p16基因变异与胰腺癌发生发展的相关性研究
【摘要】 目的 探讨p16基因变异在胰腺癌的发生、增殖、分化、侵袭以及转移进程中的意义。方法 应用免疫组织化学法检测p16基因在34例胰腺癌、5例胰腺囊腺瘤、5例胰腺囊肿和2例正常胰腺组织中的表达水平，将结果与患者的临床病理学资料进行统计学分析。结果 胰腺癌中的p16阳性表达水平(64.7%)明显低于正常胰腺组织和胰腺良性病变(100%)(P<0.05);有淋巴结转移的胰腺癌p16表达水平明显低于无淋巴结转移的胰腺癌(P<0.05);随TNM分期增高，p16表达阳性率降低(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示p16表达阳性者生存期明显延长(P<0.05);Cox回归分析显示p16表达阳性者生存期明显延长(P<0.05)。结论 研究结果提示p16基因与胰腺癌的发生、发展密切相关，可能是胰腺癌形成的晚发分子事件，并且可作为判断胰腺癌恶性和侵袭程度的重要指标。
关键词 胰腺癌 p16 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)11-0980-03
, http://www.100md.com
Correlation of p16with the progression of primary pancreatic carcinoma
Zhang Yuanchun，Hua Zhan，Zhang Zhensheng.
General surgery，China-Japan Friendship Hospital，Beijing100029.
【Abstract】 Objective The purpose of this study was to investigate the role of p16alterations in the progresˉsion of growth，proliferation，differentiation，invasion and metastasis of human primary pancreatic carcinoma.Methods We studied the immunohistochemical marker p16in34adenocarcinomas and12nonmalignant specimens of the panˉcreas.The12nonmalignant specimens of the pancreas included5cystadenomas，5non-neoplastic cysts and2normal pancreatic tissues.The relationship between DPC4alterations and various clinicopathological parameters was evaluated by statistics.Results There was a significant difference between normal pancreatic tissues and benign pancreatic leˉsions and primary pancreatic carcinomas for frequency of p16expression(P<0.05).p16expression was greater in priˉmary pancreatic carcinomas with lymph node-negative than with lymph node-positive(P<0.05).Followed in TNM staging，the levels of p16expression ws significantly decreased(P<0.05).Survival analysis showed that the patients with p16expression were longer than those with loss of p16expression(P<0.05).Conclusion This study suggested that the loss of p16expression play an important role in pancreatic carcinogenisis.DPC4is involved in the development of pancreatic carcinomas and is alate event pancreatic carcinomas，and could serve as excellent prognostic marker.
, 百拇医药
Key words pancreatic carcinoma p16 immunohistochemistry
胰腺癌为临床常见的、严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率近几年呈明显上升趋势，死亡人数也在上升 [1]。世界范围的综合资料显示胰腺癌5年生存率仅为5.0%，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来的研究证实，包括胰腺癌在内的许多肿瘤均有p16基因失活，本研究拟应用免疫组织化学法对p16基因在胰腺癌组织中的表达水平进行研究，以评价其在胰腺癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料来源 34例胰腺癌标本均系中日友好医院病理科存档蜡块，为1984～2000年间住院病人手术获得。其中男22例、占64.7%，女12例、占35.3%;年龄30～75岁，平均55.18±11.29岁。