电化学发光免疫分析法定量测定乙肝表面抗原的初步评价
【摘要】 目的 评价电化学发光免疫分析法(ECLIA)定量测定HBsAg的结果。方法 采用ECLIA夹心法定量测定81份受检者血清HBsAg含量。结果 HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式
HBsAg测定量在原标本中低于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05)，在4倍稀释的标本中高于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05);而HBsAg(+)/HBcAb(+)模式与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式比较，HBsAg测定量差异无显著性(P>0.05);同一模式标本稀释后和稀释前相比，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定量明显升高(P<0.01)，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBcAb(+)2组模式HBsAg测定量明显降低(P<0.01)。结论 ECLIA夹心法定量测定HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg存在HD-HOOK效应，造成“假低值”，需稀释后进一步测定。关键词 乙肝病毒表面抗原 ECLIA 评价 假低值
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)06-0487-02
Preliminary evaluation on quantitative analysis of hepatitis
B surface antigen by electrochemiluminescence immunoassay
Zhu Pingan，Guo Yiming，Xu Hanping，et al.
Pepartment of Laboratory The people’s Hospital of Shenzhen Yantian，Guangdong Shenzhen518081.
【Abstract】 Objective To evaluate the quantitative analysis of hepatitis B surface antigen(HBsAg)by elecˉtrochemiluminescence immunoassay(ECLIA).Methods HBsAg were determined in81patients by means of electroˉchemiluminescence immunoassay.Results Compared with HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)patten，HBsAg level of primary specimens were found singnificantly lower in HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、and HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)patterns(P<0.05)，and HBsAg level of diˉlute specimens were found obviously
, 百拇医药
higher(P<0.05).No significant differences were observed in HBsAg(+)/HBˉcAb(+)pattern(P>0.05).Compared with HBsAg level of primary specimens，HBsAg level of dilute specimens were found singnificantly higher in HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、and HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)(P<0.01).Conclusion In ECLIA，high does(HD)-hook effect results in less reactivity，and false-low values or false-negative results.In order to avoid the experimental misdiagˉnosis，the importance of the sample dilution is emphasized.
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Key words hepatitis B virus surface antigen ECLIA evaluation false-low values
乙肝病毒(HBV)感染呈世界性分布，给人类的健康带来了极大危害。乙肝病毒表面抗原(HBsAg)作为乙肝病毒感染的最主要病原标志和直接证据之一。临床上常检测HBsAg来判断是否HBV感染，监测急性或慢性乙型肝炎病毒复制状态和评价抗病毒治疗效果，以及用于产前检查，预防HBV传播。鉴于目前部分医院采用电化学发光免疫分析法测定HBsAg来判断HBV水平，我们对81份HBsAg阳性的受检者血清进行HBsAg测定，观察各血清学模式HBˉsAg测定情况，评价该方法的测定结果。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 81份HBsAg阳性的受检者血清全部来源于我院门诊或病房患者，根据2000年第十次全国病毒性肝炎学术会议的标准 [1] ，均符合现症HBV感染的诊断，其中HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式21份、HBsAg(+)/HBeAg(+)模式15份、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式12份、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式22
, 百拇医药
