.5ml的异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，再于4℃以10000rpm离心15min，离心后可见管底沉淀物，弃上清，75%酒精洗涤沉淀，真空中干燥，见痕量水分蒸发即溶解RNA于DEPC水中，吸取1μl上述RNA溶液于紫外分光光度仪测定OD260和OD280，样品保存于-70℃备用。
cDNA的合成扩增，引物序列如下:
TGF-betal:
上游引物:5’-GCCAGATCCTGTCCAAACTAA-3’
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下游引物:5’-TTGGTATCCAGGGCTCTC-3’
GAPDH:
上游引物:5’-ATCACCATCTTCCAGGAG-3’
下游引物:5’-GAACACGGAAGGCCATGC-3’
取25ng RNA，置65℃变性10min，于冰上冷却，在1.5ml Eppendorff管中依次加入下列物质:热变性25ng RNA，1μL Oligo(dT)(0.5g/L)，cDNA合成试剂盒中第一链反应混合物(含逆转录酶M-MuLV，dNTP和反应缓冲液)1份及80U RNasin，混合均匀后，于37℃保温1h。取2.0μl反转录液(cDNA)，加入0.2mmol/LdNTP，1.5mmol/L Mg 2+ ，10μl10×buffer，40pmol/L TGF-β1和GAPDH寡核苷酸引物，总反应体积50μl。PCR反应条件如下:95℃30s，62℃1min，721min，40个循环。
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1.2.9 统计分析 胶片和凝胶图像经图像扫描后显示为密度积光值，所有数据均以3次实验的均数±标准差指示，组间比较用方差分析(采用SPSS8.0统计软件)，P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 SD大鼠肾小球系膜细胞的鉴定结果 系膜细胞光镜观察形态不规则，胞浆多突起。免疫组织化学染色发现细胞质内抗原角蛋白(keratin)及CD34均为阴性，而结蛋白(desmin)呈阳性，由于角蛋白和CD34分别是上皮细胞、内皮细胞的特异性标记抗原，而结蛋白为系膜细胞的标记蛋白，本实验结果可基本排除肾小球的另外两种固有细胞，证实所得细胞是系膜细胞。
2.2 Ox-LDL对TGF-betal启动子活性的影响 TGF-betal启动子全长(-1550～+57)质粒荧光素酶活性的表示设定正常细胞对照组活性为1，取其它各组与它的相对值分析。pRT1质粒荧光素酶活性对Ox-LDL诱导呈剂量依赖性增强，50μg/ml时即明显增强(P<0.001，1vs3.65)，100μg/ml达到较高水平(P<0.05，3.65vs54.59)。pRT1质粒荧光素酶活性对100μg/ml的Ox-LDL刺激随时间变化出现两个高峰，6h明显增强(P<0.001，1vs4.23)，在12h和24h与6h相比有所下降(4.23vs1.95，2.38)，与24h相比36h又达到一个最高值(P<0.05，2.38vs4.61)，48h与36h相比较又有下降(P<0.05，4.61vs3.85)(见图1，2)。
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图1 Ox-LDL刺激不同时间的TGF-β1启动子活性(略) 各组大鼠系膜细胞以100μg/ml的Ox-LDL孵育不同时间，对照组荧光素酶活性被设定为1.0，其他各组取与之相比的相对值。结果提示TGF-β1启动子活性在6h(P<0.01，1vs4.23)和36h(P<0.05，2.38vs4.61)达到峰值。
图2 TGF-β1启动子活性对不同Ox-LDL刺激浓度的反应(略)
大鼠肾脏系膜细胞与不同浓度的Ox-LDL(50～200μg/ml)孵育36h，对照组的TGF-β1启动子活性被设定为1.0，余各组取与之相比较的相对值。结果提示TGF-β1启动子活性对Ox-LDL的刺激呈浓度依赖性上升。
2.3 Ox-LDL对MsC中TGF-β1mRNA水平的影响 MsC中TGF-β1的mRNA对Ox-LDL的刺激以时间和剂量依赖性增加。RT-PCR结果显示，100μg/ml的Ox-LDL作用MsC6h后TGF-β1的转录即明显加强(P<0.05)，随Ox-LDL作用时间的延长，TGF-β1的转录逐渐增强，于36h、48h达高峰;以不同浓度的Ox-LDL刺激MsC36h，发现50μg/ml的Ox-LDL即可引起TGF-β1的mRNA明显增加 (P<0.05)，随Ox-LDL浓度的增加，TGF-β1的转录亦随之增强，以200μg/ml的Ox-LDL的作用最为显著(见图3，4)。
