人卵母细胞体外成熟培养研究现状
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)10-0892-03
人卵母细胞在胚胎第8周时就开始了第一次减数分裂，出生时初级卵母细胞已经过第一次减数分裂前期，处于前期和中期之间的静止期(核网期)，并长期停留在此阶段，直至青春期在适当的激素环境下，引发原来静止的减数分裂重新恢复，才开始分批分期完成第一次减数分裂，产生成熟的卵母细胞和第一极体，此过程称为卵母细胞成熟。1935年，Pincus和Enzman [1] 观察到将兔卵母细胞从卵泡中移出后，卵母细胞可在体外自发地排出第一极体，生殖工程由此开辟了一个新的研究领域———卵母细胞的体外成熟(In-vitro Maturation，IVM)培养。卵母细胞的体外成熟是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养，达到次级卵母细胞(MⅡ)，能够正常受精、发育和着床，包括完整的卵泡培养 [2] 和单纯的卵丘复合体培养。目前应用于辅助生殖技术的主要限于后者。严格意义上的IVM是从未经促排卵刺激的卵巢取得的卵子在体外成熟。
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1 卵母细胞的体外成熟过程
1.1 IVM主要包括细胞浆及细胞核的成熟 细胞核的成熟是指第一次减数分裂的重新启动及完成，即生殖泡(Gerˉminal Vesical，GV)期的活化，当雌性哺乳动物性成熟后，在垂体促性腺激素刺激下，卵泡开始发育。血清黄体生成素(LH)峰出现前，卵母细胞减数分裂仍停留在第一次减数分裂GV期;血清LH峰出现后，生殖泡破裂(Germinal Vesical Breakdown，GVBD)活化，表现为核膜崩解，染色质凝聚。24h或48h后，卵母细胞从卵泡中排出，并分裂成次级卵母细胞和第一极体，进入MⅡ期。而细胞浆的成熟则是一系列蛋白质的合成过程。体外成熟时，生殖泡破裂前后细胞质内合成大量蛋白质，它们对卵母细胞自身成熟有极其重要的作用，其中最为显著是激活成熟促进因子(MPF)和细胞生长抑制因子(CSF)的活性。MPF直接催化一些与细胞分裂有关的蛋白质磷酸化，促使细胞由间期向M期转化，而CSF则促进和维持MPF活性的充分表现，使细胞维系在M期状态。实验证明，牛卵母细胞成熟培养其中加入蛋白合成抑制剂，如亚胺环己酮、嘌呤霉素均可阻止GVBD的发生。这些合成的蛋白还与卵母细胞受精后的发育能力有关。
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1.2 卵泡刺激素(FSH)的应用 Veek [3] 等从44个超排卵周期中获取了74个人卵母细胞，将其中未成熟的卵母细胞置于含15%的胎儿脐带血清(FCS)的Ham’F-10中培养22～35h后授精，44个胚胎发育。移植给30例病人，8例妊娠，2例分娩出正常的婴儿。这是卵母细胞体外成熟培养技术临床应用的世界首例报道。但是由于该研究中的不成熟卵母细胞来源于促超排卵，因此并非纯粹意义上体外成熟培养。此后，许多研究者的工作与Veek的相似，均是从促超排卵后获取不成熟卵母细胞并进行短暂的体外培养，促其成熟。直至1991年，Cha [4] 等才开始真正意义的不成熟卵母细胞体外成熟培养的临床应用研究。他们从因良性病变而被切除的23个卵巢标本中回收了274个不成熟卵母细胞，分别培养于含50%灭活的人卵泡液或15%FCS的Ham’F-10液中，成熟率分别为55.8%与35.7%。最后产生的5个胚胎移植入一例卵巢早衰的病人，成功妊娠并娩出三胞胎女婴;Wynm [5] 做了17例应用FSH和9例不用FSH的患者，发现平均获卵数、成熟率和得到的MⅡ期卵子都有显著差异，分别为67%和51%，71.1%和43.5%，48和21个。说明短时间应用FSH可以提高获卵率以及卵子发育能力，达到MⅡ期。在卵泡生长期给予足够量的FSH，才能使卵泡不发生闭锁，卵子获得充足的减数分裂能力。在未成熟卵的培养过程中发现应用FSH的卵丘复合体细胞的数量几乎是没有应用FSH的两倍，这是一个非常有利的因素，可以更积极地合成成熟促进因子、激素和能量物质，以及促进有毒物质的代谢。1994年，Trounson [6] 等研究了多囊卵巢综合征病人的不成熟卵母细胞体外成熟和受精发育的能力，发现经过加入含卵泡刺激素(FSH)及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的培养基培养后，81%不成熟卵母细胞在48～54h发育至MⅡ期，体外受精(IVF)的受精率为34%，56%受精卵卵裂至8个细胞或更多细胞。同时，将部分胚胎移植给其中一未排卵的多囊卵巢综合征的病人，获足月妊娠并分娩一正常婴儿。认为，来源于多囊卵巢综合征病人的不成熟卵母细胞也能体外成熟。
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2 影响卵母细胞体外成熟培养的因素
人不成熟卵母细胞IVM培养实验研究中，成熟率和受精率都不理想，胚胎移植后妊娠率则更低。