所有病例均有完整的临床病理资料，全部病例均做信件或电话随访，有效随访28例。病理组织学分级参照Kl⒐ppel的分级标准 [2] ，临床病理分期以临床检查结合术后病理检测的肿瘤原发灶及淋巴结转移情况为依据，按照国际抗癌联盟(UICC)联合制定的TNM分期方案进行 [3] 。另外收集5例胰腺囊肿瘤、5例胰腺囊肿、2例正常胰腺组织标本作为对照。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色法 所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。免疫组化采用SP法。主要试剂为鼠抗人p16蛋白单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)和SP免疫组化试剂盒(北京中山生物技术公司产品)。每组染色均以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。p16蛋白阳性表达以细胞核内出现明显的棕黄色颗粒，而不管是否有胞浆着色为判断标准。染色判定:在高倍镜下对细胞核内反应如下评分:(1)无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3;(2)阳性范围:<5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，>75%为4。两者结果相加≤2为阴性，>2为阳性。周边的基质细胞阳性染色作为内部对照。
1.3 统计学分析方法 各分组间表达阳性率的比较采用X 2 检验或Fisher精确概率法;生存期统计分析采用单因素Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 p16在胰腺癌及胰腺正常组织和良性病变中的表达 见表1。胰腺癌中的p16阳性表达水平(64.7%)明显低于正常胰腺组织和胰腺良性病变(100%)(P<0.05)。
表1 p16在胰腺癌及胰腺正常/良性病变组织中的表达(略)
2.2 p16在胰腺癌中的表达水平与各临床病理指标的关系 见表2。有淋巴结转移的胰腺癌p16表达水平明显低于无淋巴结转移的胰腺癌(P<0.05);随TNM分期增高，p16表达阳性率降低(Ⅰ期100%;Ⅱ期72.7%，Ⅲ期54.5%，Ⅳ期20.0%)，经X 2 检验4组差异有显著性(P<0.05)。
表2 胰腺癌中p16表达与各临床病理指标的关系(略)
2.3 生存期分析 Kaplan-Meier分析(应用log-rank检验)显示p16表达阳性(P<0.05)者生存期明显延长(见图1)。以随访结果与年龄、性别、病理类型、分化程度、肿瘤部 位、肿瘤大小、淋巴结转移和p16表达对生存期进行Cox回归分析。结果显示肿物≤4.5cm(P<0.01)和p16表达阳性(P<0.05)者生存期明显延长(见表3)。
, 百拇医药
表3 胰腺癌的生存期分析(略)
3 讨论
p16基因是一个肿瘤抑制基因，编码一个16kD的蛋白质，此蛋白产物具有生长抑制作用，是一种CDK4的抑制因子，能抑制细胞从G 1 →S期。p16既是细胞周期有效调控者，又是抑制肿瘤生长的关键因子，并且在多种类型恶性肿瘤中发现有基因缺失或突变，因而被认为是一个颇具前途的抑癌基因 [4] 。本研究表明，在胰腺癌中p16基因的阳性表达率(64.7%)显著低于正常胰腺组织和胰腺良性病变(100%)，表明p16基因的表达缺失与胰腺癌的发生有密切关系。
已有研究发现 [5，6] ，p16基因的异常是胰腺良性病变向胰腺癌发生恶性转变过程中的高危险因素之一，特别是使p16基因启动因子失活的甲基化所引起的突变，可能是引起恶变的高危险的始动因素之一。如果p16基因发生突变或缺失，势必会产生无活性p16蛋白或p16蛋白产物缺乏，这样就解除了对CDK4、cyclinD复合物的抑制，使其充分发挥抑制Rb蛋白的功能，G 1 关卡出现异常，细胞获得无限增殖能力，然后进入无调控的增值周期，最终导致肿瘤的发生。
, 百拇医药
本研究表明，有淋巴结转移的胰腺癌p16基因阳性表达率明显低于无淋巴结转移者，这提示p16基因表达缺失与胰腺癌的浸润和转移有密切关系。随TNM分期增高，p16基因阳性表达率显著降低，并且在低分化胰腺癌中p16基因的阳性表达率更低。生存期分析显示，p16是胰腺癌的一项独立预后因素，p16表达缺失预示病人预后差。以上结果均提示p16基因失活可能是胰腺癌发生的晚发事件，并且与胰腺癌恶性程度有明显相关性。
对恶性黑色素瘤组织中的p16蛋白的研究发现，p16蛋白的表达缺失与黑色素瘤恶性转变的早期始动阶段无关，但可能对浸润性癌和转移性癌的发展提供了某种选择性的生长优势，并因此而决定了肿瘤的发展方向 [7] 。其机制可能与p16对微管的解聚作用有关。研究表明，p16的这种作用可调节细胞运动，p16基因表达缺失可致细胞调节功能紊乱，导致肿瘤细胞浸润 [8] 。
以上结果表明，p16表达缺失与胰腺癌的生物学行为极为密切，与胰腺癌的发生发展密切相关，可以作为判断胰腺癌恶性和侵袭程度的重要指标。另外，由于p16基因本身的一些特点，如有专一的作用靶点CDK4，使之可成为一较理想的基因药物的研究对象。因此，对p16基因与胰腺癌关系的深入理解，必将会为将来胰腺癌的早期诊断和治疗提供新的方法和思路。(注:本文图略)
, 百拇医药
参考文献
1 Bramhall SR，Allum WH，Jones AG，et al.Treatment and survival in13560patients with pancreatic cancer，and incidence of the disease，in the West Midlands:an epidemiological study.Br J Surg，1995，82(1):111-115.