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图3 不同浓度的Ox-LDL诱发TGF-betal的表达 RT-PCR所用mRNA来自不同浓度刺激的系膜细胞，各组细胞均用Ox-LDL刺激36h，所得条带由四星图像分析软件扫描后定量。ˇP<0.05(略)
图4 TGF-betal mRNA依Ox-LDL(100μg/ml)刺激的时间变化Ox-LDL(100μg/ml)刺激系膜细胞不同时间后，分离RNA进行PT-PCR半定量。Ox-LDL刺激24h后，TGF-β1mRNA明显上升。ˇP<0.05(略)
2.4 Ox-LDL诱导后NF-κB活性变化 系膜细胞NF-κB活性对Ox-LDL刺激依时间延伸持续激活，正常细胞对照组系膜细胞可检测出微弱的NF-κB条带，条带经扫描后以光密度值定量分析，设定对照组光密度值为1，其他各组为相对值。NF-κB活性随Ox-LDL刺激浓度增加而增强。Ox-LDL50μg/ml即诱发NF-κB活性的明显增强(P<0.05，1vs2.82)，刺激浓度增加NF-κB活性随之增强(P<0.05，2.82vs4.91，5.7，6.05)(见图5a，5b)，Ox-LDL刺激6h其活性明显增强(1vs3.59，P<0.05)，12h其活性开始降低，24h最低(1.75vs0.68，P<0.05)，36h又达到一个高值(0.68vs3.4，P<0.001)，48h又有所降低(3.4vs2.5，P<0.05)(见图6a，6b)。
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图5 不同浓度Ox-LDL刺激下的NF-kappaB结合活性(略)
5a.条带1，对照组;条带2，50μg/ml;条带3，100μg/ml;条带4.150μg/ml;条带5，200μg/ml;FP，游离探针;RB，阻滞条带。5b.NF-kappaB阻滞条带由图像分析软件处理后半定量，对照组灰度被设定为1.0，其余各组为与之相比较的相对值，数据为3次独立实验的均数±标准差。NF-kappaB结合活性对Ox-LDL的刺激呈浓度依赖性上升。
3 讨论
慢性肾小球疾病进程中，肾小球硬化扮演着主要角色，它的特点是肾脏持续的纤维化，而与纤维合成和分解密度相关的TGF-β1被认为是关键的中介作用因子，肾小球的高渗透压、高血流量、系膜细胞的牵张以及肾素-血管紧张素系统的激活、高糖、高脂都能刺激TGF-β1的过量表达 [9～13] ，但确切机制仍不明确。Ox-LDL对肾脏损伤作用中，有证据表明有TGF-β1的参与，而且TGF-β1又能促进Ox-LDL受体在肾脏的表达 [14] ，两者似乎形成一个正反馈的调节。我们以前的研究已从蛋白、mRNA水平证实Ox-LDL诱导TGF-β1的表达增强 [15] ，而本实验也用RT-PCR方法证实Ox-LDL以时间和浓度依赖的方式诱导了TGF-β1的转录。但其机制仍未明确，因此本研究进一步从转录 水平研究Ox-LDL刺激肾脏系膜细胞TGF-β1的表达变化。
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图6 NF-kappaB结合活性对Ox-LDL刺激的时间变化(略)
6a.大鼠系膜细胞与100μg/ml Ox-LDL孵育不同时间。条带1，随机序列;条带2，100倍未标记探针;条带3，对照组;条带4，6h;条带5，12h;条带6，24h;条带7，36h;条带8，48h;FP，游离探针;RB，阻滞条带。6b.NF-kappaB的阻滞条带由图像分析软件扫描后半定量。
实验以TGF-β1转录起始位点上游-1550～+57序列构建的pGL3-Basic质粒荧光素酶报告系统来研究TGF-β1启动子的活性，其检测灵敏度优于其他一些常用的报告基因。研究结果显示在Ox-LDL刺激后-1550～+57序列所构建的报告质粒荧光素酶活性在36h达到最高，48h与36h明显变化;TGF-β1启动子活性对Ox-LDL的刺激亦呈剂量依赖性升高。结果进一步证实Ox-LDL在转录水平对系膜细胞TGF-β1表达的诱导。推测Ox-LDL对肾脏的损伤可能有TGF-β1介导作用。那么Ox-LDL又是如何对TGF-β1的表达进行调控的呢?一个基因的表达有转录因子的参与，那么在上述过程中会有哪些转录因子的参与呢?