份、HBsAg(+)/HBcAb(+)模式11份。
1.1.2 稀释用血清 收集乙肝5项标志物全部阴性且肝功能正常的健康体检者混合血清50
ml，测定HBsAg为0.398COI。
1.1.3 主要仪器 Wellscan Mk2酶标仪;Elecsys2010全自动免疫分析仪。
1.1.4 主要试剂 乙肝5项标准检测试剂盒购自洛阳华美生物工程公司。HBsAg定量试剂盒为瑞士罗士(Roche)公司产品。1μg/L、2μg/L和5μg/L HBsAg定值参比血清由卫生部临检中心提供。
1.2 方法
1.2.1 乙肝5项标志物的检测 方法按试剂盒说明书进行，并用HBsAg定值参比血清作质量控制。
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1.2.2 HBsAg定量检测 操作按仪器说明书进行，试验采用夹心免疫法(Sandwich principle):(1)将待测标本与生物素标记的单克隆抗体、三氯联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ 标记单克隆抗体、链酶亲和素标记磁性微粒加入到反应杯中共同温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。(2)将上述复合物吸入流动室，同时用电子供体三丙胺(TPA)缓冲液冲洗。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下的磁铁吸引住，而游离的发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ 和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。(3)结果及阴阳性判断:测定结果以COI(COI=cutoff inˉdex)表示，根据COI可判断阴阳性，当COI<1.0时为阴性，COI>1.0时为阳性。必要时，做中和确定试验进行确证。
1.2.3 样本稀释与HBsAg测定 将HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb、HBsAg(+)/HBsAb(+)5种模式血清用自制稀用血清(COI=0.398)分别稀释4倍后，按上述方法定量测定HBsAg。
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1.3 资料分析和统计 采用t检验。
2 结果
2.1 原倍标本HBsAg测定量的比较 见表1，与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式HBsAg测定量比较，HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式t值分别为-2.697、-2.764、-3.792，P<0.05，差异有显著性;HBsAg(+)/HBcAb(+)模式t值为0.243，P>0.05，差异无显著性。
2.2 稀释标本HBsAg测定量的比较 见表1，标本稀释4倍后，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定量与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBˉcAb(+)模式比较，t值分别为6.518、4.619、4.439，P<0.05，差异有显著性;HBsAg(+)/HBcAb(+)模式t值为0.807，P>0.05，差异无
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显著性。
2.3 同一模式标本稀释前后HBsAg测定量的比较 见表1，上述5种模式标本稀释前后HBsAg测定量比较，t值分别为-14.52、3.52、-6.32，6.05、4.55，P<0.01，差异有显著性。
表1 标本稀释前后HBsAg测定量及差值 (略)
3 讨论
目前检测乙肝表面抗原方法有血凝试验、胶体金标记法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫法、电化学发光免疫分析法(ECLIA)等。电化学发光免疫分析法具有免疫学反应的特异性、发光作用的灵敏性、精密高和准确度好等优点，使测定结果稳定、线性范围宽、测定速度快，为准确测定乙肝表面抗原提供了可能。由于乙肝病毒感染后存在不同的血清学模式，各种模式病毒水平不完全相同 [2] ，电化学发光免疫分析夹心法测定的HBsAg是否真实地反映各种模式乙肝病毒量，目前尚未见报道。本研究发现，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式原标本HBsAg测定值低于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式;将原标本稀释4倍后，其HBsAg测定量反而高于HBˉsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式。同一模式稀释前后HBsAg测定量比较，稀释后，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定值显著性增高，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBcAb (+)二组模式HBsAg测定值明显降低。由此可见，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式原标本HBsAg测定值并不是最高水平，需进一步测定。出现这种现象可能原因是:在固相法试验过程中，待测抗原的总量过高，竞争结合反应系统中的限量标记二抗，从而产生抗原越多、最终反应信号越低的HD-HOOK效应，导致HBsAg“假低值” [3] 。克服HD-HOOK效应，主要依靠试剂盒的生产厂家。作为应用者，可用稀释测定法解决这一问题。但是上述三种模式以及其它模式最佳稀释度如何，目前正在研究之中。
, 百拇医药
参考文献
1 全国肝炎防治协作组.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19:56-62.
2 程钢，何蕴韶，周新宇.荧光定量聚合酶联反应检测乙型肝炎病毒.中华医学检验杂志，1999，22:135-138.
3 曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策.中国实验临床免疫学杂志，1998，10(3):60-64.