2.1 IVM成熟率 (1)部分卵母细胞体外培养后未获得完全成熟的能力。有人认为人类未受外源性的促性腺激素刺激的卵母细胞体外成熟率达到30%～50%，而经人绝经期促性腺激素(HMG)/hCG方案诱导排卵而获取的卵母细胞达到MⅡ近90%。推测卵母细胞成熟能力的获得可能与促性腺激素的刺激作用有关，具体机制不详;(2)不成熟卵母细胞在体外环境中退化。有人观察到在自然月经周期的第7～10天收集的不成熟卵母细胞，3/4已出现退化征象，这部分卵母细胞已不能回复到成熟的轨道上来，影响体外成熟率;(3)随着年龄的增长，卵巢中氧自由基逐渐积聚，对处于第一次减数分裂静止期的卵母细胞影响很大，在这段时间内，氧自由基能降低卵母细胞活性，降低不成熟卵母细胞的体外成熟率。
2.2 体外培养成熟的卵母细胞体外受精率低、胚胎发育潜能低
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2.2.1 透明带硬化 以前在啮齿类动物的研究发现，卵子在无血清培养基进行体外成熟易形成透明带硬化，精子的穿透受阻以致受精失败。透明带硬化的原因认为是体外培养过程中放射冠细胞胞外分泌一种蛋白酶催化造成的。Futuin是血清中的一种α胰蛋白酶抑制因子，有与其浓度相关的抑制透明带硬化的作用 [7，8] 。ICSI技术发展后，研究者运用该项技术解决了这个问题。IVM卵母细胞用传统IVM技术的受精率为45%，而采用ICSI技术的受精率为90%。
2.2.2 精原核和卵原核形成不同步 主要是精原核形成落后引起。这与卵母细胞细胞质不完全成熟有关。IVM包括胞质的成熟和胞核的成熟，Smith [9] 等的研究发现，尽管在IVM中，胞核能正常成熟，但明显缺乏胞质的成熟，胞质的成熟包括卵胞浆内微管的发育、膜表面表达精子膜融合蛋白受体、胞质获得使精子染色质解释以及指导受精卵蛋白质合成的能力等，与卵母细胞合成与胞质成熟相关蛋白的能力有关，如中期促进因子。中期促进因子的活性低，周期素和其它控制细胞周期的物质的缺乏将引起卵裂的阻滞。而胞质的不完全成熟也影响了受精卵的进一步卵裂。
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2.3 不能获得足够数量的不成熟卵母细胞而导致可供移植的胚胎数目及质量下降也是一个重要原因 与体内成熟的卵母细胞相比，来源于体外培养成熟的卵母细胞，其胚胎发育相对较差，因此获取一定数量的不成熟卵母细胞对于提高IVM的成功率具有特别重要的意义。研究证实，从PCOS患者获取的不成熟卵母细胞比非PCOS明显增加，目前IVM多以PCOS或多囊卵巢患者为研究对象。至于在获取不成熟卵母细胞前是否需要进行促性腺激素刺激一直存在争议。研究结果显示，小剂量FSH能够有效地提高卵母细胞获取率和受精率。提示在避免引起卵巢过度刺激综合征的同时，小剂量FSH刺激可能有利于形成一批大小比较均匀的卵泡，增加不成熟卵母细胞的获取率，从而为进行下一步的体外成熟提供了比较充足的卵母细胞来源 [10] 。
2.4 ET后妊娠率低 (1)胚胎的发育和子宫内膜的发育不同步。多数学者认为在短期使用少量雌激素准备内膜，可提高妊娠率;(2)随着年龄的增长，配子非整倍体发生率增加和氧自由基的大量积聚，势必影响胚胎的活性，使胚胎在移植子宫后发育阻滞;(3)发生染色体退化的卵母细胞虽具有受精和卵裂的潜能，但形成的胚胎不能着床或虽着床而仅表现为生化妊娠(即β-hCG短暂升高)。当然，导致卵母细胞体外成熟率低、受精率不高、胚胎移植后妊娠率更低的原因还有其它方面，需要进一步深入实验分析。
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3 IVM取卵的方式和时机
IVM发展到现在，收集的不成熟卵母细胞大多是来自窦卵泡。其中的不成熟卵母细胞有GV或MI期。收集这些来自窦卵泡的不成熟卵的方式大致有两种:体内和体外取卵。体内取卵可借助于腹腔镜或经阴道超声引导下进行卵泡穿刺取卵，前者在经阴道超声引导下卵泡穿刺术未发展起来前，一直是IVM获得卵母细胞的主要方法，也可用于IVM收集不成熟卵母细胞，但由于这种方法造成的创伤大，应用受限;经阴道超声卵泡穿刺术为目前使用最广的IVF取卵方式，也可用来作为获取不成熟卵母细胞的方法。但是，用于IVF取卵的穿刺针斜面过大、针尖过长，因此不适于穿刺不成熟的卵泡。Trounson等改进了穿刺针的形状和穿刺的方式，并有效地应用到IVM取卵;体外取卵就是从离体的卵巢标本取卵，以因良性妇科病变而手术切除的卵巢作为标本来源，在体视显微镜下直视取卵，用无菌的穿刺针在体视镜下穿刺卵泡以获得不成熟卵母细胞。该项技术操作简单，易于掌握，已被广泛采用，其取卵的效果并不亚于经阴道超声引导下穿刺取卵。最近，国内有研究报道， 从IVF-ET治疗周期卵泡液中发现了大量窦前卵泡，IVM培养近28天后，成熟率为38.1%，这一方法的建立增加了研究IVM培养卵母细胞的标本来源，是我国科研人员在生殖领域的重大贡献 [11] 。对于在月经周期何时取卵为最佳时间的问题，一直争论不休。有人认为收集的卵母细胞数量与取卵时间无关;但是考虑到卵母细胞成熟率的问题时，部分学者认为卵泡期收集的卵母细胞体外成熟率要高