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NF-κB作为一个重要的转录因子，参与许多基因的调控，特别是对免疫炎症、抗凋亡和肿瘤相关基因的表达起着非常重要的作用。大多数肾脏疾病都涉及细胞增殖和免疫炎症反应，这些都离不开各种细胞因子的异常表达，而NF-κB参与许多细胞因子的表达调控，在肾脏病变的发病机制中扮演重要角色。肾脏病所致的高肾素-血管紧张素活性 [16] 、蛋白尿 [17] ，糖尿病的高血糖 [18] 、白蛋白尿 [19] 以及晚期糖化终止物 [20] 都可以引起肾脏固有细胞的NF-κB的异常活化，调节一系列细胞因子及细胞外基质的转录表达使肾脏病变机制复杂化。Ox-LDL在许多种类的细胞尤其是巨噬细胞中对一些基因表达的影响是通过NF-κB来实现的 [21] ，肾脏系膜细胞有着巨噬细胞的某些功能，那么，Ox-LDL对系膜细胞的影响会有NF-κB的参与吗?
我们应用凝胶迁移率实验对Ox-LDL刺激肾脏系膜细胞NF-κB的活性进行检测，发现其活性对Ox-LDL刺激在6h明显增强，随着时间的延长其活性有所降低，在24h达到最低，然后其活性又开始增强，在36h达到一个最高点，凝胶迁移率实验中随机的非特异序列对标记探针与核蛋白的结合无影响，而100倍的未标记的结合序列可以安全阻断这种结合，由此，可以证明与该探针结合的蛋白为NF-κB。本研究结果提示:系膜细胞在Ox-LDL的刺激下，NF-κB的活性在早期虽有明显波动，但却被持续激活，参与了Ox-LDL在肾脏的损伤。我们也对大鼠TGF-β1转录起始位点上游的序列用MatInspector V2.2软件进行了扫描，结果显示存在于-715～-707之间的碱基序列AGGGACTT与NF-κB结合的保守序列完全一致，这也是我们为什么选用TGF-β1上游1000多个碱基构成报告质粒，而不是大家通常研究的启动子长度(200bp左右)的原因。综合我们的研究结果，我们推测Ox-LDL可能通过其上游的信号通路引起IκB的降解，从而释放NF-κB二聚体的活性，后者转位到核，结合于上述位点，参与TGF-β1的转录。但本研究仍有许多问题需要深入研究，如为什么NF-κB活性早期会有波动、NF-κB是由p50、p52、p65、RelB以及c-Rel组成的同源或异源二聚体，Ox-LDL刺激究竟以哪一种或几种亚基活性增强为主以及其上游IκB降解的信号传导通路都需要进一步研究。
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(收稿日期:2003-04-20) (编辑 晓勇), 百拇医药
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Lan Yang，Zhou Qin，Wu Zhaolong
Division of Nephrology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To investigate the binding activity of nuclear factor-kappaB(NF-κB)and the tranˉscription of transforming growth factor-betal(TGF-β1)induced by oxidized low density lipoprotein(Ox-LDL)，and to clarify themolecular mechanism of kidney damage by Ox-LDL.Methods A promoter construct wasused to deˉtect the expression of TGF-betal by transient transfection into mesangial cells.And TGF-β1mRNA was determined by RT-PCR assay in mesangial cells exposed to Ox-LDL.The binding activity of NF-κB was measured by gel shift assay.Results The overproduction of TGF-β1increased in a dose-dependent way in mesangial cells incubated with Ox-LDL and reached the maximum at the36 th hour.The binding activity of NF-κB enhanced at the6 th and36 th hour and increased withadded dose of Ox-LDL.Conclusion Ox-LDL induced overexpression of TGF-betal in cultured mesangial cells.It was probably mediated by NF-κB.