作者单位:518081深圳市盐田区人民医院检验科
(收稿日期:2003-09-16)
(编辑 夫凡), http://www.100md.com(朱平安 郭奕明 徐汉平 祝玲玲 谭萍 施培瑶 赵毅 陈丕绩)
HBsAg测定量在原标本中低于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05)，在4倍稀释的标本中高于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05);而HBsAg(+)/HBcAb(+)模式与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式比较，HBsAg测定量差异无显著性(P>0.05);同一模式标本稀释后和稀释前相比，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定量明显升高(P<0.01)，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBcAb(+)2组模式HBsAg测定量明显降低(P<0.01)。结论 ECLIA夹心法定量测定HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg存在HD-HOOK效应，造成“假低值”，需稀释后进一步测定。关键词 乙肝病毒表面抗原 ECLIA 评价 假低值
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)06-0487-02
Preliminary evaluation on quantitative analysis of hepatitis
B surface antigen by electrochemiluminescence immunoassay
Zhu Pingan，Guo Yiming，Xu Hanping，et al.
Pepartment of Laboratory The people’s Hospital of Shenzhen Yantian，Guangdong Shenzhen518081.
【Abstract】 Objective To evaluate the quantitative analysis of hepatitis B surface antigen(HBsAg)by elecˉtrochemiluminescence immunoassay(ECLIA).Methods HBsAg were determined in81patients by means of electroˉchemiluminescence immunoassay.Results Compared with HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)patten，HBsAg level of primary specimens were found singnificantly lower in HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、and HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)patterns(P<0.05)，and HBsAg level of diˉlute specimens were found obviously
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higher(P<0.05).No significant differences were observed in HBsAg(+)/HBˉcAb(+)pattern(P>0.05).Compared with HBsAg level of primary specimens，HBsAg level of dilute specimens were found singnificantly higher in HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、and HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)(P<0.01).Conclusion In ECLIA，high does(HD)-hook effect results in less reactivity，and false-low values or false-negative results.In order to avoid the experimental misdiagˉnosis，the importance of the sample dilution is emphasized.
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Key words hepatitis B virus surface antigen ECLIA evaluation false-low values
乙肝病毒(HBV)感染呈世界性分布，给人类的健康带来了极大危害。乙肝病毒表面抗原(HBsAg)作为乙肝病毒感染的最主要病原标志和直接证据之一。临床上常检测HBsAg来判断是否HBV感染，监测急性或慢性乙型肝炎病毒复制状态和评价抗病毒治疗效果，以及用于产前检查，预防HBV传播。鉴于目前部分医院采用电化学发光免疫分析法测定HBsAg来判断HBV水平，我们对81份HBsAg阳性的受检者血清进行HBsAg测定，观察各血清学模式HBˉsAg测定情况，评价该方法的测定结果。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 81份HBsAg阳性的受检者血清全部来源于我院门诊或病房患者，根据2000年第十次全国病毒性肝炎学术会议的标准 [1] ，均符合现症HBV感染的诊断，其中HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式21份、HBsAg(+)/HBeAg(+)模式15份、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式12份、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式22
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份、HBsAg(+)/HBcAb(+)模式11份。
1.1.2 稀释用血清 收集乙肝5项标志物全部阴性且肝功能正常的健康体检者混合血清50
ml，测定HBsAg为0.398COI。