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于黄体期收集的卵母细胞，故他们趋向于卵泡期取卵。
4 获取卵母细胞临床方案
4.1 不用促卵泡生长激素刺激 月经过少的患者每日肌注黄体酮20mg，或用阴道黄体酮栓300mg，连用10天后停用，待撤退性出血的第3天做B超，以排除卵巢囊肿。在此后监测主导卵泡的大小，一般在月经的第8～12天，即主导卵泡的直径达10～12mm时肌注hCG10000万U。并在当日开始连续口服戊酸雌二醇6mg调节子宫内膜的生长。卵泡直径>4mm的卵泡都进行穿刺，并冲洗3次。在取卵日开始连续肌注黄体酮40mg，或用阴道黄体酮栓300mg进行黄体支持。
4.2 短时间应用促卵泡生长激素刺激 在月经的第2天用FSH300IU，第4天用150IU，在第6天用150IU。不用hCG，第7天经阴道取卵。在月经的第2，6，12天抽静脉血查FSH，LH，E 2，P，并用B超监测子宫内膜。取卵当日开始连续应用戊酸雌二醇6mg和黄体酮40mg准备子宫
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内膜。
4.3 取卵 所有患者均在使用促性腺激素释放激素激动剂后15天或撤退性出血后第5天，采用小剂量FSH进行刺激，FSH的应用时间一般为5～7天，于FSH刺激后5～8天，或于周期的第11～14天取卵，取卵前17h肌注人绒毛膜促性腺激素10000IU，取卵当天最大卵泡直径不超过10mm。于月经后第3天开始用人类尿促性腺激素(HMG)150IU肌肉注射，共4天，发现双侧卵巢有直径8～10mm卵泡8个，直径4～7mm卵泡6个。给予hCG10000IU。34h后取卵。同时，于注射hCG日开始补充β雌二醇2mg/d，于胚胎移植日加用黄体酮60mg/d肌肉注射 [12] 。
5 IVM培养的时间
从理论上推断，体外培养的时间越长，达到MⅡ期的卵子越多。所以有的生殖中心在体外成熟在36h，有的在44h，有的在48h后拆除颗粒细胞进行ICSI。Mikkelsen [13] 发现缩短IVM的培养时间并不会影响胚胎发育的能力，在体外成熟28h和36h的卵子成熟率、受精率、分裂率和妊娠率没有显著差异。体外成熟的时间过长，反而使卵子失去了最佳的受精时机，出现皮质颗粒的过早释放以及透明带硬化。透明带硬化使得卵子受精和囊胚孵出障碍。而过早的剥离卵丘复合体细胞，使卵子与其间的联系中断，也不利于减数分裂的有效进行。即使与卵丘复合体细胞共培养也达不到理想的效果。
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6 IVM的临床意义
6.1 与IVF、ICSI结合治疗某些不孕症 Barens [14] 等将IVM技术与显微授精技术结合治疗不孕症，获得成功。目前，已有越来越多的IVM结合IVF或卵泡浆内单精子注射(ICSI)技术成功地应用于临床的病例报道。迄今，世界上已有约20～30个采用该技术妊娠的正常婴儿分娩。文献报道，利用体外成熟的卵母细胞受精后胚胎移植以治疗卵巢早衰(POF)。同时，利用IVM+IVF+ET技术提供正常胚胎给患有严重的、明显遗传倾向的遗传病人，作为控制某些遗传病传代的设想也早被人们提出。
6.2 避免IVF严重并发症的产生及IVM优势 如多囊卵巢综合征和有排卵并有大量小卵泡发育的不育症病人，对外源性激素刺激异常敏感，易于产生超刺激反应，引起卵巢过度刺激综合征(OHSS);其次，在诱发的卵泡期中，卵泡产生高雌激素水平和在排卵后引发高雌激素水平，对于乳腺癌、卵巢癌和其它一些依赖性激素的癌症(如黑色素瘤)是个潜在危险因素。因此，有的学者提倡用IVM技术取代药物诱导排卵。因为正常妇女月经周期中，约有10～50个卵泡同时发育，如果能在发育早期获得这些不成熟卵母细胞，进行IVM培养，则可避免药物促超排卵引发的上述危险。可以节省用于募集卵泡的药物费用;重新利用常规IVF中收集的不成熟卵;可以作为研究卵子发生减数分裂异常和非整倍体的模型;为冷冻卵子提供了一条出路，因为冷冻GV期卵子可以避开MⅡ期卵子减数分裂纺垂体的易损伤期。
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6.3 供卵 供卵正被提到生殖工程领域的议事日程上来，但临床医师却苦于供卵来源缺乏。IVM技术解决了这一难题。因良性妇科疾病(如子宫内膜异位症、纤维瘤、子宫肌瘤、宫外孕等)而切除的卵巢组织或因罹患重症疾病如癌症需使用细胞毒药物的年轻未生育女性病人的卵巢组织，均可用作IVF的供卵来源。如果IVM技术和卵母细胞冷冻技术结合则可建立一个和精子库相应的卵子库。
IVM的前景为生殖医学家们所看好。虽然IVM技术还不成熟，还存在诸多的问题，但经过不懈努力必将成为生殖工程领域中一项新兴的技术。它有助于深入了解卵母细胞发育动力学，拓宽了治疗不孕症的思路。
参考文献
1 Pincus G，Enzmann EV.The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro.The activation of ovarian eggs.J Exp Med，1935，62:665.
, http://www.100md.com
