川芎天麻液对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究
【摘要】 目的 探讨川芎天麻液对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。方法 利用插线法制作动物模型，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组和川芎天麻组，连续给药21天后行脑缺血再灌注术，并检测大鼠的神经功能、脑组织含水率及检测脑组织中SOD、CAT、MDA、NO的含量。结果 川芎天麻液能改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损伤、减轻脑水肿，能降低脑内的MDA、NO的含量，同时还提高SOD、CAT的活性。结论 川芎天麻液具有改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损伤、减轻脑水肿的作用，并且具有清除自由基、抗脂质过氧化的功能，对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。
关键词 川芎天麻液 自由基 脑缺血再灌注 脑水肿
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0663-03
Study on protective effects of chuanxiong tianma liquid on
, 百拇医药
cerebral ischemic reperfusion injury of rats Zhang Xiaofeng，Wang Muyi，Wang Yuhua，et al.
The Central Hospital of Benxi，Benxi117000.
【Abstract】 Objective It was proved that Chuanxiong Tianma liquid has therole of neural protection in the cerebral ischemia by examining.Methods We madethe model of middle cerebral artery occlusion by inserting thread into middle cerebral artery，and then examine the rat’s neural function，the water rate of cerebral tissue and the content of SOD，CAT，MAD and NO in the cerebral tissue.Results Chuanxiong Tianma liquid could improve the rat’s neural function when therat injuried ischemia-reperfusion，could reduce hydrocephalus，and could reduce
, 百拇医药
the content of MDA and NO in the cerebral tissue，at the same time it could increase the activity of SOD and CAT in the cerebral tissue.Conclusion Chuanxiong Tianma liquid can improve the neural function of the cerebral ischemia-reperfusion injury and can reduces hydrocephalus.
Key words Chuanxiong Tianma liquid free radical formation cerebral ischemia-reperfusion hydrocephalus
近年来对缺血性脑损伤的病理生理机制提出了一种新的理论，即损伤级联反应 [1](cascade of damage)，它包括兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和程序性细胞死亡四种机制。当脑缺血缺氧时，某些酶导致自由基的产生，损害细胞并进一步去极化释放钾，引起梗死周围的去极化。氧自由基和其他信使激活炎症细胞因子和酶，产生炎症反应，而炎症反应又产生自由基，导致恶性循环。氧自由基损伤DNA，导致细胞凋亡 [2] 。有实验报道超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)具有清除自由基的作用 [3] 。丙二醛(MDA)是自由基引起脂质过氧化的最终产物。一氧化氮(NO)在脑组织中过度产生具有细胞毒性作用。因此清除自由基在缺血性脑损伤治疗中起着关键性的作用。
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1 材料与方法
1.1 材料 川芎天麻液(每100ml液体中含生药川芎、天麻各10g，批号:20000905)由本溪市中心医院制剂室提供，尼莫地平(四川珍珠制药厂，20mg/片，批号:20000218)购于辽宁省中卫医药公司。CAT检测试剂盒购自:南京建成生物工程研究所，MDA、SOD、NO试剂由中国医科大学公共卫生学院实验室提供。所用动物为Wistar大鼠，体重为(240±40)g，由中国医科大学动物实验室提供。