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Key words oxidation of low density lipoprotein transforming growth factor-betal nuclear factor-kappaB
氧化低密度胆蛋白(oxidation of low density lipoprotein，Ox-LDL)在肾脏病的发生发展中扮演着重要角色。Ox-LDL与细胞膜上的特异或非特异受体结合而沉积于肾脏固有细胞内，促使其释放各种因子，最终引起肾小球的细胞增殖和细胞外基质沉积，但机制尚未被阐明。核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)，是由p50、p52、p65、RelB和c-Rel蛋白组成的同源和异源二聚体，能与多种细胞因子、生长因子、化学趋化因子以及细胞外基质基因的启动子上的特异位点结合，启动其转录，在免疫炎症反应、抗凋亡和肿瘤发生中起着重要作用。在冠状动脉内皮细胞、PC12、RAW264.7巨噬细胞系均有报道Ox-LDL通过激活NF-κB而诱导一些重要基因的表达 [1～3] ，但有关它对肾脏细胞影响的研究未见报道。本研究采用SD大鼠肾脏系膜细胞为研究对象，观察Ox-LDL对系膜细胞NF-κB结合活性的影响，同时也检测肾脏病发病中介因子—转化生长因子(transforming growth factor-betal，TGF-β1)的启动子活性，探讨脂质肾损伤的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 材料 RPMI1640购自Gibco BRL公司，NF-kappaB特异结合序列双链和双荧光素酶测定试剂盒购自Promega公司，转染试剂GeneJammer TM 购自Stratagene公司，低密度脂蛋白(LDL)购自Sigma公司，TGF-β1启动子全长(-1500～+57)荧光素酶报告质粒pGL3-Basic(pRT1)见报道 [4] ，内参荧光素酶报告质粒pRL-SV40购自Promega公司。TRlzol试剂购自TaKaRa公司，γ- 32 P-dATP购自北京亚辉生物技术公司。Keratin、CD34及desmin一抗购自Sant Cruz公司。HRP标记的二抗及ECL试剂购自上海普飞生物技术公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SD大鼠系膜细胞原代分离、传代培养及鉴定参照张明 [5] 、梅长林[6] 等的方法略作修改。4只7～10周龄(100～150g)的雄性SD大鼠颈椎脱位处死后浸泡于70%酒精中消毒15min。在无菌环境中:剪开腹腔充分暴露腹主动脉、下腔动脉和双侧肾脏，用PBS(pH7.4)进行腹主动脉逆行灌注至双侧肾脏发白，剪开包膜后取肾脏，沿皮髓线分离皮质切碎成1mm大小的碎屑，从上至下按顺序放好80、150、200目的不锈钢筛网，将碎屑移至80目不锈钢筛网，以无菌注射器针芯轻轻按压碎屑，同时用PBS冲洗，移去80目钢筛，边用针芯按压边用PBS冲洗150目钢筛，用PBS冲洗数次后收集200目钢筛上的肾小球。0.1%Ⅳ胶原酶37℃水浴震摇消化30min，PBS洗2次，最后离心收集肾小球，重悬于RPM1640(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1.5mMHEPES)10ml，分装入两只5ml培养瓶，5%CO 2 、37℃培养箱培养。大约3周后系膜细胞(MsC)开始长出，4周左右能长到融合。原代细胞生长融合传代后用10%FBS的RPˉMI1640培养。实验用系膜细胞为第5～8代细胞。系膜细胞鉴定用免疫组织化学方法。
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1.2.2 实验分组 转染实验分组:系膜细胞以每孔0.5×10 5 细胞数传代至24孔板，长至60%～80%融合即随机分为对照组和Ox-LDL处理组。NF-kappaB活性检测分组:系膜细胞90%融合时更换培养液为0.5%胎牛血清RPˉMI1640培养液，待24h后随机分为正常细胞组和Ox-LDL处理组。