2 Newton H，Illingworth P.In vitro growth of murine preantral follicles afˉter isolation from cryopreserved overian tissue.Hum Reprod，2001，16(3):423-429.
3 Veek LL，Wortham JW，Witmyer J，et al.Maturation and fertilization of morphologically immature human oocyts in a program of in vitro fertilizaˉtion.FertiSteril，1983，39:594.
4 Cha KY，KooJJ，Choi DH，et al.Pregnance after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles:their culˉture in vitro and their transfer in a donor oocyte program.Fertil Steril，1991，55:100.
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5 Wynn P，Picton HM，Krapez JA，et al.Pretreatment with follicle stimuˉlating hormone promotes the numbers of human oocytes reaching metaphaseⅡby in vitromaturation.Hum Reprod，1998，13(11):3132-3138.
6 Trounson A，Wood C，Kausche A.In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polyˉcystic ovarian patients.Fertil Steril，1994，62:353.
7 Mikkelsen AL，Smith S，Lindenberg S.Possible factors affecting the deˉvelopment of oocytes in in-vitromaturation.Hum Reprod，2000，15:5.
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8 Barnes FL，Wook CW，Kausche A，et al.Production of embryos from in vitro-maturated primary human oocytes.Fertil Steril，1996，65:1151-1251.
9 Smith GD.In vitro maturation of oocytes.Curr Womens Health Rep，2001，1(12):143-151.
10 Suikkari AM，Tulppala M，Tuuri T，et al.Lutea phase starto flow dose FSH priming of follicles results in an efficient recovery maturation and fertilization of immature human oocytes.Hum Reprod，2000，15(4):747.
, http://www.100md.com
11 Wu J，Zhang L Z，Lin P.A new source of human oocyte:preliminary reˉport on the identification and maturation of human preantral follicle from follicular aspirates.Hum Reprod，1998，13:1638.
12 李媛，陈子江.未成熟卵母细胞体外成熟后体外授精-胚胎移植成功分娩1例.中华男科学，2002，2:70-71.
13 Zheng P，wang H，Bavister BD，et al.Maturation of rhesus monkey oocytes in chemically defined culture media and their functional assessˉment by IVF and embryo development.Hum Reprod，2001，16(2):300-305.
14 Eose Hellekant TA，Libersky Williamson EA，Bavister BD，et al.Enerˉgy substrates and amino acids provided during in vitro maturation of bovine oocytes alter acquisition of developmental competence.Zygote，1998，6(4):285-294.