1.2 方法 取72只大鼠，随机将大鼠分为四组，即假手术组12只、模型组20只、尼莫地平组20只、川芎天麻组20只，假手术组不给药，模型组、尼莫地平组、川芎天麻组分别灌胃给予生理盐水10ml/kg，尼莫地平100mg/kg、川芎天麻液10ml/kg，连续给药21天，末次给药后40min行脑缺血再灌术。动物模型制作采用Longa [4] 的插线法制作脑缺血再灌注模型。神经功能评分采用Longa和Bederson [5] 的5分制评分法。脑组织含水率采用Elliotte公式计算脑组织含水率 [6] (含水率=湿重-干重/湿重×100%)。假手术组6只、模型组8只、尼莫地平组8只、川芎天麻组6只，取脑匀浆上清液后进行总蛋白、MDA、SOD、CAT、NO测定，MDA检测采用硫代巴比妥法，SOD检测采用羟胺法，CAT检测采用紫外分光法，NO检测采用镉还原比色法，总蛋白测定采用双缩脲法。采用方差齐性检验及t检验进行统计学分析。
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2 结果
2.1 各组大鼠的神经功能评分 经过对模型组、尼莫地平组、川芎天麻组大鼠神经功能评分，可见尼莫地平组和川芎天麻组大鼠的神经功能优于模型组，见表1。
表1 神经功能评分统计表 (略)
2.2 各组大鼠脑组织含水率的测定 每组随机选取6只大 鼠测定脑组织含水率，由表2可见尼莫地平组和川芎天麻液组大鼠的含水率明显少于模型组，而川芎天麻液组的大鼠脑含水率少于尼莫地平组，见表2。
2.3 各组大鼠脑组织各项生化指标检测 见表3，与假手术组比较，模型组大鼠MDA、NO含量明显升高，SOD、CAT活性明显降低，表明脑缺血再灌注使脑内脂质过氧化明显增强，与模型组比较，川芎天麻组与尼莫地平组不同程度地降低脑内的MDA、NO的含量，同时还提高SOD、CAT的活性。
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表2 各组大鼠脑组织含水率 (略)
表3 各组大鼠脑组织中MDA、NO、SOD、CAT含量变化 (略)
3 讨论
缺血性脑损伤是神经系统中发病率最高的一种疾病，对其发病机制的研究有许多假说，目前提出一种新的病理生理机制-损伤级联反应 [1] 。它主要包括兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和程序性细胞死亡四种机制。它们都由脑缺血引发，发生在四个不同时间点，但有重叠并互相联系。因此，对此病的治疗与存在许多用药环节和用药时机问题，阻断任何一个环节都可以防止损伤级联反应的进一步发展，本实验就是通过应用川芎天麻液治疗大鼠缺血性再灌注脑损伤观察其在清除自由基、抗脂质过氧化、抗炎、减轻脑水肿方面起到神经保护作用。
脑缺血缺氧后血液再灌注过程，可以触发自由基的连锁增强反应，产生大量的氧自由基和羟自由基，攻击膜蛋白质，核酸及生物膜上的不饱和脂肪酸而造成细胞损伤 [3] 。因此缺血缺氧是以生物膜上的脂质过氧化为标志的，也有学者发现脑缺血后血流量重建时脑组织损害加重，推测脂质过氧化发生在灌流期 [7] 。
, 百拇医药
由于自由基参与了脂质过氧化过程，因此清除自由基，对于减轻脑损伤，阻断兴奋性毒性等环节，防止损伤级联反应有着十分重要的意义。而SOD、CAT就是两种能有效清除体内单线态氧(′O 2 )、超氧阴离子(O 2 ·- )、羟自由基(-OH)等多种自由基的抗氧化酶，它能减轻缺血缺氧时脂质过氧化的损伤。
关于NO在脑缺血损伤时脑组织中的生物作用，目前有许多观点，有学者发现缺血性脑损伤早期NO突然升高，并且NO能增加缺血区局部脑血流量，就其机理如何有待进一步探索 [8] 。Bwisson等 [9] 发现脑缺血后局部兴奋性氨基酸剧增，激活NMDA受体，Ca 2+ 内流，NO过量产生导致神 经元凋亡。Nagafuji [10] 报道给大鼠腹腔内注射L-NMA(NOS抑制剂)能明显改善大鼠局灶脑缺血区脑水肿，并缩小其缺血区范围，说明NO对局灶脑缺血区脑细胞有毒性作用，扩大缺血灶，加重脑水肿。也有研究发现脑缺血时脑中的NO含量增加，刺激前列腺素E 2 合成增加，前列腺素E 2 可加重自由基致水肿的作用 [11] 。
, 百拇医药
由此可见测定脑组织中MDA、NO含量及SOD、CAT活性高低是评价脑组织损伤和药物疗效的重要指标。
川芎与天麻是两种常用于治疗中风、眩晕的中草药。现代研究认为二者分别具有改善神经功能，抗脂质过氧化，解除血管平滑肌痉挛，抗炎，改善学习记忆等功能 [12～14] 。本实验显示川芎天麻液能明显改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能，减轻其脑水肿，明显抑制其脑组织中MDA、NO含量的升高并增强SOD、CAT活性，说明川芎天麻液对脑缺血损伤具有神经保护作用。其作用机制可能是通过增加SOD、CAT含量，清除大量自由基，抑制兴奋性毒性，减轻脑缺血缺氧时脂质过氧化的损伤，通过降低NO含量而减轻脑水肿，阻断损伤级联反应的兴奋性毒性等环节而起到防止细胞死亡的作用，但是，川芎和天麻合用的药物之间相互作用机理如何，尚需进一步研究，以便更好地开发应用于临床。