1.2.3 氧化低密度脂蛋白的制备 用铜氧化法氧化LDL [7] 。向LDL中加入终浓度为5μmol/L CuSO 4 ，37℃水浴箱放置16h，以终浓度为200μmol/L的EDTA和40μmol/L的2，6-二叔丁基苯酚终止反应，PBS透析×3次，RPMI1640透析1次，0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。Ox-LDL蛋白质定量用Bladford法，用荧光分光光度法测定Ox-LDL中丙二醛含量 [8]。
1.2.4 转染实验及双荧光素酶活性检测 转染实验:基本按GeneJammer TM 转染试剂说明进行操作。系膜细胞60%～80%融合时，以不含血清的RPMI1640洗细胞3次，加150μl不含抗生素的10%胎牛血清RPMI1640，置培养箱待转染。向一灭菌eppendorff管中加100μl的RPMI1640和转染试剂2μl，吹打混匀后室温放置10min，再加入4μg质粒pRT1和0.4μg的pRL-SV40，轻轻吹打混匀，置室温5min后加入培养孔，轻晃培养板混匀，置培养箱3h，加入250μl无抗生素10%胎牛血清RPMI1640，6h后加Ox-LDL刺激。最后于不同时间点收获裂解细胞冻存-70℃备用。
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双荧光素酶活性检测:细胞裂解液自-70℃取出后室温放置15min，短暂离心，取10ml上清加入样品检测管，分别检测加底物Ⅰ和底物Ⅱ后的10s荧光计数，第2次所得值为内参值，取两次所得值相对值分析。
1.2.5 核蛋白抽提 弃去培养液，冰预冷的PBS洗细胞2次，将细胞用细胞刮刮下，收集于1.5ml离心管中，3000×rpm离心5min，细胞沉淀-20℃放置5min，重悬于400μl缓冲液A(10mmol/L HEPES-KOH pH7.9，10mmol/L KCl，105mmol/L MgCl 2 ，用前临时加入1mmol/L DTT，1mmol/L PMSF，10μg/ml Leupeptin，10μg/ml Aprotinin，1mmol/L Na 3 VO 3 )中，冰上放置5min，加入终浓度为0.1%的NP-40，来回倒置10次，再置冰上5min，8000×rpm离心5min弃上清，缓冲液A洗涤1次，将细胞核沉淀悬于缓冲液B100μl轻轻吹打至液体不再粘稠，置冰上搅拌30min，12000×rpm于4℃离心30min，所得上清为核蛋白，以1:100体积透析2次，Bradˉford法定量蛋白，按每管20μg冻存于-70℃备用。
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1.2.6 双链寡核苷酸探针的标记 反应体系:10×T 1 Polynucleotide Kinase Bufferlul+NF-kappaB Double stranded Oligoucleotide5μl+γ- 32 P-dATP1μl+T 1 PK1μl+ddH2 O2μl37℃水浴30min，冰上放置2min，PAGE电泳2h，-70℃压片10min，洗片后根据胶片上条带割胶，放入1.5ml离心管，捣 碎后加ddH 2 O200μl浸泡过夜，离心后取上清。取1μl测为3103.37CPM。
1.2.7 Gel shift assay DNA-蛋白质结合反应体系;冰上加入10×Binding Buffer2μl+核蛋白20μg(5μl)+Poly dI-dC(1μg/ul)2μl+PolyL-Lysinelul+Unlabelled Double Stranded Oligonucleotide3μl+Labelled.Double Stranded Oligonucleotide lul+ddH 2 0.6μl，冰上放置15min后，置室温15min。制备6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，于4℃进行电泳。6%非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳Buffer中以10～15V/cm电压预电泳2h，向样品溶液加入5μl上样缓冲液混匀后上样电泳，在4℃以8V/cm电压电泳，约2～3h后待溴酚蓝泳至胶的3/4位置时停止电泳。剥胶后用保鲜膜包好后压片，-70℃放射自显影。