(收稿日期:2003-06-12)
(编辑 小川), 百拇医药(李蓉 汤惠茹 蔡志明)
人卵母细胞在胚胎第8周时就开始了第一次减数分裂，出生时初级卵母细胞已经过第一次减数分裂前期，处于前期和中期之间的静止期(核网期)，并长期停留在此阶段，直至青春期在适当的激素环境下，引发原来静止的减数分裂重新恢复，才开始分批分期完成第一次减数分裂，产生成熟的卵母细胞和第一极体，此过程称为卵母细胞成熟。1935年，Pincus和Enzman [1] 观察到将兔卵母细胞从卵泡中移出后，卵母细胞可在体外自发地排出第一极体，生殖工程由此开辟了一个新的研究领域———卵母细胞的体外成熟(In-vitro Maturation，IVM)培养。卵母细胞的体外成熟是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养，达到次级卵母细胞(MⅡ)，能够正常受精、发育和着床，包括完整的卵泡培养 [2] 和单纯的卵丘复合体培养。目前应用于辅助生殖技术的主要限于后者。严格意义上的IVM是从未经促排卵刺激的卵巢取得的卵子在体外成熟。
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1 卵母细胞的体外成熟过程
1.1 IVM主要包括细胞浆及细胞核的成熟 细胞核的成熟是指第一次减数分裂的重新启动及完成，即生殖泡(Gerˉminal Vesical，GV)期的活化，当雌性哺乳动物性成熟后，在垂体促性腺激素刺激下，卵泡开始发育。血清黄体生成素(LH)峰出现前，卵母细胞减数分裂仍停留在第一次减数分裂GV期;血清LH峰出现后，生殖泡破裂(Germinal Vesical Breakdown，GVBD)活化，表现为核膜崩解，染色质凝聚。24h或48h后，卵母细胞从卵泡中排出，并分裂成次级卵母细胞和第一极体，进入MⅡ期。而细胞浆的成熟则是一系列蛋白质的合成过程。体外成熟时，生殖泡破裂前后细胞质内合成大量蛋白质，它们对卵母细胞自身成熟有极其重要的作用，其中最为显著是激活成熟促进因子(MPF)和细胞生长抑制因子(CSF)的活性。MPF直接催化一些与细胞分裂有关的蛋白质磷酸化，促使细胞由间期向M期转化，而CSF则促进和维持MPF活性的充分表现，使细胞维系在M期状态。实验证明，牛卵母细胞成熟培养其中加入蛋白合成抑制剂，如亚胺环己酮、嘌呤霉素均可阻止GVBD的发生。这些合成的蛋白还与卵母细胞受精后的发育能力有关。
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1.2 卵泡刺激素(FSH)的应用 Veek [3] 等从44个超排卵周期中获取了74个人卵母细胞，将其中未成熟的卵母细胞置于含15%的胎儿脐带血清(FCS)的Ham’F-10中培养22～35h后授精，44个胚胎发育。移植给30例病人，8例妊娠，2例分娩出正常的婴儿。这是卵母细胞体外成熟培养技术临床应用的世界首例报道。但是由于该研究中的不成熟卵母细胞来源于促超排卵，因此并非纯粹意义上体外成熟培养。此后，许多研究者的工作与Veek的相似，均是从促超排卵后获取不成熟卵母细胞并进行短暂的体外培养，促其成熟。直至1991年，Cha [4] 等才开始真正意义的不成熟卵母细胞体外成熟培养的临床应用研究。他们从因良性病变而被切除的23个卵巢标本中回收了274个不成熟卵母细胞，分别培养于含50%灭活的人卵泡液或15%FCS的Ham’F-10液中，成熟率分别为55.8%与35.7%。最后产生的5个胚胎移植入一例卵巢早衰的病人，成功妊娠并娩出三胞胎女婴;Wynm [5] 做了17例应用FSH和9例不用FSH的患者，发现平均获卵数、成熟率和得到的MⅡ期卵子都有显著差异，分别为67%和51%，71.1%和43.5%，48和21个。说明短时间应用FSH可以提高获卵率以及卵子发育能力，达到MⅡ期。在卵泡生长期给予足够量的FSH，才能使卵泡不发生闭锁，卵子获得充足的减数分裂能力。在未成熟卵的培养过程中发现应用FSH的卵丘复合体细胞的数量几乎是没有应用FSH的两倍，这是一个非常有利的因素，可以更积极地合成成熟促进因子、激素和能量物质，以及促进有毒物质的代谢。1994年，Trounson [6] 等研究了多囊卵巢综合征病人的不成熟卵母细胞体外成熟和受精发育的能力，发现经过加入含卵泡刺激素(FSH)及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的培养基培养后，81%不成熟卵母细胞在48～54h发育至MⅡ期，体外受精(IVF)的受精率为34%，56%受精卵卵裂至8个细胞或更多细胞。同时，将部分胚胎移植给其中一未排卵的多囊卵巢综合征的病人，获足月妊娠并分娩一正常婴儿。认为，来源于多囊卵巢综合征病人的不成熟卵母细胞也能体外成熟。
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2 影响卵母细胞体外成熟培养的因素
人不成熟卵母细胞IVM培养实验研究中，成熟率和受精率都不理想，胚胎移植后妊娠率则更低。