参考文献
1 Beal MF.Mechanism of excitoxicity in neurologic disease.FASEB J，1992，6:3338-3344.
, http://www.100md.com
2 Choi DW.Ischemia-induced neuronal apoptosis.Curr opin Neurobiol，1996，6:667-672.
3 Hellenbeck JM.Background Review and current concepts of Reperfusion injury.Arch Newrol，1990，47:1245-1254.
4 Zea Longa E，Weinstein RP，Carson，et al.Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20:84-97.
5 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat Middle Cerebral Artery Occlusion:Evaluation of the model and Development of a neurologic Examination.Stroke，1986，17:473-476.
, 百拇医药
6 徐叔云.药理实验方法学.第二版.北京:人民卫生出版社，1991，124.
7 Gao W.Oxygen free radical involvement in ischemia and reperfusion injury to brain.Newrosci lett，1988，88:233-238.
8 Iadecola c.Nitric oxide synthase inhibition and cerebrovascuhar regulation.J cereb Blood flow and Metab，1994，14:175-192.
9 Bwisson A.Mechanisms involved in the neuroprotective activity of a nitric oxide synthase inhibitior during focal cerebral ischemia.JNewrochem，1993，61:690-696.
, 百拇医药
10 Nagafuji T.Blockade of nitric oxide formation by Nomega-nitro-L-argirine mitcgates ischemic brain edema and subsequent cerebral infarction in rats.Neurosci lett，1992，147:159-162.
11 Nishida A，Emotok，Shimiza M，et al.Brain ischemia decrease phosphatidy Linosirol-phospho lipase D but not phosphatidy Linositol-phoshpolipase in rats.Stroke，1994，251247-1253.
12 雷载权.中药学.第三版.上海:上海科学技术出版社，1999，149，199.
13 戈继业，张振岭.川芎药理作用研究及临床应用进展.中国中西医结合杂志，1994，14:638-640.
14 杨世林，兰进，徐锦堂.天麻的研究进展.中草药，2000，1:31-66.
作者单位:1 117000辽宁省本溪市中心医院
2 111002中国医科大学
(编辑 小川), 百拇医药(张霄峰)
关键词 川芎天麻液 自由基 脑缺血再灌注 脑水肿
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0663-03
Study on protective effects of chuanxiong tianma liquid on
, 百拇医药
cerebral ischemic reperfusion injury of rats Zhang Xiaofeng，Wang Muyi，Wang Yuhua，et al.
The Central Hospital of Benxi，Benxi117000.
【Abstract】 Objective It was proved that Chuanxiong Tianma liquid has therole of neural protection in the cerebral ischemia by examining.Methods We madethe model of middle cerebral artery occlusion by inserting thread into middle cerebral artery，and then examine the rat’s neural function，the water rate of cerebral tissue and the content of SOD，CAT，MAD and NO in the cerebral tissue.Results Chuanxiong Tianma liquid could improve the rat’s neural function when therat injuried ischemia-reperfusion，could reduce hydrocephalus，and could reduce
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the content of MDA and NO in the cerebral tissue，at the same time it could increase the activity of SOD and CAT in the cerebral tissue.Conclusion Chuanxiong Tianma liquid can improve the neural function of the cerebral ischemia-reperfusion injury and can reduces hydrocephalus.