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1.2.8 RT-PCR Assay RNA抽提。对Ox-LDL作用各时间点的MsC，弃去培养液，冰预冷的PBS洗涤MsC3次，各孔加入TRIzol试剂1ml，置室温裂解5min，匀浆器反复研磨裂解液，匀浆后的液体室温放置5min，加入0.2ml的氯仿，上述混合物反复震摇，室温放置5min，于4℃以10000rpm离心15min，转移上层无色液相至另一1.5ml Eppendorff管中，加入0.5ml的异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，再于4℃以10000rpm离心15min，离心后可见管底沉淀物，弃上清，75%酒精洗涤沉淀，真空中干燥，见痕量水分蒸发即溶解RNA于DEPC水中，吸取1μl上述RNA溶液于紫外分光光度仪测定OD260和OD280，样品保存于-70℃备用。
cDNA的合成扩增，引物序列如下:
TGF-betal:
上游引物:5’-GCCAGATCCTGTCCAAACTAA-3’
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下游引物:5’-TTGGTATCCAGGGCTCTC-3’
GAPDH:
上游引物:5’-ATCACCATCTTCCAGGAG-3’
下游引物:5’-GAACACGGAAGGCCATGC-3’
取25ng RNA，置65℃变性10min，于冰上冷却，在1.5ml Eppendorff管中依次加入下列物质:热变性25ng RNA，1μL Oligo(dT)(0.5g/L)，cDNA合成试剂盒中第一链反应混合物(含逆转录酶M-MuLV，dNTP和反应缓冲液)1份及80U RNasin，混合均匀后，于37℃保温1h。取2.0μl反转录液(cDNA)，加入0.2mmol/LdNTP，1.5mmol/L Mg 2+ ，10μl10×buffer，40pmol/L TGF-β1和GAPDH寡核苷酸引物，总反应体积50μl。PCR反应条件如下:95℃30s，62℃1min，721min，40个循环。
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1.2.9 统计分析 胶片和凝胶图像经图像扫描后显示为密度积光值，所有数据均以3次实验的均数±标准差指示，组间比较用方差分析(采用SPSS8.0统计软件)，P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 SD大鼠肾小球系膜细胞的鉴定结果 系膜细胞光镜观察形态不规则，胞浆多突起。免疫组织化学染色发现细胞质内抗原角蛋白(keratin)及CD34均为阴性，而结蛋白(desmin)呈阳性，由于角蛋白和CD34分别是上皮细胞、内皮细胞的特异性标记抗原，而结蛋白为系膜细胞的标记蛋白，本实验结果可基本排除肾小球的另外两种固有细胞，证实所得细胞是系膜细胞。
2.2 Ox-LDL对TGF-betal启动子活性的影响 TGF-betal启动子全长(-1550～+57)质粒荧光素酶活性的表示设定正常细胞对照组活性为1，取其它各组与它的相对值分析。pRT1质粒荧光素酶活性对Ox-LDL诱导呈剂量依赖性增强，50μg/ml时即明显增强(P<0.001，1vs3.65)，100μg/ml达到较高水平(P<0.05，3.65vs54.59)。pRT1质粒荧光素酶活性对100μg/ml的Ox-LDL刺激随时间变化出现两个高峰，6h明显增强(P<0.001，1vs4.23)，在12h和24h与6h相比有所下降(4.23vs1.95，2.38)，与24h相比36h又达到一个最高值(P<0.05，2.38vs4.61)，48h与36h相比较又有下降(P<0.05，4.61vs3.85)(见图1，2)。