2.1 IVM成熟率 (1)部分卵母细胞体外培养后未获得完全成熟的能力。有人认为人类未受外源性的促性腺激素刺激的卵母细胞体外成熟率达到30%～50%，而经人绝经期促性腺激素(HMG)/hCG方案诱导排卵而获取的卵母细胞达到MⅡ近90%。推测卵母细胞成熟能力的获得可能与促性腺激素的刺激作用有关，具体机制不详;(2)不成熟卵母细胞在体外环境中退化。有人观察到在自然月经周期的第7～10天收集的不成熟卵母细胞，3/4已出现退化征象，这部分卵母细胞已不能回复到成熟的轨道上来，影响体外成熟率;(3)随着年龄的增长，卵巢中氧自由基逐渐积聚，对处于第一次减数分裂静止期的卵母细胞影响很大，在这段时间内，氧自由基能降低卵母细胞活性，降低不成熟卵母细胞的体外成熟率。
2.2 体外培养成熟的卵母细胞体外受精率低、胚胎发育潜能低
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2.2.1 透明带硬化 以前在啮齿类动物的研究发现，卵子在无血清培养基进行体外成熟易形成透明带硬化，精子的穿透受阻以致受精失败。透明带硬化的原因认为是体外培养过程中放射冠细胞胞外分泌一种蛋白酶催化造成的。Futuin是血清中的一种α胰蛋白酶抑制因子，有与其浓度相关的抑制透明带硬化的作用 [7，8] 。ICSI技术发展后，研究者运用该项技术解决了这个问题。IVM卵母细胞用传统IVM技术的受精率为45%，而采用ICSI技术的受精率为90%。
2.2.2 精原核和卵原核形成不同步 主要是精原核形成落后引起。这与卵母细胞细胞质不完全成熟有关。IVM包括胞质的成熟和胞核的成熟，Smith [9] 等的研究发现，尽管在IVM中，胞核能正常成熟，但明显缺乏胞质的成熟，胞质的成熟包括卵胞浆内微管的发育、膜表面表达精子膜融合蛋白受体、胞质获得使精子染色质解释以及指导受精卵蛋白质合成的能力等，与卵母细胞合成与胞质成熟相关蛋白的能力有关，如中期促进因子。中期促进因子的活性低，周期素和其它控制细胞周期的物质的缺乏将引起卵裂的阻滞。而胞质的不完全成熟也影响了受精卵的进一步卵裂。
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2.3 不能获得足够数量的不成熟卵母细胞而导致可供移植的胚胎数目及质量下降也是一个重要原因 与体内成熟的卵母细胞相比，来源于体外培养成熟的卵母细胞，其胚胎发育相对较差，因此获取一定数量的不成熟卵母细胞对于提高IVM的成功率具有特别重要的意义。研究证实，从PCOS患者获取的不成熟卵母细胞比非PCOS明显增加，目前IVM多以PCOS或多囊卵巢患者为研究对象。至于在获取不成熟卵母细胞前是否需要进行促性腺激素刺激一直存在争议。研究结果显示，小剂量FSH能够有效地提高卵母细胞获取率和受精率。提示在避免引起卵巢过度刺激综合征的同时，小剂量FSH刺激可能有利于形成一批大小比较均匀的卵泡，增加不成熟卵母细胞的获取率，从而为进行下一步的体外成熟提供了比较充足的卵母细胞来源 [10] 。
2.4 ET后妊娠率低 (1)胚胎的发育和子宫内膜的发育不同步。多数学者认为在短期使用少量雌激素准备内膜，可提高妊娠率;(2)随着年龄的增长，配子非整倍体发生率增加和氧自由基的大量积聚，势必影响胚胎的活性，使胚胎在移植子宫后发育阻滞;(3)发生染色体退化的卵母细胞虽具有受精和卵裂的潜能，但形成的胚胎不能着床或虽着床而仅表现为生化妊娠(即β-hCG短暂升高)。当然，导致卵母细胞体外成熟率低、受精率不高、胚胎移植后妊娠率更低的原因还有其它方面，需要进一步深入实验分析。
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3 IVM取卵的方式和时机
IVM发展到现在，收集的不成熟卵母细胞大多是来自窦卵泡。其中的不成熟卵母细胞有GV或MI期。收集这些来自窦卵泡的不成熟卵的方式大致有两种:体内和体外取卵。体内取卵可借助于腹腔镜或经阴道超声引导下进行卵泡穿刺取卵，前者在经阴道超声引导下卵泡穿刺术未发展起来前，一直是IVM获得卵母细胞的主要方法，也可用于IVM收集不成熟卵母细胞，但由于这种方法造成的创伤大，应用受限;经阴道超声卵泡穿刺术为目前使用最广的IVF取卵方式，也可用来作为获取不成熟卵母细胞的方法。但是，用于IVF取卵的穿刺针斜面过大、针尖过长，因此不适于穿刺不成熟的卵泡。Trounson等改进了穿刺针的形状和穿刺的方式，并有效地应用到IVM取卵;体外取卵就是从离体的卵巢标本取卵，以因良性妇科病变而手术切除的卵巢作为标本来源，在体视显微镜下直视取卵，用无菌的穿刺针在体视镜下穿刺卵泡以获得不成熟卵母细胞。该项技术操作简单，易于掌握，已被广泛采用，其取卵的效果并不亚于经阴道超声引导下穿刺取卵。最近，国内有研究报道， 从IVF-ET治疗周期卵泡液中发现了大量窦前卵泡，IVM培养近28天后，成熟率为38.1%，这一方法的建立增加了研究IVM培养卵母细胞的标本来源，是我国科研人员在生殖领域的重大贡献 [11] 。对于在月经周期何时取卵为最佳时间的问题，一直争论不休。有人认为收集的卵母细胞数量与取卵时间无关;但是考虑到卵母细胞成熟率的问题时，部分学者认为卵泡期收集的卵母细胞体外成熟率要高