2 Kl⒐ppel G.Pancreatic non-endocrine tumors.In:G.Kl⒐ppel(ed.).pancreaticpathology.pp.79，Edinburg，Scotland:Churchill Livingstone，1984，98.
3 Hermanek P，Sobin LH.UICC TNM classification of malignant tumors.4th edition.2nd revision.Berlin:Springer-Verlang，1992:71.
, 百拇医药
4 Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cyclecontrol causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature，1993，366 (6456):704-707.
5 C.A.Moskaluk，Ralph H，Scott E，et al.p16and K-ras Gene Mutaˉtions in the Intraductal Precursors of Human Pancreatic Adenocarcinoˉma.Cancer Res，1997，57，2140-2143.
6 Gerdes B，Ramaswamy A，Kersting M，et al.p16INK4a alterations in chronicpancreatitis-indicator for high-risk lesions for pancreatic canˉcer.Surgery，2001，129(4):490-497.
, 百拇医药
7 Reed JA，Loganzo F Jr，Shea CR，et al.Loss of expression of the p16/cyclin-dependent kinase inhibitor2tumor suppressor gene in melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression.Cancer Res，1995，55(13):2713-2718.
8 Albertazzi E，Cajone F，Lakshmi MS，et al.Heat shock modulates the exˉpression of the metastasis associated gene MTS1and proliferation of murine and human cancer cells.NA Cell Biol，1998，17(1):1-7.
作者单位:1 100029北京中日友好医院普外科
2 570311海南省人民医院肝胆外科
(编辑 心怡), 百拇医药(张远春)
关键词 胰腺癌 p16 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)11-0980-03
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Correlation of p16with the progression of primary pancreatic carcinoma
Zhang Yuanchun，Hua Zhan，Zhang Zhensheng.
General surgery，China-Japan Friendship Hospital，Beijing100029.
【Abstract】 Objective The purpose of this study was to investigate the role of p16alterations in the progresˉsion of growth，proliferation，differentiation，invasion and metastasis of human primary pancreatic carcinoma.Methods We studied the immunohistochemical marker p16in34adenocarcinomas and12nonmalignant specimens of the panˉcreas.The12nonmalignant specimens of the pancreas included5cystadenomas，5non-neoplastic cysts and2normal pancreatic tissues.The relationship between DPC4alterations and various clinicopathological parameters was evaluated by statistics.Results There was a significant difference between normal pancreatic tissues and benign pancreatic leˉsions and primary pancreatic carcinomas for frequency of p16expression(P<0.05).p16expression was greater in priˉmary pancreatic carcinomas with lymph node-negative than with lymph node-positive(P<0.05).Followed in TNM staging，the levels of p16expression ws significantly decreased(P<0.05).Survival analysis showed that the patients with p16expression were longer than those with loss of p16expression(P<0.05).Conclusion This study suggested that the loss of p16expression play an important role in pancreatic carcinogenisis.DPC4is involved in the development of pancreatic carcinomas and is alate event pancreatic carcinomas，and could serve as excellent prognostic marker.