Key words Chuanxiong Tianma liquid free radical formation cerebral ischemia-reperfusion hydrocephalus
近年来对缺血性脑损伤的病理生理机制提出了一种新的理论，即损伤级联反应 [1](cascade of damage)，它包括兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和程序性细胞死亡四种机制。当脑缺血缺氧时，某些酶导致自由基的产生，损害细胞并进一步去极化释放钾，引起梗死周围的去极化。氧自由基和其他信使激活炎症细胞因子和酶，产生炎症反应，而炎症反应又产生自由基，导致恶性循环。氧自由基损伤DNA，导致细胞凋亡 [2] 。有实验报道超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)具有清除自由基的作用 [3] 。丙二醛(MDA)是自由基引起脂质过氧化的最终产物。一氧化氮(NO)在脑组织中过度产生具有细胞毒性作用。因此清除自由基在缺血性脑损伤治疗中起着关键性的作用。
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1 材料与方法
1.1 材料 川芎天麻液(每100ml液体中含生药川芎、天麻各10g，批号:20000905)由本溪市中心医院制剂室提供，尼莫地平(四川珍珠制药厂，20mg/片，批号:20000218)购于辽宁省中卫医药公司。CAT检测试剂盒购自:南京建成生物工程研究所，MDA、SOD、NO试剂由中国医科大学公共卫生学院实验室提供。所用动物为Wistar大鼠，体重为(240±40)g，由中国医科大学动物实验室提供。
1.2 方法 取72只大鼠，随机将大鼠分为四组，即假手术组12只、模型组20只、尼莫地平组20只、川芎天麻组20只，假手术组不给药，模型组、尼莫地平组、川芎天麻组分别灌胃给予生理盐水10ml/kg，尼莫地平100mg/kg、川芎天麻液10ml/kg，连续给药21天，末次给药后40min行脑缺血再灌术。动物模型制作采用Longa [4] 的插线法制作脑缺血再灌注模型。神经功能评分采用Longa和Bederson [5] 的5分制评分法。脑组织含水率采用Elliotte公式计算脑组织含水率 [6] (含水率=湿重-干重/湿重×100%)。假手术组6只、模型组8只、尼莫地平组8只、川芎天麻组6只，取脑匀浆上清液后进行总蛋白、MDA、SOD、CAT、NO测定，MDA检测采用硫代巴比妥法，SOD检测采用羟胺法，CAT检测采用紫外分光法，NO检测采用镉还原比色法，总蛋白测定采用双缩脲法。采用方差齐性检验及t检验进行统计学分析。
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2 结果
2.1 各组大鼠的神经功能评分 经过对模型组、尼莫地平组、川芎天麻组大鼠神经功能评分，可见尼莫地平组和川芎天麻组大鼠的神经功能优于模型组，见表1。
表1 神经功能评分统计表 (略)
2.2 各组大鼠脑组织含水率的测定 每组随机选取6只大 鼠测定脑组织含水率，由表2可见尼莫地平组和川芎天麻液组大鼠的含水率明显少于模型组，而川芎天麻液组的大鼠脑含水率少于尼莫地平组，见表2。
2.3 各组大鼠脑组织各项生化指标检测 见表3，与假手术组比较，模型组大鼠MDA、NO含量明显升高，SOD、CAT活性明显降低，表明脑缺血再灌注使脑内脂质过氧化明显增强，与模型组比较，川芎天麻组与尼莫地平组不同程度地降低脑内的MDA、NO的含量，同时还提高SOD、CAT的活性。
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表2 各组大鼠脑组织含水率 (略)
表3 各组大鼠脑组织中MDA、NO、SOD、CAT含量变化 (略)
3 讨论