1.1.3 主要仪器 Wellscan Mk2酶标仪;Elecsys2010全自动免疫分析仪。
1.1.4 主要试剂 乙肝5项标准检测试剂盒购自洛阳华美生物工程公司。HBsAg定量试剂盒为瑞士罗士(Roche)公司产品。1μg/L、2μg/L和5μg/L HBsAg定值参比血清由卫生部临检中心提供。
1.2 方法
1.2.1 乙肝5项标志物的检测 方法按试剂盒说明书进行，并用HBsAg定值参比血清作质量控制。
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1.2.2 HBsAg定量检测 操作按仪器说明书进行，试验采用夹心免疫法(Sandwich principle):(1)将待测标本与生物素标记的单克隆抗体、三氯联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ 标记单克隆抗体、链酶亲和素标记磁性微粒加入到反应杯中共同温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。(2)将上述复合物吸入流动室，同时用电子供体三丙胺(TPA)缓冲液冲洗。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下的磁铁吸引住，而游离的发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ 和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。(3)结果及阴阳性判断:测定结果以COI(COI=cutoff inˉdex)表示，根据COI可判断阴阳性，当COI<1.0时为阴性，COI>1.0时为阳性。必要时，做中和确定试验进行确证。
1.2.3 样本稀释与HBsAg测定 将HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb、HBsAg(+)/HBsAb(+)5种模式血清用自制稀用血清(COI=0.398)分别稀释4倍后，按上述方法定量测定HBsAg。
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1.3 资料分析和统计 采用t检验。
2 结果
2.1 原倍标本HBsAg测定量的比较 见表1，与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式HBsAg测定量比较，HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式t值分别为-2.697、-2.764、-3.792，P<0.05，差异有显著性;HBsAg(+)/HBcAb(+)模式t值为0.243，P>0.05，差异无显著性。
2.2 稀释标本HBsAg测定量的比较 见表1，标本稀释4倍后，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定量与HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBˉcAb(+)模式比较，t值分别为6.518、4.619、4.439，P<0.05，差异有显著性;HBsAg(+)/HBcAb(+)模式t值为0.807，P>0.05，差异无
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显著性。
2.3 同一模式标本稀释前后HBsAg测定量的比较 见表1，上述5种模式标本稀释前后HBsAg测定量比较，t值分别为-14.52、3.52、-6.32，6.05、4.55，P<0.01，差异有显著性。
表1 标本稀释前后HBsAg测定量及差值 (略)
3 讨论
目前检测乙肝表面抗原方法有血凝试验、胶体金标记法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫法、电化学发光免疫分析法(ECLIA)等。电化学发光免疫分析法具有免疫学反应的特异性、发光作用的灵敏性、精密高和准确度好等优点，使测定结果稳定、线性范围宽、测定速度快，为准确测定乙肝表面抗原提供了可能。由于乙肝病毒感染后存在不同的血清学模式，各种模式病毒水平不完全相同 [2] ，电化学发光免疫分析夹心法测定的HBsAg是否真实地反映各种模式乙肝病毒量，目前尚未见报道。本研究发现，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式原标本HBsAg测定值低于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式;将原标本稀释4倍后，其HBsAg测定量反而高于HBˉsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式。同一模式稀释前后HBsAg测定量比较，稀释后，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式HBsAg测定值显著性增高，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBcAb (+)二组模式HBsAg测定值明显降低。由此可见，HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAg(+)、HBˉsAg(+)/HBeAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)3组模式原标本HBsAg测定值并不是最高水平，需进一步测定。出现这种现象可能原因是:在固相法试验过程中，待测抗原的总量过高，竞争结合反应系统中的限量标记二抗，从而产生抗原越多、最终反应信号越低的HD-HOOK效应，导致HBsAg“假低值” [3] 。克服HD-HOOK效应，主要依靠试剂盒的生产厂家。作为应用者，可用稀释测定法解决这一问题。但是上述三种模式以及其它模式最佳稀释度如何，目前正在研究之中。
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参考文献
1 全国肝炎防治协作组.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19:56-62.
2 程钢，何蕴韶，周新宇.荧光定量聚合酶联反应检测乙型肝炎病毒.中华医学检验杂志，1999，22:135-138.
3 曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策.中国实验临床免疫学杂志，1998，10(3):60-64.
作者单位:518081深圳市盐田区人民医院检验科
(收稿日期:2003-09-16)
(编辑 夫凡), http://www.100md.com(朱平安 郭奕明 徐汉平 祝玲玲 谭萍 施培瑶 赵毅 陈丕绩)