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Key words pancreatic carcinoma p16 immunohistochemistry
胰腺癌为临床常见的、严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率近几年呈明显上升趋势，死亡人数也在上升 [1]。世界范围的综合资料显示胰腺癌5年生存率仅为5.0%，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来的研究证实，包括胰腺癌在内的许多肿瘤均有p16基因失活，本研究拟应用免疫组织化学法对p16基因在胰腺癌组织中的表达水平进行研究，以评价其在胰腺癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料来源 34例胰腺癌标本均系中日友好医院病理科存档蜡块，为1984～2000年间住院病人手术获得。其中男22例、占64.7%，女12例、占35.3%;年龄30～75岁，平均55.18±11.29岁。所有病例均有完整的临床病理资料，全部病例均做信件或电话随访，有效随访28例。病理组织学分级参照Kl⒐ppel的分级标准 [2] ，临床病理分期以临床检查结合术后病理检测的肿瘤原发灶及淋巴结转移情况为依据，按照国际抗癌联盟(UICC)联合制定的TNM分期方案进行 [3] 。另外收集5例胰腺囊肿瘤、5例胰腺囊肿、2例正常胰腺组织标本作为对照。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色法 所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。免疫组化采用SP法。主要试剂为鼠抗人p16蛋白单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)和SP免疫组化试剂盒(北京中山生物技术公司产品)。每组染色均以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。p16蛋白阳性表达以细胞核内出现明显的棕黄色颗粒，而不管是否有胞浆着色为判断标准。染色判定:在高倍镜下对细胞核内反应如下评分:(1)无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3;(2)阳性范围:<5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，>75%为4。两者结果相加≤2为阴性，>2为阳性。周边的基质细胞阳性染色作为内部对照。
1.3 统计学分析方法 各分组间表达阳性率的比较采用X 2 检验或Fisher精确概率法;生存期统计分析采用单因素Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析。
2 结果
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2.1 p16在胰腺癌及胰腺正常组织和良性病变中的表达 见表1。胰腺癌中的p16阳性表达水平(64.7%)明显低于正常胰腺组织和胰腺良性病变(100%)(P<0.05)。
表1 p16在胰腺癌及胰腺正常/良性病变组织中的表达(略)
2.2 p16在胰腺癌中的表达水平与各临床病理指标的关系 见表2。有淋巴结转移的胰腺癌p16表达水平明显低于无淋巴结转移的胰腺癌(P<0.05);随TNM分期增高，p16表达阳性率降低(Ⅰ期100%;Ⅱ期72.7%，Ⅲ期54.5%，Ⅳ期20.0%)，经X 2 检验4组差异有显著性(P<0.05)。
表2 胰腺癌中p16表达与各临床病理指标的关系(略)
2.3 生存期分析 Kaplan-Meier分析(应用log-rank检验)显示p16表达阳性(P<0.05)者生存期明显延长(见图1)。以随访结果与年龄、性别、病理类型、分化程度、肿瘤部 位、肿瘤大小、淋巴结转移和p16表达对生存期进行Cox回归分析。结果显示肿物≤4.5cm(P<0.01)和p16表达阳性(P<0.05)者生存期明显延长(见表3)。
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表3 胰腺癌的生存期分析(略)
3 讨论
p16基因是一个肿瘤抑制基因，编码一个16kD的蛋白质，此蛋白产物具有生长抑制作用，是一种CDK4的抑制因子，能抑制细胞从G 1 →S期。p16既是细胞周期有效调控者，又是抑制肿瘤生长的关键因子，并且在多种类型恶性肿瘤中发现有基因缺失或突变，因而被认为是一个颇具前途的抑癌基因 [4] 。本研究表明，在胰腺癌中p16基因的阳性表达率(64.7%)显著低于正常胰腺组织和胰腺良性病变(100%)，表明p16基因的表达缺失与胰腺癌的发生有密切关系。