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于黄体期收集的卵母细胞，故他们趋向于卵泡期取卵。
4 获取卵母细胞临床方案
4.1 不用促卵泡生长激素刺激 月经过少的患者每日肌注黄体酮20mg，或用阴道黄体酮栓300mg，连用10天后停用，待撤退性出血的第3天做B超，以排除卵巢囊肿。在此后监测主导卵泡的大小，一般在月经的第8～12天，即主导卵泡的直径达10～12mm时肌注hCG10000万U。并在当日开始连续口服戊酸雌二醇6mg调节子宫内膜的生长。卵泡直径>4mm的卵泡都进行穿刺，并冲洗3次。在取卵日开始连续肌注黄体酮40mg，或用阴道黄体酮栓300mg进行黄体支持。
4.2 短时间应用促卵泡生长激素刺激 在月经的第2天用FSH300IU，第4天用150IU，在第6天用150IU。不用hCG，第7天经阴道取卵。在月经的第2，6，12天抽静脉血查FSH，LH，E 2，P，并用B超监测子宫内膜。取卵当日开始连续应用戊酸雌二醇6mg和黄体酮40mg准备子宫
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内膜。
4.3 取卵 所有患者均在使用促性腺激素释放激素激动剂后15天或撤退性出血后第5天，采用小剂量FSH进行刺激，FSH的应用时间一般为5～7天，于FSH刺激后5～8天，或于周期的第11～14天取卵，取卵前17h肌注人绒毛膜促性腺激素10000IU，取卵当天最大卵泡直径不超过10mm。于月经后第3天开始用人类尿促性腺激素(HMG)150IU肌肉注射，共4天，发现双侧卵巢有直径8～10mm卵泡8个，直径4～7mm卵泡6个。给予hCG10000IU。34h后取卵。同时，于注射hCG日开始补充β雌二醇2mg/d，于胚胎移植日加用黄体酮60mg/d肌肉注射 [12] 。
5 IVM培养的时间
从理论上推断，体外培养的时间越长，达到MⅡ期的卵子越多。所以有的生殖中心在体外成熟在36h，有的在44h，有的在48h后拆除颗粒细胞进行ICSI。Mikkelsen [13] 发现缩短IVM的培养时间并不会影响胚胎发育的能力，在体外成熟28h和36h的卵子成熟率、受精率、分裂率和妊娠率没有显著差异。体外成熟的时间过长，反而使卵子失去了最佳的受精时机，出现皮质颗粒的过早释放以及透明带硬化。透明带硬化使得卵子受精和囊胚孵出障碍。而过早的剥离卵丘复合体细胞，使卵子与其间的联系中断，也不利于减数分裂的有效进行。即使与卵丘复合体细胞共培养也达不到理想的效果。
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6 IVM的临床意义
6.1 与IVF、ICSI结合治疗某些不孕症 Barens [14] 等将IVM技术与显微授精技术结合治疗不孕症，获得成功。目前，已有越来越多的IVM结合IVF或卵泡浆内单精子注射(ICSI)技术成功地应用于临床的病例报道。迄今，世界上已有约20～30个采用该技术妊娠的正常婴儿分娩。文献报道，利用体外成熟的卵母细胞受精后胚胎移植以治疗卵巢早衰(POF)。同时，利用IVM+IVF+ET技术提供正常胚胎给患有严重的、明显遗传倾向的遗传病人，作为控制某些遗传病传代的设想也早被人们提出。
6.2 避免IVF严重并发症的产生及IVM优势 如多囊卵巢综合征和有排卵并有大量小卵泡发育的不育症病人，对外源性激素刺激异常敏感，易于产生超刺激反应，引起卵巢过度刺激综合征(OHSS);其次，在诱发的卵泡期中，卵泡产生高雌激素水平和在排卵后引发高雌激素水平，对于乳腺癌、卵巢癌和其它一些依赖性激素的癌症(如黑色素瘤)是个潜在危险因素。因此，有的学者提倡用IVM技术取代药物诱导排卵。因为正常妇女月经周期中，约有10～50个卵泡同时发育，如果能在发育早期获得这些不成熟卵母细胞，进行IVM培养，则可避免药物促超排卵引发的上述危险。可以节省用于募集卵泡的药物费用;重新利用常规IVF中收集的不成熟卵;可以作为研究卵子发生减数分裂异常和非整倍体的模型;为冷冻卵子提供了一条出路，因为冷冻GV期卵子可以避开MⅡ期卵子减数分裂纺垂体的易损伤期。
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6.3 供卵 供卵正被提到生殖工程领域的议事日程上来，但临床医师却苦于供卵来源缺乏。IVM技术解决了这一难题。因良性妇科疾病(如子宫内膜异位症、纤维瘤、子宫肌瘤、宫外孕等)而切除的卵巢组织或因罹患重症疾病如癌症需使用细胞毒药物的年轻未生育女性病人的卵巢组织，均可用作IVF的供卵来源。如果IVM技术和卵母细胞冷冻技术结合则可建立一个和精子库相应的卵子库。
IVM的前景为生殖医学家们所看好。虽然IVM技术还不成熟，还存在诸多的问题，但经过不懈努力必将成为生殖工程领域中一项新兴的技术。它有助于深入了解卵母细胞发育动力学，拓宽了治疗不孕症的思路。
参考文献
1 Pincus G，Enzmann EV.The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro.The activation of ovarian eggs.J Exp Med，1935，62:665.