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图1 Ox-LDL刺激不同时间的TGF-β1启动子活性(略) 各组大鼠系膜细胞以100μg/ml的Ox-LDL孵育不同时间，对照组荧光素酶活性被设定为1.0，其他各组取与之相比的相对值。结果提示TGF-β1启动子活性在6h(P<0.01，1vs4.23)和36h(P<0.05，2.38vs4.61)达到峰值。
图2 TGF-β1启动子活性对不同Ox-LDL刺激浓度的反应(略)
大鼠肾脏系膜细胞与不同浓度的Ox-LDL(50～200μg/ml)孵育36h，对照组的TGF-β1启动子活性被设定为1.0，余各组取与之相比较的相对值。结果提示TGF-β1启动子活性对Ox-LDL的刺激呈浓度依赖性上升。
2.3 Ox-LDL对MsC中TGF-β1mRNA水平的影响 MsC中TGF-β1的mRNA对Ox-LDL的刺激以时间和剂量依赖性增加。RT-PCR结果显示，100μg/ml的Ox-LDL作用MsC6h后TGF-β1的转录即明显加强(P<0.05)，随Ox-LDL作用时间的延长，TGF-β1的转录逐渐增强，于36h、48h达高峰;以不同浓度的Ox-LDL刺激MsC36h，发现50μg/ml的Ox-LDL即可引起TGF-β1的mRNA明显增加 (P<0.05)，随Ox-LDL浓度的增加，TGF-β1的转录亦随之增强，以200μg/ml的Ox-LDL的作用最为显著(见图3，4)。
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图3 不同浓度的Ox-LDL诱发TGF-betal的表达 RT-PCR所用mRNA来自不同浓度刺激的系膜细胞，各组细胞均用Ox-LDL刺激36h，所得条带由四星图像分析软件扫描后定量。ˇP<0.05(略)
图4 TGF-betal mRNA依Ox-LDL(100μg/ml)刺激的时间变化Ox-LDL(100μg/ml)刺激系膜细胞不同时间后，分离RNA进行PT-PCR半定量。Ox-LDL刺激24h后，TGF-β1mRNA明显上升。ˇP<0.05(略)
2.4 Ox-LDL诱导后NF-κB活性变化 系膜细胞NF-κB活性对Ox-LDL刺激依时间延伸持续激活，正常细胞对照组系膜细胞可检测出微弱的NF-κB条带，条带经扫描后以光密度值定量分析，设定对照组光密度值为1，其他各组为相对值。NF-κB活性随Ox-LDL刺激浓度增加而增强。Ox-LDL50μg/ml即诱发NF-κB活性的明显增强(P<0.05，1vs2.82)，刺激浓度增加NF-κB活性随之增强(P<0.05，2.82vs4.91，5.7，6.05)(见图5a，5b)，Ox-LDL刺激6h其活性明显增强(1vs3.59，P<0.05)，12h其活性开始降低，24h最低(1.75vs0.68，P<0.05)，36h又达到一个高值(0.68vs3.4，P<0.001)，48h又有所降低(3.4vs2.5，P<0.05)(见图6a，6b)。
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图5 不同浓度Ox-LDL刺激下的NF-kappaB结合活性(略)
5a.条带1，对照组;条带2，50μg/ml;条带3，100μg/ml;条带4.150μg/ml;条带5，200μg/ml;FP，游离探针;RB，阻滞条带。5b.NF-kappaB阻滞条带由图像分析软件处理后半定量，对照组灰度被设定为1.0，其余各组为与之相比较的相对值，数据为3次独立实验的均数±标准差。NF-kappaB结合活性对Ox-LDL的刺激呈浓度依赖性上升。
3 讨论
慢性肾小球疾病进程中，肾小球硬化扮演着主要角色，它的特点是肾脏持续的纤维化，而与纤维合成和分解密度相关的TGF-β1被认为是关键的中介作用因子，肾小球的高渗透压、高血流量、系膜细胞的牵张以及肾素-血管紧张素系统的激活、高糖、高脂都能刺激TGF-β1的过量表达 [9～13] ，但确切机制仍不明确。Ox-LDL对肾脏损伤作用中，有证据表明有TGF-β1的参与，而且TGF-β1又能促进Ox-LDL受体在肾脏的表达 [14] ，两者似乎形成一个正反馈的调节。我们以前的研究已从蛋白、mRNA水平证实Ox-LDL诱导TGF-β1的表达增强 [15] ，而本实验也用RT-PCR方法证实Ox-LDL以时间和浓度依赖的方式诱导了TGF-β1的转录。但其机制仍未明确，因此本研究进一步从转录 水平研究Ox-LDL刺激肾脏系膜细胞TGF-β1的表达变化。