缺血性脑损伤是神经系统中发病率最高的一种疾病，对其发病机制的研究有许多假说，目前提出一种新的病理生理机制-损伤级联反应 [1] 。它主要包括兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和程序性细胞死亡四种机制。它们都由脑缺血引发，发生在四个不同时间点，但有重叠并互相联系。因此，对此病的治疗与存在许多用药环节和用药时机问题，阻断任何一个环节都可以防止损伤级联反应的进一步发展，本实验就是通过应用川芎天麻液治疗大鼠缺血性再灌注脑损伤观察其在清除自由基、抗脂质过氧化、抗炎、减轻脑水肿方面起到神经保护作用。
脑缺血缺氧后血液再灌注过程，可以触发自由基的连锁增强反应，产生大量的氧自由基和羟自由基，攻击膜蛋白质，核酸及生物膜上的不饱和脂肪酸而造成细胞损伤 [3] 。因此缺血缺氧是以生物膜上的脂质过氧化为标志的，也有学者发现脑缺血后血流量重建时脑组织损害加重，推测脂质过氧化发生在灌流期 [7] 。
, 百拇医药
由于自由基参与了脂质过氧化过程，因此清除自由基，对于减轻脑损伤，阻断兴奋性毒性等环节，防止损伤级联反应有着十分重要的意义。而SOD、CAT就是两种能有效清除体内单线态氧(′O 2 )、超氧阴离子(O 2 ·- )、羟自由基(-OH)等多种自由基的抗氧化酶，它能减轻缺血缺氧时脂质过氧化的损伤。
关于NO在脑缺血损伤时脑组织中的生物作用，目前有许多观点，有学者发现缺血性脑损伤早期NO突然升高，并且NO能增加缺血区局部脑血流量，就其机理如何有待进一步探索 [8] 。Bwisson等 [9] 发现脑缺血后局部兴奋性氨基酸剧增，激活NMDA受体，Ca 2+ 内流，NO过量产生导致神 经元凋亡。Nagafuji [10] 报道给大鼠腹腔内注射L-NMA(NOS抑制剂)能明显改善大鼠局灶脑缺血区脑水肿，并缩小其缺血区范围，说明NO对局灶脑缺血区脑细胞有毒性作用，扩大缺血灶，加重脑水肿。也有研究发现脑缺血时脑中的NO含量增加，刺激前列腺素E 2 合成增加，前列腺素E 2 可加重自由基致水肿的作用 [11] 。
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由此可见测定脑组织中MDA、NO含量及SOD、CAT活性高低是评价脑组织损伤和药物疗效的重要指标。
川芎与天麻是两种常用于治疗中风、眩晕的中草药。现代研究认为二者分别具有改善神经功能，抗脂质过氧化，解除血管平滑肌痉挛，抗炎，改善学习记忆等功能 [12～14] 。本实验显示川芎天麻液能明显改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能，减轻其脑水肿，明显抑制其脑组织中MDA、NO含量的升高并增强SOD、CAT活性，说明川芎天麻液对脑缺血损伤具有神经保护作用。其作用机制可能是通过增加SOD、CAT含量，清除大量自由基，抑制兴奋性毒性，减轻脑缺血缺氧时脂质过氧化的损伤，通过降低NO含量而减轻脑水肿，阻断损伤级联反应的兴奋性毒性等环节而起到防止细胞死亡的作用，但是，川芎和天麻合用的药物之间相互作用机理如何，尚需进一步研究，以便更好地开发应用于临床。
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6 徐叔云.药理实验方法学.第二版.北京:人民卫生出版社，1991，124.
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, 百拇医药
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12 雷载权.中药学.第三版.上海:上海科学技术出版社，1999，149，199.
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14 杨世林，兰进，徐锦堂.天麻的研究进展.中草药，2000，1:31-66.
作者单位:1 117000辽宁省本溪市中心医院
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(编辑 小川), 百拇医药(张霄峰)