, http://www.100md.com
2 Newton H，Illingworth P.In vitro growth of murine preantral follicles afˉter isolation from cryopreserved overian tissue.Hum Reprod，2001，16(3):423-429.
3 Veek LL，Wortham JW，Witmyer J，et al.Maturation and fertilization of morphologically immature human oocyts in a program of in vitro fertilizaˉtion.FertiSteril，1983，39:594.
4 Cha KY，KooJJ，Choi DH，et al.Pregnance after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles:their culˉture in vitro and their transfer in a donor oocyte program.Fertil Steril，1991，55:100.
, 百拇医药
5 Wynn P，Picton HM，Krapez JA，et al.Pretreatment with follicle stimuˉlating hormone promotes the numbers of human oocytes reaching metaphaseⅡby in vitromaturation.Hum Reprod，1998，13(11):3132-3138.
6 Trounson A，Wood C，Kausche A.In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polyˉcystic ovarian patients.Fertil Steril，1994，62:353.
7 Mikkelsen AL，Smith S，Lindenberg S.Possible factors affecting the deˉvelopment of oocytes in in-vitromaturation.Hum Reprod，2000，15:5.
, 百拇医药
8 Barnes FL，Wook CW，Kausche A，et al.Production of embryos from in vitro-maturated primary human oocytes.Fertil Steril，1996，65:1151-1251.
9 Smith GD.In vitro maturation of oocytes.Curr Womens Health Rep，2001，1(12):143-151.
10 Suikkari AM，Tulppala M，Tuuri T，et al.Lutea phase starto flow dose FSH priming of follicles results in an efficient recovery maturation and fertilization of immature human oocytes.Hum Reprod，2000，15(4):747.
, http://www.100md.com
11 Wu J，Zhang L Z，Lin P.A new source of human oocyte:preliminary reˉport on the identification and maturation of human preantral follicle from follicular aspirates.Hum Reprod，1998，13:1638.
12 李媛，陈子江.未成熟卵母细胞体外成熟后体外授精-胚胎移植成功分娩1例.中华男科学，2002，2:70-71.
13 Zheng P，wang H，Bavister BD，et al.Maturation of rhesus monkey oocytes in chemically defined culture media and their functional assessˉment by IVF and embryo development.Hum Reprod，2001，16(2):300-305.
14 Eose Hellekant TA，Libersky Williamson EA，Bavister BD，et al.Enerˉgy substrates and amino acids provided during in vitro maturation of bovine oocytes alter acquisition of developmental competence.Zygote，1998，6(4):285-294.
(收稿日期:2003-06-12)
(编辑 小川), 百拇医药(李蓉 汤惠茹 蔡志明)