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图6 NF-kappaB结合活性对Ox-LDL刺激的时间变化(略)
6a.大鼠系膜细胞与100μg/ml Ox-LDL孵育不同时间。条带1，随机序列;条带2，100倍未标记探针;条带3，对照组;条带4，6h;条带5，12h;条带6，24h;条带7，36h;条带8，48h;FP，游离探针;RB，阻滞条带。6b.NF-kappaB的阻滞条带由图像分析软件扫描后半定量。
实验以TGF-β1转录起始位点上游-1550～+57序列构建的pGL3-Basic质粒荧光素酶报告系统来研究TGF-β1启动子的活性，其检测灵敏度优于其他一些常用的报告基因。研究结果显示在Ox-LDL刺激后-1550～+57序列所构建的报告质粒荧光素酶活性在36h达到最高，48h与36h明显变化;TGF-β1启动子活性对Ox-LDL的刺激亦呈剂量依赖性升高。结果进一步证实Ox-LDL在转录水平对系膜细胞TGF-β1表达的诱导。推测Ox-LDL对肾脏的损伤可能有TGF-β1介导作用。那么Ox-LDL又是如何对TGF-β1的表达进行调控的呢?一个基因的表达有转录因子的参与，那么在上述过程中会有哪些转录因子的参与呢?
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NF-κB作为一个重要的转录因子，参与许多基因的调控，特别是对免疫炎症、抗凋亡和肿瘤相关基因的表达起着非常重要的作用。大多数肾脏疾病都涉及细胞增殖和免疫炎症反应，这些都离不开各种细胞因子的异常表达，而NF-κB参与许多细胞因子的表达调控，在肾脏病变的发病机制中扮演重要角色。肾脏病所致的高肾素-血管紧张素活性 [16] 、蛋白尿 [17] ，糖尿病的高血糖 [18] 、白蛋白尿 [19] 以及晚期糖化终止物 [20] 都可以引起肾脏固有细胞的NF-κB的异常活化，调节一系列细胞因子及细胞外基质的转录表达使肾脏病变机制复杂化。Ox-LDL在许多种类的细胞尤其是巨噬细胞中对一些基因表达的影响是通过NF-κB来实现的 [21] ，肾脏系膜细胞有着巨噬细胞的某些功能，那么，Ox-LDL对系膜细胞的影响会有NF-κB的参与吗?
我们应用凝胶迁移率实验对Ox-LDL刺激肾脏系膜细胞NF-κB的活性进行检测，发现其活性对Ox-LDL刺激在6h明显增强，随着时间的延长其活性有所降低，在24h达到最低，然后其活性又开始增强，在36h达到一个最高点，凝胶迁移率实验中随机的非特异序列对标记探针与核蛋白的结合无影响，而100倍的未标记的结合序列可以安全阻断这种结合，由此，可以证明与该探针结合的蛋白为NF-κB。本研究结果提示:系膜细胞在Ox-LDL的刺激下，NF-κB的活性在早期虽有明显波动，但却被持续激活，参与了Ox-LDL在肾脏的损伤。我们也对大鼠TGF-β1转录起始位点上游的序列用MatInspector V2.2软件进行了扫描，结果显示存在于-715～-707之间的碱基序列AGGGACTT与NF-κB结合的保守序列完全一致，这也是我们为什么选用TGF-β1上游1000多个碱基构成报告质粒，而不是大家通常研究的启动子长度(200bp左右)的原因。综合我们的研究结果，我们推测Ox-LDL可能通过其上游的信号通路引起IκB的降解，从而释放NF-κB二聚体的活性，后者转位到核，结合于上述位点，参与TGF-β1的转录。但本研究仍有许多问题需要深入研究，如为什么NF-κB活性早期会有波动、NF-κB是由p50、p52、p65、RelB以及c-Rel组成的同源或异源二聚体，Ox-LDL刺激究竟以哪一种或几种亚基活性增强为主以及其上游IκB降解的信号传导通路都需要进一步研究。
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(收稿日期:2003-04-20) (编辑 晓勇), 百拇医药