已有研究发现 [5，6] ，p16基因的异常是胰腺良性病变向胰腺癌发生恶性转变过程中的高危险因素之一，特别是使p16基因启动因子失活的甲基化所引起的突变，可能是引起恶变的高危险的始动因素之一。如果p16基因发生突变或缺失，势必会产生无活性p16蛋白或p16蛋白产物缺乏，这样就解除了对CDK4、cyclinD复合物的抑制，使其充分发挥抑制Rb蛋白的功能，G 1 关卡出现异常，细胞获得无限增殖能力，然后进入无调控的增值周期，最终导致肿瘤的发生。
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本研究表明，有淋巴结转移的胰腺癌p16基因阳性表达率明显低于无淋巴结转移者，这提示p16基因表达缺失与胰腺癌的浸润和转移有密切关系。随TNM分期增高，p16基因阳性表达率显著降低，并且在低分化胰腺癌中p16基因的阳性表达率更低。生存期分析显示，p16是胰腺癌的一项独立预后因素，p16表达缺失预示病人预后差。以上结果均提示p16基因失活可能是胰腺癌发生的晚发事件，并且与胰腺癌恶性程度有明显相关性。
对恶性黑色素瘤组织中的p16蛋白的研究发现，p16蛋白的表达缺失与黑色素瘤恶性转变的早期始动阶段无关，但可能对浸润性癌和转移性癌的发展提供了某种选择性的生长优势，并因此而决定了肿瘤的发展方向 [7] 。其机制可能与p16对微管的解聚作用有关。研究表明，p16的这种作用可调节细胞运动，p16基因表达缺失可致细胞调节功能紊乱，导致肿瘤细胞浸润 [8] 。
以上结果表明，p16表达缺失与胰腺癌的生物学行为极为密切，与胰腺癌的发生发展密切相关，可以作为判断胰腺癌恶性和侵袭程度的重要指标。另外，由于p16基因本身的一些特点，如有专一的作用靶点CDK4，使之可成为一较理想的基因药物的研究对象。因此，对p16基因与胰腺癌关系的深入理解，必将会为将来胰腺癌的早期诊断和治疗提供新的方法和思路。(注:本文图略)
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参考文献
1 Bramhall SR，Allum WH，Jones AG，et al.Treatment and survival in13560patients with pancreatic cancer，and incidence of the disease，in the West Midlands:an epidemiological study.Br J Surg，1995，82(1):111-115.
2 Kl⒐ppel G.Pancreatic non-endocrine tumors.In:G.Kl⒐ppel(ed.).pancreaticpathology.pp.79，Edinburg，Scotland:Churchill Livingstone，1984，98.
3 Hermanek P，Sobin LH.UICC TNM classification of malignant tumors.4th edition.2nd revision.Berlin:Springer-Verlang，1992:71.
, 百拇医药
4 Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cyclecontrol causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature，1993，366 (6456):704-707.
5 C.A.Moskaluk，Ralph H，Scott E，et al.p16and K-ras Gene Mutaˉtions in the Intraductal Precursors of Human Pancreatic Adenocarcinoˉma.Cancer Res，1997，57，2140-2143.
6 Gerdes B，Ramaswamy A，Kersting M，et al.p16INK4a alterations in chronicpancreatitis-indicator for high-risk lesions for pancreatic canˉcer.Surgery，2001，129(4):490-497.
, 百拇医药
7 Reed JA，Loganzo F Jr，Shea CR，et al.Loss of expression of the p16/cyclin-dependent kinase inhibitor2tumor suppressor gene in melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression.Cancer Res，1995，55(13):2713-2718.
8 Albertazzi E，Cajone F，Lakshmi MS，et al.Heat shock modulates the exˉpression of the metastasis associated gene MTS1and proliferation of murine and human cancer cells.NA Cell Biol，1998，17(1):1-7.
作者单位:1 100029北京中日友好医院普外科
2 570311海南省人民医院肝胆外科
(编辑 心怡), 百拇医药(张远春)